Aquí proporcionamos un protocolo detallado para un modelo de administración oral con larvas de Galleria mellonella y cómo caracterizar inducido la respuesta inmune innata. Mediante este protocolo, investigadores sin experiencia práctica será capaces de usar la g. mellonella forzada método.
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Artículo de método
Un modelo de administración Oral de Galleria mellonella para la respuesta inmune innata Study Commensal-Induced
En este artículo
Resumen
Resumen
La investigación del potencial inmunogénico de bacterias comensales en el sistema inmune de host es un componente esencial al estudiar las interacciones huésped-microbio intestinal. Está bien establecido que diversos comensales exhiben un potencial diferente para estimular el sistema inmune intestinal del host. Estas investigaciones involucran animales vertebrados, especialmente roedores. Puesto que cada vez más preocupaciones éticas están relacionadas con experimentos con vertebrados, hay una alta demanda para los modelos invertebrados reemplazos.
Aquí, ofrecemos un modelo de la administración oral de Galleria mellonella con bacterias no patógenas comensales y la posible evaluación del potencial inmunogénico de comensales en el sistema inmunológico de g. mellonella . Demostrar que g. mellonella es un modelo de reemplazo invertebrados alternativa útil que permite el análisis de comensales con diferente potencial inmunogénico como Bacteroides vulgatus y Escherichia coli. Curiosamente, las bacterias no exhiben ningún efecto de matar a las larvas, que es similar a los mamíferos. Las respuestas inmunes de g. mellonella eran comparables con vertebrados la respuesta inmune innata e implican el reconocimiento de las bacterias y la producción de moléculas antimicrobianas. Proponemos que g. mellonella fue capaz de restablecer el anterior equilibrio de la microbiota, que es bien conocido de individuos mamíferos sanos. Aunque proporcionando comparable respuesta inmune innata en g. mellonella y vertebrados, g. mellonella no albergan un sistema inmune adaptante. Puesto que los componentes investigados del sistema inmune innato son evolutivos conservado, el modelo permite un preselección y primer análisis de propiedades inmunogénicas bacterianas.
Introducción
El microbioma intestinal es un componente esencial para el mantenimiento de la homeostasis e involucra tanto las respuestas inmunes innata y adaptativa1,2. La comunidad de la microbiota comensal se caracteriza por diferentes componentes comensales: simbiontes que confieren efectos beneficiosos por funciones inmunomoduladoras importantes y pathobionts que puede tener efectos perjudiciales genéticamente predispuestos acoge y promover y provocar inflamación intestinal3,4. Muchos estudios de simbiontes y pathobionts y su influencia en el sistema de inmune ....
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Protocolo
1. cría de g. mellonella y preparación de las larvas de los experimentos
Nota: El ciclo de huevo al último estadio la larva tarda aproximadamente 5-6 semanas.
- La transferencia de los huevos de la polilla adulta a las cajas de 2 L que contiene sustrato de polilla de la cera (grits de maíz 22%, 22% harina de trigo, cera de 17,5%, 11% leche desnatada en polvo, miel de 11%, 11% glicerol, levadura secadas de 5,5%). Realizar toda la cría a 30 ° C en la oscuridad.
- Transferir 25 g del sustrato que contiene las larvas en sustrato fresco después de aproximadamente 1-2 semanas cuando se veían pequeñas y diminutas larvas. S....
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Resultados
El modelo de infección de g. mellonella hemolinfa en ampliamente utilizado para analizar los factores de virulencia de una gran variedad de patógenos. La mayoría las medidas incluyen el análisis de la mortalidad de las larvas, que es un método muy fácil. Sin embargo, este método no permite conclusiones sobre las respuestas inmunes en general y vincular los resultados de las respuestas inmunitarias de g. mellonella con mecanismos inmunes vertebrados. El modelo de la admin.......
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Discusión
El modelo de g. mellonella es un modelo frecuentemente utilizado para evaluar los factores de la virulencia bacteriana en una infección sistémica enfoque21. Puesto que muchos agentes patógenos y bacterias entran al host vía oral infección o colonización, nuevos conocimientos hay que encontrar para evaluar g. mellonella como un modelo de colonización oral y la infección.
La posibilidad de posterior g. mellonella entre 15 y 37 ° C es una gran ve.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el DFG (SPP1656), el grupo de entrenamiento de investigación DFG 1708, el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) y el centro alemán de investigación de la infección (DZIF).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| escalera de ADN de 100 pb | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-bromo-3-cloropropano (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| tubos de 2 | mL Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| tubos de 50 mL Greiner | Bio-One | 210 261 | |
| Agarosa | Biozym | 840004 | |
| Cera de abejas | Mixed-Store.de | - | |
| infusión de corazón para el cerebro | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Vector de clonación para fragmentos de 16S |
| Sémola de maíz | Ostermü hle Naturkost GmbH | 306 | Cultivo ecológico |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| Kit de eliminación de ADN sin ADN | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Digestión de dnasa |
| Levadura seca | Rapunzel | - | Cultivo orgánico |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Etanol | VWR | 20821.330 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Miel | Ostermü hle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, blanco | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Bomba de microjeringa manual con pantalla digital | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 jeringa de insulina 0,3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Mortero de administración oral |
| , sin esmaltar | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Agua sin nucleasas | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| sobres Oxoid AnaeroGen | Thermo Fisher Scientific AN0025A | Calidad y cantidad de | |
| las rayas de ARN PCR | Biozym | 710970 | |
| Majle, superficie de molienda sin esmaltar | VWR | 410-9324 | |
| Enzima de corrección de Phusion | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR para la medición del número de copias bacterianas |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 qRT-PCR para mediciones de expresión génica | |
| Kit de transcripción inversa QuantiTect | Qiagen | 205311 | síntesis de ADNc |
| Tubos de ensayo Qubit | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Cuantificación de muestras de plásmidos y ADNc |
| Fluorímetro Qubit | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Cuantificación de muestras de plásmidos y ADNc |
| RNasa-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Inhibidor de la ribonucleasa | Promega | N2511 | |
| Leche desnatada en polvo | Sucofin | - | |
| SYBR seguro DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reactivo | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Barco de pesaje | VWR | 10803-148 | |
| Harina de trigo | Ostermü hle Naturkost GmbH | 6462 | Cultivo ecológico |
Referencias
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G.
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Reimpresiones y permisos
