La respiración mitocondrial es crítica para la supervivencia; por lo tanto, la tasa de consumo de oxígeno es un excelente indicador de la salud mitocondrial. En este protocolo, describimos el uso de un respirómetro comercialmente disponible a medida basal y las tasas de consumo de oxígeno máximo en vivo, intacto y libremente móviles elegans de Caenorhabditis.
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Artículo de método
Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans
En este artículo
Resumen
Resumen
Función mitocondrial óptima es fundamental para la actividad celular saludable, particularmente en las células que tienen demandas de alta energía como los del sistema nervioso y muscular. Consistente con esto, la disfunción mitocondrial se ha asociado con una miríada de enfermedades neurodegenerativas y envejecimiento en general. Elegans de Caenorhabditis han sido un sistema potente para elucidar las muchas complejidades de la función mitocondrial. La respiración mitocondrial es un fuerte indicador de la función mitocondrial y respirometers recientemente desarrollados ofrecen una plataforma de avanzada para medir la respiración en las células. En este protocolo, ofrecemos una técnica para analizar vivo, intacto C. elegans. Este protocolo abarca un período de ~ 7 días e incluye pasos para el crecimiento y la sincronización de C. elegans, (2) preparación de compuestos que se inyecta y la hidratación de las puntas de prueba, equilibrado de carga y el cartucho (3) drogas (4) preparación de análisis de gusano (1) placa y serie y análisis de datos post-experimento (5).
Introducción
Trifosfato de adenosina (ATP), la principal fuente de energía celular, se produce en las mitocondrias por enzimas de la cadena de transporte de electrones (ETC) situadas en la membrana mitocondrial interna. Piruvato, un metabolito clave utilizado para la producción de ATP mitocondrial, se importa a la matriz mitocondrial donde es descarboxilada para producir acetil coenzima A (CoA). Posteriormente, el acetil CoA entra en el ciclo del ácido cítrico resultando en la generación de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), una molécula de portador de la clave electrónica. Como pasan electrones del NADH al oxígeno vía lo etc., los protones se acumulan en el espacio de inte....
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Protocolo
Nota: La figura 2 proporciona un Resumen esquemático del protocolo completo.
1. crecimiento y sincronización de población del nematodo9,10
- Transferencia de larvas L4 de fondos genéticos deseados (por ejemplo, N2 [tipo] y sel-12 animales) sobre nematodos media (NGM) placas de crecimiento (ver tabla 1 para receta) recién sembradas con césped de Escherichia coli (OP50)11. Uso de m m 100 por lo menos dos o tres placas de 60 mm para cada cepa. Incubar los gusanos a la temperatura de crecimiento adec....
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Resultados
Utilizando el protocolo aquí descrito, OCR de animales de tipo salvaje y mutante de diferentes sel-12 tres cepas fueron determinadas. SEL-12 codifica el ortólogo de C. elegans de presenilina17. Las mutaciones en humano presenilin son la aberración genética más común asociada con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer familiar18. Nuestros estudios han demostrado niveles elevados de calcio mitocondrial en se.......
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Discusión
La respiración mitocondrial es un perspicaz indicador de la función mitocondrial; por lo tanto, ser capaz de medir las tasas de consumo de oxígeno en un sistema biológico, ya sea in vitro o en vivo es muy valiosa. Respirometers detectar niveles de oxígeno usando fósforos de porfirina que haz apagados por oxígeno o por medio de sensores de oxígeno amperométrico que dependen de la generación de una eléctrica actual proporcional a la presión de oxígeno. Electrodo de Clark cae en esta última categoría y se ha utilizado ampli.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer el Dr. Kevin Bittman para su orientación en el establecimiento de la XFp de Caballito de mar en el laboratorio. Institutos nacionales de salud otorgar que gm088213 apoya esta labor.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de Petri de 100 mm, 60 mm | Productos de material de laboratorio Kord-Valmark | 2900, 2901 | |
| Tubos de centrífuga de 1,5 mL | Globe Scientific | 6285 | |
| Tubos cónicos de 15 mL | Corning | 430791 | |
| 22 × cubreobjetos de 22 mm | Globe Scientific | 1404-10 | |
| Tubos cónicos de 50 mL | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptona | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto triptona | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto extracto de levadura | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Genérico | ||
| Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2· 2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Colesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Agua desionizada (dH2O) | |||
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Pipetas de vidrio Pasteur | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4· 7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Azida de sodio | Sigma-Aldrich | S2002 |
Referencias
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al.
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Reimpresiones y permisos
