Artículo de método

Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

DOI:

10.3791/59273

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25 de agosto de 2019

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1Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, introducimos un método de secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) con las ventajas de un tiempo de respuesta corto, bajo costo y alto rendimiento.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El aneuploidía cromosómico, una de las principales causas que conducen a la detención del desarrollo embrionario, el fracaso de la implantación o la pérdida del embarazo, ha sido bien documentado en embriones humanos. Las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) son una prueba genética que mejora significativamente los resultados reproductivos mediante la detección de anomalías cromosómicas de embriones. La secuenciación de próxima generación (NGS) proporciona un enfoque de alto rendimiento y rentable para el análisis genético y ha demostrado aplicabilidad clínica en PGT-A. Aquí, presentamos un método NGS basado en secuenciación de semiconductores rápido y de bajo costo para el cribado de la aneuploidía en embriones. El primer paso del flujo de trabajo es la amplificación completa del genoma (WGA) del espécimen embrionario biopsiado, seguido de la construcción de la biblioteca de secuenciación, y la secuenciación posterior en el sistema de secuenciación de semiconductores. Generalmente, para una aplicación PGT-A, se pueden cargar y secuenciar 24 muestras en cada chip generando 60 a 80 millones de lecturas con una longitud de lectura promedio de 150 pares base. El método proporciona un protocolo refinado para realizar la amplificación de plantillas y el enriquecimiento de la biblioteca de secuenciación, haciendo que la detección PGT-A sea reproducible, de alto rendimiento, rentable y de ahorro de tiempo. El tiempo de funcionamiento de este secuenciador de semiconductores es de sólo 2 a 4 horas, lo que acorta el tiempo de respuesta desde la recepción de muestras hasta la emisión de informes en 5 días. Todas estas ventajas hacen de este ensayo un método ideal para detectar aneuploidias cromosómicas de embriones y así, facilitar su amplia aplicación en PGT-A.

Introducción

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La elección de embriones viables de buena calidad con números normales de copia cromosómica (euploide) para la transferencia en reproducción asistida ayuda a mejorar los resultados del embarazo. Tradicionalmente, el sistema de clasificación morfológica bien establecido es ampliamente utilizado para la evaluación de embriones debido a su fácil disponibilidad y naturaleza no invasiva. Sin embargo, se ha demostrado que la evaluación morfológica sólo puede proporcionar información limitada sobre la calidad del embrión1 y el potencial de implantación2. Una razón fundamental es su incapacidad para evaluar la composición cromosómica de los embriones.

La aneuploidía cromosómica (número anormal de cromosomas) es una de las principales causas que conducen a la detención del desarrollo embrionario, el fallo de implantación o la pérdida del embarazo. La aparición de aneuploidía ha sido bien documentada en embriones humanos, representando entre el 60% y el 70% en embriones en etapa de escisión3,4 y 50%-60% en blastocistos5. Esto, en cierta medida, ha contribuido al cuello de botella en la mejora de la tasa de embarazo del tratamiento de fertilización in vitro (FIV), que se ha mantenido en torno al 35%-40%6,7. Por lo tanto, se cree que la selección de embriones euploides para la transferencia es beneficioso para mejorar los resultados del embarazo. Con este fin, se han desarrollado más a fondo pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) para investigar la viabilidad de los embriones mediante enfoques genéticos. Cada vez hay más ensayos controlados aleatorios y estudios de cohortes que apoyan el papel crucial de la PGT-A. Se ha demostrado que la aplicación de PGT-A disminuye la tasa de abortoespontáneo y aumenta la tasa de embarazo clínico y la tasa de implantación 8, la tasa de embarazo en curso y la tasa de nacimientos vivos9.

Históricamente, se han aplicado diferentes métodos en PGT-A, como la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), la hibridación genómica comparativa (CGH), la matriz-CGH y el polimorfismo nucleótido único (SNP)-microarray. Estudios anteriores han indicado que PGT-A para embriones en etapa de escisión por FISH produce resultados que son poco consistentes con los obtenidos por cribado cromosómico integral (CCS) de los blastocistos correspondientes utilizando 59273array-CGH o SNP-microarray5927310. Estas discrepancias pueden atribuirse al mosaico cromosómico, a los artefactos técnicos FISH o a la autocorrección embrionaria de los errores de segregación cromosómica durante el desarrollo11. Se ha reconocido ampliamente que el uso de biopsias de tropoctodem (TE) de blastoctodermo (TE) para PGT-A basado en matrices, como la matriz-CGH o el microarray SNP, es eficaz para identificar el desequilibrio cromosómico en embriones10,12. Recientemente, la secuenciación de próxima generación de una sola célula (NGS) proporciona un enfoque de alto rendimiento y rentable para el análisis genético y ha demostrado aplicabilidad clínica en PGT-A13,14,15, lo que la convierte en un alternativa prometedora a los métodos actualmente disponibles.

