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Artículo de método

Aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación Neuronal de células madre de pulpa Dental humana

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DOI:

10.3791/59282

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18 de marzo de 2019

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1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para aislamiento de células de la pulpa Dental humana y propagación con el fin de evaluar la expresión de la proteína del prión durante el proceso de diferenciación neuronal.

Resumen

Cuestiones bioéticas relacionadas con la manipulación de células madre embrionarias han impedido avances en el campo de la investigación médica. Por esta razón, es muy importante obtener las células madre adultas de diferentes tejidos como el adiposo, cordón umbilical, médula ósea y sangre. Entre las posibles fuentes, la pulpa dental es particularmente interesante porque es fácil de obtener con respecto a consideraciones bioéticas. De hecho, células de madre pulpa Dental humana (hDPSCs) son un tipo de células madre adultas capaces de diferenciarse en células neuronales y puede obtenerse desde el tercer molar de pacientes sanos (edades de 13-19). En particular, la pulpa dental elimina con una excavadora, cortar en pequeñas rodajas, trataron con colagenasa IV y cultivada en un matraz. Para inducir la diferenciación neuronal, hDPSCs fueron estimuladas con EGF/bFGF durante 2 semanas. Previamente, hemos demostrado que durante el proceso de diferenciación del contenido de priónica celular proteína (PrPC) en hDPSCs aumentado. El análisis cytofluorimetric mostró una expresión temprana de PrPC que aumentó después del proceso de diferenciación neuronal. Ablación de PrPC por siRNA PrP previene la diferenciación neuronal inducida por EGF/bFGF. En este artículo ilustramos que mejoramos el aislamiento, separación y en vitro métodos de cultivo de hDPSCs con varios procedimientos fáciles, más eficientes células clones eran obtenido y gran expansión de las células madre mesenquimales (MSCs) se observó. También mostramos cómo hDPSCs, obtenidos con métodos detallados en el protocolo, son un excelente modelo experimental para estudiar el proceso de diferenciación neuronal de MSCs y los procesos celulares y moleculares posteriores.

Introducción

Las células madre mesenquimales se han aislado de varios tejidos, incluyendo la médula ósea, sangre del cordón umbilical, la pulpa dental humana, tejido adiposo y sangre1,2,3,4,5 , 6. según varios autores, hDPSCs Mostrar adhesión de plástico, una típica morfología de fibroblasto-como. Estos representan una población muy heterogénea con diferentes clones y diferencias en la capacidad proliferativa y de diferenciación7,8. hDPSCs expresan marcadores específicos de células madre mesenquimales (es decir, CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), son negativos para algunos marcadores hematopoyéticos (como CD14 y CD19) y son capaces de diferenciación in vitro del multilineage9, 10,11.

Varios autores han demostrado que estas células son capaces de diferenciarse en neuronas-como las células utilizando diferentes protocolos, que incluyen la adición de NGF, bFGF, EGF en combinación con determinados medios y suplementos de7,12. Además, muchas proteínas están involucradas durante el proceso de diferenciación neuronal y, entre estos, varios trabajos muestran un papel relevante y significativa expresión de la proteína priónica celular (PrPC), tanto en las células madre embrionarias y adultas13, 14. PrPC representa una molécula pleiotrópica capaz de realizar diferentes funciones dentro de las células como cobre metabolismo, apoptosis, y resistencia a oxidativo estrés15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

En nuestro anterior documento23, investigamos el papel de PrPC en el proceso de diferenciación neuronal hDPSCs. De hecho, hDPSCs expresar precozmente PrPC y, después de la diferenciación neuronal, fue posible observar un aumento adicional. Otros autores la hipótesis de un posible papel del PrPC en los procesos de diferenciación neuronal de células madre. De hecho, PrPC conduce a la diferenciación de células madre embrionarias humanas en neuronas, oligodendrocitos y astrocitos24. El propósito de este estudio era hacer hincapié en la metodología para la obtención de células madre de pulpa dental, su proceso de diferenciación y la función de PrPC durante la diferenciación neuronal.

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Protocolo

Terceros molares en el estudio fueron suprimidos de los pacientes (13-19 años) sin historia previa de consumo de alcohol o drogas, todas para no fumadores y con adecuada higiene oral. En el día de la explicación, en el Departamento de ciencia odontología y maxilofacial de la Universidad "Sapienza" de Roma, se obtuvo consentimiento informado de los pacientes o los padres. Consentimiento informado se obtuvo basado en consideraciones éticas y la aprobación del Comité de ética.