Aquí, presentamos un método NGS basado en secuenciación de semiconductores rápido, robusto y de bajo costo para el cribado de la aneuploidía en embriones humanos. El primer paso del flujo de trabajo es la amplificación del genoma completo (WGA) de la muestra de embrión biopsiado, utilizando un kit WGA de una sola célula, seguido de la construcción de la biblioteca de secuenciación, y la secuenciación posterior en el sistema de secuenciación de semiconductores.

Mediante la detección de los iones H+ que se liberan de cada incorporación de trifosfato de desoxirribonucleósido durante la síntesis de la cadena de ADN, el sistema transfiere las señales químicas (cambio de pH) capturadas por los elementos semiconductores a datos digitales directos , que se interpretan más detalladamente en la información de la secuencia de ADN. Eliminando el requisito de detección óptica costosa y reacciones de secuenciación complejas, esta química de secuenciación simple reduce el costo total del reactivo y acorta el tiempo de funcionamiento de la secuenciación en 2 x 4 horas16. Más importante aún, sobre la base de las especificaciones de rendimiento del fabricante, la plataforma de secuenciación de semiconductores puede generar hasta 15 GB de datos de secuenciación (depende de la calidad de la biblioteca) por carrera, que es significativamente mayor que algunos de los otros secuenciadores produciendo sólo alrededor de 3 x 4 GB de datos (con 2 x 75 bp de longitud de lectura)17. En las aplicaciones clínicas de PGT-A, esta plataforma puede lograr 24 muestras por chip generando hasta 80 millones de lecturas17 y al menos un millón de lecturas únicas de cada muestra. La profundidad de lectura puede garantizar que cada muestra tenga al menos una cobertura completa del genoma de 0,05 x. Las ventajas anteriores de esta plataforma la convierten en un método de cribado ideal y, por lo tanto, facilitan sus amplias aplicaciones en PGT-A18.

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Protocolo

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La aprobación ética fue otorgada por el Comité de ética de la investigación clínica del clúster este de la Universidad China Conjunta de Hong Kong-New Territories (Número de referencia: 2010.432). La licencia de investigación fue aprobada por el Consejo de Tecnología de Reproducción Humana de Hong Kong (Número R3004).

1. Amplificación completa del genoma

  1. Antes de empezar, compruebe el volumen de perlas magnéticas (Tablade Materiales)para asegurarse de que no haya menos de 135 ml (con un 20% de exceso) para cada muestra. Conservar las perlas magnéticas a temperatura ambiente (RT) durante al menos 30 min. Preparar 720 ml (con un 20% de exceso) de etanol del 70% para cada muestra. Equipar un ciclor térmico (Mesade Materiales)con tapa calentada a 105oC.
    NOTA: El etanol del 70% (Tablade Materiales)recién preparado debe utilizarse en un plazo de 3 días.
  2. Preparación de muestras
    NOTA: En la práctica de rutina, 5 a 10 células de trophectoderm del blastocisto se biopsian de acuerdo con la directriz de práctica19.
    1. Suspenda las biopsias en 2 l de solución salina tamponada con fosfato de 1x (PBS) en un único tubo de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 0,2 ml.
    2. Gire brevemente el tubo en una mini centrífuga durante 3 s para recoger las gotas.
  3. Lisis celular y extracción
    1. Descongelar el tampón de extracción de células (Tablade materiales)y el tampón de dilución de enzimas de extracción (Tablade materiales)sobre hielo, vórtice y girar brevemente en una mini centrífuga durante 3 s antes de su uso.
    2. Agregue 3 l de tampón de extracción de celdas a cada tubo a partir del paso 1.2.2.
    3. Preparar una mezcla maestra de lisis celular de 5 ml para cada muestra añadiendo 4,8 ml de tampón de dilución enzimática de extracción y enzima de extracción de células de 0,2 l (Tablade materiales). Mezclar bien y alícuota en cada tubo del paso 1.3.2. Voltear el tubo suavemente y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s.
      NOTA: las puntas no deben tocar el líquido que contiene las muestras de celda al agregar la mezcla maestra.
    4. Incubar el tubo del paso 1.3.3 en el ciclor térmico con tapa calentada. Ejecute el programa con los siguientes ajustes: 10 min a 75 oC, 4 min a 95 oC, mantenga a 4 oC.
  4. Preamplificación
    1. Descongelar el búfer de preamplificación (Tablade materiales)sobre hielo, vórtice y girar brevemente en una mini centrífuga durante 3 s antes de su uso.
    2. Preparar una mezcla maestra de preamplificación de 5 l para cada muestra añadiendo 4,8 s de tampón de preamplificación y 0,2 ml de enzima de preamplificación (Tablade materiales). Mezclar bien y alícuota en cada tubo del paso 1.3.4. Voltear el tubo suavemente y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s.
      NOTA: Las puntas no deben tocar el líquido que contiene las muestras de ADN al agregar la mezcla maestra.
    3. Incubar el tubo en el ciclor térmico con tapa calentada. Ejecute el programa con los ajustes de flujo: 2 min a 95 oC; 12 ciclos para 15 s a 95oC, 50 s a 15oC, 40 s a 25oC, 30 s a 35oC, 40 s a 65oC, 40 s a 75oC; mantener a 4 oC.
  5. Amplificación
    1. Descongelar el búfer de amplificación (Tablade materiales)sobre hielo, vórtice y girar brevemente en una mini centrífuga durante 3 s antes de su uso.
    2. Preparar una mezcla maestra de amplificación de 60 l para cada muestra añadiendo 25 ml de tampón de amplificación, 0,8 l de enzima de amplificación (Tablade materiales)y 34,2 l de agua libre de nucleasas para WGA (Tablade materiales). Mezclar bien y alícuota en cada tubo del paso 1.4.3. Voltear el tubo suavemente y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s.
    3. Incubar el tubo en el ciclor térmico con tapa calentada. Ejecute el programa con los siguientes ajustes: 2 min a 95 oC; 14 ciclos para 15 s a 95oC, 1 min a 65oC, 1 min a 75oC; mantener a 4 oC.
  6. Purificación de el Productos WGA
    1. Transfiera cada producto WGA del paso 1.5.3 a nuevos tubos de 1,5 ml. Añadir 112,5 l de perlas magnéticas en cada tubo. Vórtice e incubar a RT durante 5 min.
      NOTA: Mezcle completamente las perlas magnéticas antes de usarlas.
    2. Coloque los tubos en un soporte magnético (Tablade Materiales)durante 3 min hasta que el sobrenadante esté despejado. Deseche todo el sobrenadante sin molestar las cuentas.
    3. Añadir 300 s de 70% de etanol a cada tubo. Gire cada tubo 180o para dejar que las perlas corren a través del etanol y gire de nuevo a la posición original. Deseche todo el sobrenadante después de que las cuentas se hayan asentado sin molestar a las cuentas. Repita este paso una vez.
      NOTA: Mantenga el tubo en el soporte magnético mientras gira el tubo horizontalmente.
    4. Gire brevemente cada tubo en una mini centrífuga durante 3 s. Coloque los tubos en el soporte magnético hasta que el sobrenadante residual esté despejado. Deseche todo el sobrenadante residual sin perturbar las cuentas. Seque al aire las perlas en RT durante aproximadamente 3 minutos.
    5. Retire los tubos del soporte magnético y vuelva a suspender las perlas secas añadiendo 35 ml de tampón tris-EDTA bajo (TE) (Tablade materiales). Incubar a RT durante 5 min.
    6. Coloque los tubos en el soporte magnético durante 3 minutos hasta que el sobrenadante esté despejado. Transfiera todo el sobrenadante que contiene ADN eludado a nuevos tubos de 1,5 ml sin alterar las perlas.