1. el diente y la extracción de la pulpa Dental

  1. Preparación de medio apropiado para la conservación o el transporte.
    1. Preparar media baja concentración modificado Eagle de Dulbecco de glucosa (DMEM-L) con L-glutamina (494,5 mL).
    2. Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) y 0.5 mL de anfotericina (0,1%).
  2. Extraer el tercer molar de la paciente, rápidamente lavar con PBS, colocar en un tubo de ensayo de 15 mL con el medio y transferir al laboratorio en menos de 2 h.
  3. Bajo una campana de biohazard, abrir el diente con una fresa de pasada de corte coronal paralelo y tangente a través del techo de la cámara pulpar.
  4. Suavemente Retire la pulpa con una excavadora pequeña y colóquela en un tubo de ensayo.
  5. Lavar con PBS tres veces y centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a TA.

2. procesamiento de la pulpa Dental y liberación de células madre

  1. Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado en solución de Hank y colocar en una placa Petri. Incubar por 2 h a 37 ° C en 5% CO2.
  2. Tipo de preparación de solución de colagenasa IV.
    1. Preparar 0,8 mL de DMEM-L.
    2. Derretir 1 mg de colagenasa de tipo IV en 0,8 mL de DMEM-L y agitar durante varios minutos.
    3. Agregar DMEM-L a tener una concentración final 1 mL 1 mg/mL.
    4. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm.
  3. Retire la solución de Hank por centrifugación a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente y dividir la pulpa en rebanadas pequeñas de aproximadamente 1 mm cada uno con un bisturí desechable.
  4. Colocar las rebanadas de la pulpa en un plato de petri e incubar con 1 mL de colagenasa tipo IV durante 15 min a 37 ° C en 5% CO2.
  5. Preparación de medio de cultivo (500 mL).
    1. A 445 mL de DMEM-L con L-glutamina.
    2. Añadir 50 mL de suero bovino Fetal (FBS) (10%).
    3. Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%).
  6. Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado en el medio (paso 2.5) y la cultura en T25 frasco específico para células madre a 37 ° C en 5% CO2.

3. propagación y cultivo de células de vástago

  1. Cada día Compruebe la cultura y, después de 3 días de crecimiento, observar diferentes clones de células adherentes dentro de la mufla.
  2. Cada 3 días cambiar el medio de cultivo.
  3. Entre 7 y 12 días, una vez que las células adherentes tienen alcance confluencia, separar la les, tratar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C o con la ayuda de un raspador celular.
  4. Añadir 4 ml (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina.
  5. Centrifugue la suspensión de células de 6 min a 259 x g, quite el sobrenadante y colocar las células en un frasco de T25 para propagar.
    Nota: Cada 3 días las células llegar a confluencia.
  6. Se propagan las células hasta los 21 o 28 días (aproximadamente 6-8 pasos) para evitar la presencia de no madre como las células en el cultivo.
  7. Separar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 minutos a 37 ° C o raspando suavemente. Centrifugue la suspensión de células de 6 min a 259 x g.
  8. Quite el sobrenadante y las células para el análisis de cytofluorimetric (paso 6).

4. transitorio PrPC silenciar por siRNA

  1. Las placas de 6 pozos de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5) por 24 h de cultivo.
  2. Al día siguiente, preparar medio de PrP de siRNA (400 μL).
    1. A un tubo de ensayo estéril, añadir 384 μl DMEM-L.
    2. Añadir 1 μl de cada tipo de siRNA PrP DMEM-l para una concentración final de 5 nM (4 siRNA PrP fueron utilizados y verificados por el proveedor para garantizar una eficiencia de precipitación ≥70%).
    3. Añadir 12 μl de transfectionreagent DMEM-l.
    4. Vórtice la mezcla e incubar 10 min a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de transfección.
  3. Añadir 400 μL de medio de PrP siRNA a cada muestra e incubar durante 6 h a 37 ° C.
  4. Sin descartar el medio de PrP de siRNA, añadir 1,6 mL (relación de 1 a 5) del medio de cultivo (paso 2.5).
  5. Salir de las células durante 72 h a 37 ° C.
  6. Quite el sobrenadante y lavar 3 veces con 2 mL de PBS a TA.
  7. Añadir 2 mL de medio de cultivo neuronal por 7 o 14 días (paso 5.1).
  8. Cambiar el medio de cultivo neuronal cada 3 días.
    Nota: Reemplazar el siRNA PrP solución cada reemplazo de tiempo el medio de cultivo neuronal.
  9. En el final del tiempo, lavar 3 veces con 2 mL de PBS a temperatura ambiente y prueba de antígenos de la superficie neuronales por análisis de Western Blot.