2. Control de calidad de los productos WGA

  1. Cuantifique cada producto WGA purificado del paso 1.6.6 mediante un ensayo de fluorómetro (Tablade materiales)de acuerdo con el manual del fabricante utilizando 1 l de producto WGA como material de partida.
    NOTA: La concentración aceptada del producto WGA es de 10 ng/L. No se recomienda ningún producto por debajo de este umbral para continuar con los pasos siguientes.

3. Fragmentación de los productos WGA

  1. Antes de empezar, precaliente un calentador de bloque seco a 37 oC. Preparar 6 l (con un 20% de exceso) de 0,5 M DE EDTA para cada muestra. Sobre la base de la concentración, la alícuota 300 ng de ADN de cada producto WGA purificado en el paso 1.6.6 a los nuevos tubos PCR de 0,2 ml y llevar el volumen a 16 l con agua libre de nucleasas para cada tubo.
  2. Fragmentación
    1. Preparar una mezcla de reacción de fragmentación de ADN de doble cadena (dsDNA) de 4 l para cada muestra añadiendo 2 ml de búfer de reacción de fragmentación dsDNA (Tablade materiales)y 2 l de enzimas de fragmentación dsDNA (Tablade materiales). Mezclar bien y alícuota en cada tubo del paso 3.1. Vortex y girar brevemente sobre una mini centrífuga durante 3 s. Incubar los tubos durante 25 minutos a 37 oC en un ciclor térmico con tapa calentada.
    2. Añadir 5 ml de 0,5 M EDTA inmediatamente a cada tubo. Mezclar bien por vórtice y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s.
  3. Purificación y resuspensión
    1. Transfiera cada producto del paso 3.2.2 a nuevos tubos de 1,5 ml. Añadir 37,5 s de perlas magnéticas a cada tubo. Mezclar por vértice e incubar a RT durante 5 min.
    2. Purifique los productos como se describe del paso 1.6.2 al paso 1.6.4.
    3. Eluse cada producto purificado como se describe en los pasos 1.6.5 y 1.6.6 agregando 32 s de tampón de TE baja.