5. neuronal proceso de inducción de hDPSCs

  1. Preparación de medio de cultivo neuronal (500 mL).
    1. Preparar 444,7 mL de medio basal a las células neuronales.
    2. Al medio de añadir 50 mL de suplemento libre de suero que utiliza para apoyar la viabilidad a largo plazo de células embrionarias y adultas del vástago neuronales (10%).
    3. Añadir 200 μL de básico Factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) (concentración final 40 ng/mL) y 100 μl de Factor de crecimiento epidérmico (EGF) en el medio (concentración final 20 ng/mL).
    4. Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) en el medio.
  2. Cultura hDPSCs en placas de 6 pocillos (2 x 105 células/mL) hasta 28 días de la separación de la pulpa y estimular con 2 mL de medio de cultivo neuronal.
  3. Cada 3 días deseche el sobrenadante y lavar 3 veces con 2 mL de PBS a temperatura ambiente vuelva a colocar 2 mL de medio de cultivo neuronal.
  4. Después de 7 o 14 días, separar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C o suavemente con una espátula.
  5. Añadir 4 mL (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina.
  6. Prueba para la presencia de antígenos de superficie neuronales (paso 6) o la expresión de la proteína del prión (paso 7) por análisis de citometría de flujo.

6. Caracterización de la hDPSCs por citometría de flujo

  1. Estromal mesenquimal (MSC) de seleccionar-antígenos de superficie específicos o neuronales.
  2. La cultura hDPSCs en placas de 6 pocillos (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5).
  3. Soltar hDPSCs a los 28 días de la separación de la pulpa dental o después de 14 días de medio de cultivo neuronal (paso 5.1) con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 minutos a 37 ° C o ligeramente raspador.
  4. Añadir 4 ml (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina y centrifugado a 259 x g durante 6 min a TA. lavar otro 2 veces con 2 mL de PBS a TA.
  5. Fijar la hDPSCs no tratada o tratada con paraformaldehído al 4% en PBS por 10 min a 4 ° C.
  6. Permeabilizar hDPSCS con tensioactivo no iónico 0,1% (v/v) en PBS durante 10 minutos adicionales a TA.
  7. Realizar el bloqueo con 5% leche en polvo descremada en 1 mL de PBS durante 1 h a TA.
  8. Lavar 3 veces con 1 mL de PBS e incubar las células con anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 las células), anti β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 células), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 células) y anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 células) mAb por 1 h a TA.
  9. Lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS e Incube anti-ratón PE (1:50 / 5 x 105 células) o anti-conejo CY5 (1:50 / 5 x 105 células) mAb para adicional 1 h a TA.
  10. Utilizar los anticuerpos secundarios para bloquear las células immunopositive (PE anti-ratón o anti-conejo CY5 mAb) y analizar todas las muestras con un citómetro de flujo y adquirir por lo menos 20.000 eventos.

7. evaluación de la expresión de PrPC en hDPSCs por análisis de citometría de flujo

  1. Las placas de 6 pozos de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5) de la cultura.
  2. Quitar hDPSCs a los 21 y 28 días de la separación de la pulpa dental y después de 7 o 14 días con medio de cultivo neuronal (paso 5.1) con 1 mL de tripsina-EDTA y detener la acción de la tripsina como se describe en el paso 6.4. Fijar a las muestras con paraformaldehído al 4% en PBS por 10 min a 4 ° C.
  3. Permeabilizar con 0,1% (v/v) no iónicos surfactantin PBS durante 10 minutos en RT. eliminar el sobrenadante y las células con conejo anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 células) la mancha mAb por 1 h a RT. incubar con anti-conejo CY5 (1:50 / 5 x 105 células) mAb para adicional 1 h a TA.
  4. Analizar todas las muestras con un citómetro de flujo y adquirir por lo menos 20.000 eventos.