4. Construcción de bibliotecas

  1. Blunt- e nd r epairment, selección de tamaño y purificación
    1. Preparar una mezcla de reparación de extremo romo de 20 ml para cada muestra añadiendo 9,5 ml de agua libre de nucleasas, 10 l de búfer de reparación de extremo 5x (Tablademateriales del tubo del paso 3.3.3. Vórtice y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s.
    2. Añadir 50 l de perlas magnéticas a cada tubo a partir del paso 4.1.1. Vórtice e incubar a RT durante 5 min.
      NOTA: Mezcle completamente las perlas magnéticas antes de usarlas.
    3. Coloque cada tubo en el soporte magnético durante 3 minutos hasta que el sobrenadante esté despejado. Transfiera todo el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 ml donde se añaden perlas magnéticas de 25 ml para cada uno. Vortex los tubos con el sobrenadante transferido e incubar a RT durante 5 min.
    4. Purificar los productos en los tubos incubados como se describe desde el paso 1.6.2 hasta el paso 1.6.4.
    5. Eluse cada producto purificado como se describe en los pasos 1.6.5 y 1.6.6 agregando 32 s de tampón de TE baja.
      NOTA: Este es un punto de parada seguro; el ADN purificado de este paso es estable a 4 oC durante no más de 24 h.
  2. Adaptador l igation y p urificación
    1. Preparar una mezcla de ligadura del adaptador de 17 l para cada muestra añadiendo 10 l de agua libre de nucleasas, 5 l de búfer de ligasa de 10x (Tablade materiales),1 l del adaptador P1 (Tablade materiales)y 1 l de ligada de ADN (Tablade materiales). Mezclar bien por vórtice durante 5 s y girar en una mini centrífuga para 15 s, y la alícuota en cada tubo del paso 4.1.5.
    2. Añadir 1 l de adaptadores (Tablade materiales) a cada tubo del paso 4.2.1 de acuerdo con la hoja de muestra (Archivo suplementario: Hoja de muestra para la ligaduradel adaptador). Vórtice y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s. Incubar los tubos a RT (20 x 25 oC) durante 20 min.
    3. Añadir 75 l de perlas magnéticas a cada tubo a partir del paso 4.2.2. Mezclar por vértice e incubar a RT durante 5 min. A continuación, purifique los productos como se describe del paso 1.6.2 al paso 1.6.4.
    4. Eluse cada producto purificado como se describe en los pasos 1.6.5 y 1.6.6 agregando 15 s de tampón de TE baja. Transfiera todo el sobrenadante que contiene ADN eludado a nuevas tiras de 0,2 ml de 8 tubos.
      NOTA: Este es un punto de parada seguro; el ADN purificado de este paso es estable a 4 oC durante no más de 24 h.
  3. Amplificación y purificación
    1. Preparar una mezcla maestra de amplificación de 50 l para cada muestra añadiendo 47,5 s de supermezcla (Tablade materiales)y 2,5 l de mezcla de imprimación (Tablade materiales). Mezclar bien vórtice y girar brevemente en una mini centrífuga, y la alícuota en las tiras de 0,2 ml de 8 tubos del paso 4.2.4.
    2. Vortex las tiras durante 30 s y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s. Incubar las tiras en el ciclor térmico con tapa calentada. Ejecute el programa con los siguientes ajustes: 20 min a 72 oC; 5 min a 95oC; 10 ciclos para 15 s a 95oC, 15 s a 62oC, 1 min a 70oC; 5 min a 70oC; mantener a 4 oC.
    3. Transfiera cada producto del paso 4.3.2 a nuevos tubos de 1,5 ml. Añadir 97,5 l de perlas magnéticas a cada tubo. Mezclar por vórtice e incubar a RT durante 5 min.
    4. Purifique los productos como se describe del paso 1.6.2 al paso 1.6.4.
    5. Eluse cada producto purificado como se describe en los pasos 1.6.5 y 1.6.6 agregando 25 s de tampón de TE baja.

5. Control de calidad y dilución de la biblioteca de ADN

  1. Cuantifique cada biblioteca de ADN preparada a partir del paso 4.3.5 mediante el ensayo del fluorómetro de acuerdo con el manual del fabricante utilizando 2 l de la biblioteca de ADN como material de partida.
  2. La concentración aceptada de la biblioteca de ADN es de 0,5 ng/L y la del control positivo (Tablade Materiales)es de 15 ng/L. Si la concentración del control positivo varía demasiado a partir de 15 ng/L, repita la cuantificación del control positivo hasta que la concentración esté cerca de 15 ng/L. Si la concentración de la biblioteca es inferior a 0,5 ng/L, reinicie desde la fragmentación (sección 3).
    NOTA: Asegúrese de que la concentración del control positivo alcance el valor aceptado antes de cuantificar la biblioteca de ADN.
  3. Diluir cada biblioteca a 100 pmol añadiendo agua libre de nucleasas. Añadir 1 l de biblioteca a n l de agua libre de nucleasas; calcular n utilizando la siguiente ecuación:
    figure-protocol-1
    donde Q es la concentración de cada biblioteca medida por el ensayo del fluorómetro y C es la concentración del control positivo medido por el ensayo del fluorómetro.