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Resultados

Los procedimientos de aislamiento y separación de hDPSCs de la pulpa dental, obtenida del tercer molar, son procesos complejos en que pequeños cambios pueden provocar un resultado ruinoso. En este trabajo, utilizamos el protocolo de Arthur et al.. 12 con varias mejoras. Figura 1muestra un esquema representativo de los procedimientos.

hDPSCs representa una población h...

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Discusión

En este trabajo, nos enfocamos en la metodología para el aislamiento y la diferenciación neuronal de hDPSCs; Además, evaluamos el papel del PrPC en este proceso. Existen varios métodos para aislar y diferenciar hDPSCs neurona-como las células y pasos críticos durante el proceso. hDPSCs son capaces de diferenciarse en varios linajes como condroblastos, adipocitos, osteoblastos y las neuronas. En nuestro trabajo, hemos investigado los mecanismos de la diferenciación neuronal y la presencia de PrPC. Co...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la "Fondazione Varrón" y Rieti Universidad "Sabina Universitas" a Vincenzo Mattei.

Figura 5 (A, B) reimpreso con el permiso de la editorial Taylor & Francis Ltd de: complejos multimoleculares de papel de prión proteína EGFR durante la diferenciación neuronal de dentales pulpa derivada de células madre humanas. Martellucci, S., V. de Manganelli, Santacroce C. F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei prión. 2018 4 de Mar. Taylor & Francis Ltd.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de anfotericina BSigma-AldrichA2942Se utiliza para complementar los medios de cultivo celular, es un antibiótico antifúngico de polieno de Streptomyce
Anti-B3tubulinCell Signaling Technology  #4466Una de las seis isoformas de B-tubulina, se expresa altamente durante el desarrollo fetal y postnatal, permaneciendo alta en el sistema nervioso periférico
Anti-CD105 BD Biosciences611314Endoglin (CD105), una de las principales glicoproteínas del endotelio vascular humano, es una proteína de membrana integral de tipo I con una gran región extracelular, una región transmembrana hidrofóbica y una cola citoplasmática corta
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulMarcadores celulares positivos Anticuerpos dirigidos contra células madre mesenquimales
Anti-CD73 Tecnología de señalización celular 13160CD73 es una glicoproteína de 70 kDa anclada a la membrana anclada a la glicoproteína fosfatidilinositol que cataliza la hidrólisis de los nucleósidos monofosfatos extracelulares en nucleósidos bioactivos
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulMarcadores celulares positivos anticuerpos dirigidos contra células madre mesenquimales
Anti-GAP43 Tecnología de señalización celular #8945Es una proteína específica del sistema nervioso, asociada al crecimiento en conos de crecimiento y áreas de alta plasticidad
Anti-ratón PE Abcamab7003Es un anticuerpo utilizado en citometría de flujo o análisis FACS
Anti-NFH Tecnología de señalización celular #2836Es un anticuerpo que detecta los niveles endógenos de la proteína total Neurofilament-H
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Conejo monoclonal [EP 1802Y] a proteína priónica PrP
Anti-conejo CY5 Abcamab6564Es un anticuerpo utilizado en citometría de flujo o análisis FACS
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulMarcadores celulares positivos anticuerpos dirigidos contra células madre mesenquimales
B27 Supp XF CTSGibco de life technologiesA14867-01B-27  se puede utilizar para apoyar la inducción de células madre neurales humanas (hNSCs) a partir de células madre pluripotentes (PSCs), expansión de hNSCs, diferenciación de hNSCs, y mantenimiento de neuronas maduras diferenciadas en cultivo
BD Accuri C6 citómetro de flujo BD BiosciencesAC6531180187Citómetro de flujo equipado con un láser azul (488 nm) y un láser rojo (640 nm)
BD Accuri C6 Software BD Biosciencescontrola el sistema de citómetro de flujo BD Accuri C6 para adquirir datos, generar estadísticas y analizar resultados
bFGFPeproThec, DBA100-18Bfactor de crecimiento básico de fibroblastos 
Centrífuga CL30RTermofisher Scientific11210908es un dispositivo que se utiliza para la separación de fluidos, gases o líquidos, basado en la densidad