6. Secuenciación

  1. Antes de empezar, prepare 48 ml (con un 20% de exceso) de 1 M NaOH para cada muestra y un tubo de 1,5 ml sin nucleasas. Descongelar el búfer de PCR de mezcla maestra (Tablade materiales) (2000 l en volumen) en RT. Lleve las partículas de esfera (Tablade materiales)a RT.
  2. Agrupación de bibliotecas
    1. Vortex cada biblioteca diluida del paso 5.3 y girar brevemente 4x en una mini centrífuga para 3 s cada vez. Tome 5 l de cada biblioteca para agrupar en el tubo de 1,5 ml sin nucleasas. Vortex la biblioteca mixta y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s.
  3. Emulsión PCR utilizando un sistema de emulsión
    1. Añadir 150 l de solución de rotura a 2 nuevos tubos de recuperación (Tablade materiales). Instale los nuevos tubos de recuperación, el router de recuperación y la placa de amplificación.
    2. Mezclar invirtiendo la botella de aceite (Tablade Materiales)3 veces. Asegúrese de que tanto el aceite como la solución de recuperación (Tablade materiales)estén al menos 2/3 llenos.
    3. Vortex el búfer de PCR de mezcla maestra para 30 s y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s. Vortex las partículas de la esfera y la biblioteca mixta del paso 6.2.1 durante 1 min y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s.
    4. Preparar una mezcla de ligadura de 2400 l añadiendo 172 ml de agua libre de nucleasas, 8 l de biblioteca mixta a partir del paso 6.3.3, 120 l de mezcla enzimática (Tablade materiales)y 100 ml de partículas de esfera al tubo que contiene un búfer de PCR de mezcla maestra de 2000 l.
    5. Fije una pipeta a 800 l. Cargue la mezcla de ligaduras del paso 6.3.4 al filtro de reacción (Tablade materiales)a través del puerto de muestra. Utilice una pipeta 1000P para añadir 200 ml de aceite de reacción al filtro de reacción.
    6. Seleccione el programa Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 Kity, a continuación, seleccione el botón Asistido para asegurarse de que el dispositivo se ha configurado correctamente siguiendo las instrucciones del monitor. A continuación, haga clic en Siguiente para iniciar el programa.
  4. Enriquecimiento por un sistema de enriquecimiento automático
    1. Cuando se haya completado el programa PCR de emulsión, haga clic en Siguientey, a continuación, haga clic en Giro final para girar durante 10 minutos. Saque los 2 tubos de recuperación después de hacer clic en Abrir tapa.
    2. Deseche el sobrenadante de los 2 tubos de recuperación hasta que queden 100 ml en cada tubo y etiquete en consecuencia. Mezclar bien la solución y transferirla a un nuevo tubo de 1,5 ml.
    3. Añadir 200 ml de agua libre de nucleasas a cada tubo de recuperación, lavar pipeteando varias veces y transferir toda la solución al tubo de 1,5 ml en el paso 6.4.2. Repita el paso de lavado una vez.
    4. Añadir 200 l de agua libre de nucleasas a uno de los tubos de recuperación y lavar pipeteando varias veces. Transfiera toda la solución al otro tubo de recuperación y lávela pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. A continuación, transfiera toda la solución al mismo tubo de 1,5 ml desde el paso 6.4.3. Vortex el tubo de 1,5 ml para 30 s y centrífuga durante 8 min a 15.500 x g.
      NOTA: El volumen total final del producto PCR de emulsión en este paso debe ser de aproximadamente 1200 l.
    5. Deseche el sobrenadante en el tubo y mantenga 20 sL del producto PCR de emulsión. Añadir 80 l de solución de resuspensión (Tablade materiales)al tubo. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
    6. Preparar una solución de fusión de 320 l para cada chip añadiendo 280 ml de solución de monolaurato de sorbitano de polietilenglicol (Tablade materiales)y 40 ml de 1 M De NaOH.
      NOTA: 1 M NaOH debe conservarse a 4oC o recién preparado. Vórtice antes de su uso.
    7. Vortex el tubo que contiene perlas C1 (Tablade Materiales)durante 30 s. Llevar 100 l de perlas C1 a un nuevo tubo de 1,5 ml. Coloque el tubo de 1,5 ml en el soporte magnético durante 2 minutos en RT. Deseche todo el sobrenadante después de que las cuentas se hayan asentado sin perturbar las perlas.
    8. Añadir 1 ml de solución de lavado C1 (Tablade materiales)al tubo del paso 6.4.7. Vortex para 30 s. Coloque el tubo en el soporte magnético durante 2 minutos en RT. Deseche todo el sobrenadante después de que las cuentas se hayan asentado sin perturbar las perlas. Resuspenda las perlas añadiendo 130 sl de solución de captura de perlas (Tablade materiales).
    9. Sistema de enriquecimiento (ES) configuración
      1. Cargue la muestra (producto PCR de emulsión de 100 l) del paso 6.4.5, las perlas lavadas (130 l) del paso 6.4.8, la solución de lavado ES (300 l) (tablade materiales)y la solución de fusión (300 ol) del paso 6.4.6 en la 8 tiras. El orden de disposición es: muestra (tubo 1), perlas lavadas (tubo 2), solución de lavado ES (tubos 3, 4, 5) y solución de fusión (tubo 7). Mantenga los tubos 6 y 8 vacíos.
      2. Coloque la tira de 8 tubos del paso 6.4.9.1 en el ES. Instale una punta de pipeta y un nuevo tubo de 0,2 ml e inicie el programa.
        NOTA: Asegúrese de que el pipeteo funciona normal.
    10. Lave las partículas de la esfera después de que se complete el enriquecimiento.
      1. Centrifugar el tubo de 0,2 ml del paso 6.4.9.2 durante 5 min a 15.500 x g. Deseche el sobrenadante y mantenga 10 ml del producto de enriquecimiento. Añadir 200 l de agua libre de nucleasas al tubo. Mezclar por vórtice.
      2. Centrifugar el tubo de 0,2 ml desde 5 min a 15.500 x g. Deseche el sobrenadante y mantenga 10 ml del producto de enriquecimiento. Añadir 90 l de agua libre de nucleasas al tubo. Mezclar por vórtice.
  5. Preparación de plantillas
    1. Vortex el control positivo y girar brevemente. Añadir 5 l de control positivo a la plantilla de 100 l (el producto de enriquecimiento del paso 6.4.10.2). Vórtice y centrífuga durante 5 min a 15.500 x g. Deseche el sobrenadante y mantenga 10 sL de la plantilla.
    2. Añadir 20 l de imprimación de secuenciación (Tablade materiales)y 15 l de búfer de recocido (Tablade materiales)al tubo de plantilla del paso 6.5.1. Vortex el tubo y girar brevemente en una mini centrífuga para 3 s.
    3. Incubar el tubo del paso 6.5.2 en el ciclor térmico con tapa calentada. Ejecute el programa con los siguientes ajustes: 2 min a 95 oC, 2 min a 37 oC, mantenga pulsado a 4 oC.
    4. Añadir 10 l de tampón de carga (Tablade materiales)al tubo desde el paso 6.5.3. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  6. Inicialización del secuenciador
    1. Compruebe la presión del tanque de gas nitrógeno (presión total de 500 psi, presión de salida a 10 psi, óptimo de 20-30 psi). Recargar 100 ml de agua desionizada (18,2 M) a los tubos C1 y C2 (Tablade materiales)e instalarlos en las posiciones C1 y C2 correspondientes en el secuenciador.
    2. Prepare las soluciones W1 (32 l de 1 M NaOH) y W3 (40 a 50 mL de búfer W3 [Tabla de materiales]). Prepare la solución W2 añadiendo 1920 ml de agua desionizada (18,2 M), una botella entera de tampón W2 (Tablade materiales)y 8 x 12 l de 1 M NaOH e invierta 4 a 8 veces para mezclar.
      NOTA: Debido a que la calidad del agua varía geológicamente, ajuste el volumen de 1 M NaOH según sea necesario. El pH inicial de W2 es de 5,9 a 6,1, y el rango óptimo después del ajuste es de 7,4 a 7,6. Cambie e instale nuevos tubos de reactivos y utilice un chip usado recientemente para el lavado.
    3. Preparar los 4 nuevos tubos vacíos del kit de suplemento de secuenciación (Tablade materiales). Etiquete los 4 tubos como dGTP, dCTP, dATP y dTTP, y agregue 70 l de dGTP, dCTP, dATP o dTTP (Tablade materiales)al tubo correspondiente (es decir, 70 l dGTP al tubo etiquetado como dGTP, etc.). Vórtice los tubos antes de su uso. Instale los tubos en las posiciones correspondientes designadas en el secuenciador (Tablade materiales).
  7. Lavado de virutas
    1. Lavar el chip (Tablade Materiales)una vez inyectando 100 l de isopropanol en el pozo de carga del chip. Retire el líquido expulsado del pozo opuesto.
    2. Lave el chip dos veces inyectando 100 ml de agua libre de nucleasas en el pozo de carga del chip. Retire el líquido expulsado del pozo opuesto.
    3. Lave el chip una vez inyectando 100 ml de 0,1 M NaOH en el pozo de carga del chip. Retire el líquido expulsado del pozo opuesto. Incubar a RT durante 1 min.
    4. Lave el chip una vez inyectando 100 ml de agua libre de nucleasas en el pozo de carga del chip. Retire el líquido expulsado del pozo opuesto.
    5. Lave el chip dos veces inyectando 100 ml de isopropanol en el pozo de carga del chip. Retire el líquido expulsado del pozo opuesto. Secar soplando nitrógeno sobre la viruta. Manténgase alejado de la luz.
  8. Carga y secuenciación de muestras
    1. Mezcle la muestra de 55 ml del paso 6.5.4 pipeteando hacia arriba y hacia abajo y cargue la muestra en el pozo de carga del chip.
      NOTA: Mantenga la punta de la pipeta y el tubo PCR de 0,2 ml utilizado en este paso.
    2. Coloque el chip en la mini centrífuga del chip (Tablade materiales)cuando
    3. Prepare dos nuevos tubos de 1,5 ml para el tampón de recocido y la solución de lavado. Preparar el búfer de recocido del 50% añadiendo 500 l de tampón de recocido y 500 l de agua libre de nucleasas. Preparar la solución de lavado añadiendo 500 s de tampón de recocido y 500 l de 100 % 2-propanol.
    4. Preparar dos nuevos tubos de 1,5 ml y preparar la mezcla de espuma mezclando 49 ml de tampón de recocido del 50% y 1 l de solución de espuma (Tablade materiales)en ambos tubos.