Incubadora de CO2 3541Termofisher Scientific317527-185garantiza condiciones de crecimiento óptimas y reproducibles para cultivos celulares
Colagenasa, tipo IV Life Technologies17104019La colagenasa es una proteasa que rompe el enlace entre un aminoácido neutro (X) y la glicina en la secuencia Pro-X-Glyc-Pro, que se encuentra con alta frecuencia en el
colágeno Bisturí desechable Swann-Morton501Se utiliza para cortar tejidos:
DMEM-LEuroclonECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose con L-Glutamina con Piruvato de Sodio
EGFPeproThec, DBAAF-100-15Epidermal Growth Factor 
Suero fetal bovinoGibco de life technologies10270-106FBS es un suplemento de medios popular porque proporciona una amplia gama de funciones en el cultivo celular. FBS proporciona nutrientes, factores de crecimiento y unión y protege las células del daño oxidativo y la apoptosis mediante mecanismos que son difíciles de reproducir en sistemas de medios sin suero (SFM)
Filtropur BT50 0.2,500 mL Filtro de tapa de botellaSarstedt831,823,101es un dispositivo que se utiliza para la filtración de soluciones
Flexitube GeneSolution para PRNPQiagenGS56214 siRNAs para el gen Entrez 5621. Secuencia diana N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  La
solución de Hank 1xGibco de life technologies240200083La función esencial de Hanks′ La solución salina equilibrada es para mantener el pH y el equilibrio osmótico. También proporciona agua e iones inorgánicos esenciales a las células
reactivo de transfección Qiagen 301705 HiPerFect es una mezcla única de lípidos catiónicos y neutros que permite una absorción efectiva de siRNA y una liberación eficiente de siRNA dentro de las células, lo que resulta en una alta eliminación de genes incluso cuando se utilizan bajas concentraciones de siRNA
Gibco de life technologies10888022Neurobasal-A Medium es un medio basal diseñado para el mantenimiento y la maduración a largo plazo de las neuronas cerebrales puras postnatales y adultas 
ParaformaldehídoSigma-Aldrich30525-89-4El paraformaldehído se ha utilizado para la fijación de células y secciones de tejido durante los procedimientos de tinción
penicilina/estreptomicina EuroclonECB3001D Se utiliza para complementar los medios de cultivo celular para controlar la contaminación bacteriana
Solución salina tamponada con fosfato  (PBS)EuroclonECB4004LX10 PBS es una solución salina equilibrada utilizada para la manipulación y el cultivo de células de mamíferos. El PBS se utiliza para irrigar, lavar y diluir células de mamíferos. La amortiguación de fosfato mantiene el pH en el rango fisiológico
TC-Platte 6 pozos, Cell+,FSarstedt833,920,300Es una superficie de crecimiento para células adherentes
Matraz para cultivo de tejidos T-25,Cell+,Vented CapSarstedt833,910,302Matraz para cultivo de tejidos T-25, poliestireno, Cell+ superficie de crecimiento para células adherentes sensibles, por ejemplo, células primarias, cuello inclinado, tapón de ventilación, amarillo, estéril, libre de pirógenos, no citotóxico, 10 uds./bolsa
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Tensioactivo no iónico ampliamente utilizado para la recuperación de componentes de membrana en condiciones leves no desnaturalizantes
Tripsina-EDTA EuroclonECB3052D La tripsina escindirá los péptidos en el lado C-terminal de los residuos de aminoácidos de lisina y arginina. La tripsina se utiliza para eliminar las células adherentes de una superficie de cultivo
TuboSarstedt62.554.502Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000Ofrece una protección total para el medio ambiente y el trabajador
ZEISS Axio Vert.A1 – Invertido  El microscopioZeiss 3849000962ZEISS Axio Vert.A1 ofrece un precio de nivel de entrada único y puede proporcionar todas las técnicas de contraste, incluyendo campo claro, contraste de fase, PlasDIC, VAREL, contraste de modulación de Hoffman mejorado (iHMC), DIC y fluorescencia. Incorpore iluminación LED para obtener imágenes suaves de células marcadas con fluorescencia. Axio Vert.A1 está diseñado ergonómicamente para el trabajo rutinario y es lo suficientemente compacto como para colocarse dentro de campanas de cultivo de tejidos.
, .El

Referencias

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Aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación Neuronal de células madre de pulpa Dental humana
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