    5. Ajuste una pipeta a 100 l. Haga burbujas pipeteando el aire en la mezcla de espuma de uno de los dos tubos del paso 6.8.4. Hacer > 120 l de burbujas y seguir pipeteando hasta que no se puedan ver burbujas visibles sobresalientes. Cargue 120 s de burbujas en el pozo de carga.
      NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas visibles pendientes. De lo contrario, empezar de nuevo.
    6. Transfiera el líquido expulsado excesivo del pozo de salida del paso 6.8.5 al pozo de carga pipeteando. No pipetee burbujas. Centrifugar el chip durante 30 s en la mini centrífuga del chip.
    7. Repita el paso 6.8.5 utilizando el segundo tubo que contiene la mezcla de espuma del paso 6.8.4.
    8. Añadir 55 sL del búfer de recocido del 50% al tubo de 0,2 ml mantenido en el paso 6.8.1. Utilice la punta de pipeta guardada en el paso 6.8.1 para pipetear hacia arriba y hacia abajo. Cargue todo el búfer de recocido de 55 l en el pozo de carga. Centrifugar el chip durante 30 s en la mini centrífuga de chip designada.
    9. Cargue 100 sal de solución de lavado en el pozo de carga de la viruta y deseche el líquido expulsado del pozo de salida. Repita este paso de carga una vez.
      NOTA: Si hay burbujas en el chip, expulse pequeñas burbujas por burbujas grandes y enjuague por solución de lavado. Esto se puede lograr pipeteando 100 l de solución de lavado y dejando 5 sl de aire por debajo de la solución de lavado. Por lo tanto, al pipetear los 105 l en el chip, el aire formará una gran burbuja que puede expulsar las pequeñas burbujas, y luego, la gran burbuja puede ser expulsada por la siguiente solución de lavado.
    10. Cargue 100 l del búfer de recocido del 50% en el pozo de carga del chip. Repita este paso de carga para un total de 3 veces.
    11. Añadir 6 l de la enzima de secuenciación en 60 s de la tampón de recocido del 50% en un nuevo tubo de 1,5 ml. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Cargue 65 ml de esta solución mixta en el pozo de carga del chip. Pipetear lentamente para evitar la formación de espuma.
    12. Mantenga el chip alejado de la luz e incubar a RT durante 5 min.
    13. Después de la incubación, cargue inmediatamente el chip en el secuenciador y haga clic en Iniciar la ejecución de secuenciación en la pantalla para iniciar la secuenciación.
      NOTA: La secuencia de datos sin procesar y los archivos de control de calidad se cargarán automáticamente en la empresa para su análisis de datos.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sobre la base de este protocolo modificado, la plataforma de secuenciación de semiconductores fue por primera vez, aplicada para PGT-A. Probamos las biopsias de los blastómeros en etapa de escote y los embriones en etapa de blastocisto. Se sugiere que las células biopsiadas se sometan a WGA tan pronto como sea posible para prevenir cualquier degradación del ADN. Un estudio anterior comparó el rendimiento de diferentes métodos WGA e indicó que el método que describimos aquí tenía la mejor ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A diferencia de otras químicas de secuenciación, el secuenciador descrito aquí utiliza semiconductores para la detección de nucleótidos. El chip en sí es un dispositivo electrónico que detecta iones de hidrógeno por la incorporación de base impulsada por la polimerasa17,lo que permite un tiempo de secuenciación de 2 x 4 horas del programa Proton. Además, el chip es un chip de micropozo que permite la localización de una molécula de destino, que es diferente de la química de secuenciación de célula...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por el Fondo General de Investigación (Ref No 14162417) de Hong Kong, la National Natural Science Foundation of China (Ref No 81860272), el Plan de Investigación Principal de la Fundación Provincial de Ciencia y Tecnología de Guangxi (Ref No. AB16380219), y la Beca de la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (Ref No. 2018M630993) de China.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de PCR, 0,2 mLAxygenPCR-02D-C
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0ThermoFisher15575020
PBS, pH 7,4, Ca2+ y Mg2+ThermoFisher10010023
solución de NaOH (1,0N)SIGMA-ALDRICHS2567para solución Melt-off.
Tubos LoBind Eppendorf de grado molecular, 1,5 mLFisher Scientific13-698-791
Ion PlusThermoFisher4471252
ELGA PURELAB Flex 3 o
equivalente a 18 MΩ sistema de agua		ThermoFisher4474524
Ion Plus Kit de bibliotecaThermoFisher 4471252
Tampón de amplificación PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.
Enzima de amplificación PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.
de amplificación Ion OneTouchEn el kit: Suministros Ion OneTouch 2 (n.º de pieza A26367). Componente del kit ampliado en la hoja 5
de recocido Ion PI
MyOne Beads Capture Solution Agilent
2100 Instrumento de bioanalizadorAgilentG2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (tapa negra)Ion PI Hi? Q OT2 Solutions 200 (Nº de pieza A26429). Componente del kit extendido en la hoja 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFisher65001
PicoPLEX WGA Cell extractionRubicon GenomicsR30050Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-00.
PicoPLEX Enzima de extracción celular WGARubicon GenomicsR30050Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3ThermoFisherA26771
Chip de iones Minifuge, 230 VThermoFisher4479673
Ion PI dATPThermoFisherA26772
Ion PI dCTPThermoFisherA26772
Ion PI dGTPThermoFisherA26772
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Kit de biblioteca de fragmentos Ion PlusThermoFisher4471252
ThermoQ– Temperatura Baño secoTAMARHB-T2-A
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
Ion PI dTTPThermoFisherA26772
Ion OneTouch 2 InstrumentThermoFisherINS1005527ThermoFisher Número de catálogo: 4474778.
Ion Plus Kit de biblioteca de fragmentosThermoFisher4471252
Ion One Touch ESThermoFisher8441-22ThermoFisher Número de catálogo: 4469495. Componente del kit extendido en la hoja 5
EtanolSIGMA-ALDRICH51976Esto puede ser reemplazado por etanol absoluto de grado molecular de cualquier marca.
Tampón de dilución de enzimas de extracción PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Tampón de dilución de enzimas de extracciónRubicon GenomicsR30050Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-02.
Fluorímetro Qubit 3.0ThermoFisherQ33216Este modelo ha sido reemplazado por el Fluorímetro Qubit 4, Número de catálogo: Q33226.
Qubit ds DNA HS Kit de ensayoThermoFisherM2002-02
Tubos de ensayo QubitThermoFisherQ32856
Ion PI Foaming SolutionThermoFisherA26772
Índice para códigos de barras de bibliotecasBaseCareeste es un índice preparado internamente. Los usuarios pueden comprar productos comerciales de los kits de adaptadores de códigos de barras ThermoFisher Ion Xpress (Cat. N.º 4474517)
Tampón de carga Ion PIThermoFisherA26772
Kit de tampón sólido(TM) 1X Tampón de TE bajoThermoFisher4389764
Agencour AMPure XP KitBeckman CoulterA63880
Imán DynaMag-2 (bastidor magnético)Tampón
Ion PI Master Mix
Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrífugaMicro 1775002430
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Agua sin nucleasasThermoFisherAM9922Esta puede ser sustituida por otra marca.
PicoPLEX WGA Agua sin nucleasasRubicon GenomicsR30050Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.
Botella de aceiteIon PI Hi? Q OT2 Solutions 200 (Nº de pieza A26429). Componente de kit extendido en la Hoja 5
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252 Componente de kit extendido en la Hoja 3
EstándarEste es un estándar de ADN preparado internamente para la calibración de Qubit antes de la cuantificación de la biblioteca.
Tampón de preamplificación PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Este puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.
Enzima de preamplificación PicoPLEX WGARubicon GenomicsR30050Esto puede ser reemplazado por el sistema de amplificación de ADN SurePlex, número de catálogo: PR-40-415101-03.
Mezcla de cebador de amplificación de bibliotecasThermoFisher4471252Componente de kit extendido en la hoja 3
reacción Ion OneTouchComponente del kit extendido en la hoja 5
EnrutadorComponente del kit extendido en la hoja 5
Tubos de recuperación Componentedel kit extendido en la hoja 5
Soluciónde resuspensión ISP
Ion ProtonThermoFisherDA8600Este modelo es importado por Da An Gene Co., LTD. de la Universidad Sun Yat-Sen de ThermoFisher y ha sido certificado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de China para aplicación clínica. El número de catálogo de ThermoFisher es 4476610.
Ion PI ¿Hola? Q Secuenciación de polimerasaThermoFisherA26772
Ion PI Secuenciación Servidor de cebadores
para secuenciadorLenovoT260
Ion PI Sphere Particles Platinum
PCR SuperMix Alta FidelidadThermoFisher4471252
Nalgene 25mm Filtros de jeringaThermoFisher724-2045Tamaño de poro: 0,45 m. Específico para fluidos acuosos.
Ion PI ¿Hola? Q Solución W2ThermoFisherA26772
Ion PI 1X W3 SoluciónThermoFisherA26772
Ion OneTouch Solución de lavado C1
El Ion PGM Hi? Q Ver kit de secuenciaciónThermoFisherA30044Componente de kit extendido en la hoja 2
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252Componente de kit extendido en la hoja 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 ciclo de secuenciación por inicialización)ThermoFisherA26772Componente de kit extendido en la hoja 4
Ion PI Hi? Q OT2 200 KitThermoFisherA26434Componente de kit extendido en la hoja 5
sin Kit de biblioteca de fragmentos Sistema de purificación de agua Placa Tampón En el kit: buffer PCR ThermoFisher 12321D Ion OneTouch de ADN de doble cadena Filtro de de recuperación

Referencias

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