Colorimétrico análisis de alcalina fosfatasa actividad biofilm de S. aureus

Resumen

En este manuscrito, hemos establecido un método de alto rendimiento para cuantificar la actividad de la fosfatasa alcalina en la cultura de biofilm de S. aureus de placa de 96 pocillos cultivo de tejido

Resumen

Fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima común expresada en las células procariotas y eucariotas. Cataliza la hidrólisis de Monoésteres de fosfato de muchas moléculas en pH básico y juega un papel indispensable en el metabolismo del fosfato. En los seres humanos, ALP eucariota es una de las señales enzimáticas más frecuente en el diagnóstico de varias enfermedades, tales como colestasis y raquitismo. En S. aureus, ALP se detecta exclusivamente en la membrana de la célula; también se expresa como forma secretora. Sin embargo, poco se sabe sobre su función en la formación de biopelículas.

El objetivo de este manuscrito es desarrollar un análisis rápido y fiable para medir la actividad ALP en biofilm de S. aureus que no requiere aislamiento de proteínas. Utilizando p-nitrofenil fosfato (pNFF) como sustrato, se evaluó la actividad ALP en biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Actividad se basa en la formación del producto de la reacción soluble midiendo absorbancia nm 405. La naturaleza de alto rendimiento del método de placa de 96 bien cultura de tejido proporciona un método sensible y reproducible para ensayos de actividad de la ALP. La misma experimental establecido puede ampliarse también para medir otros marcadores moleculares extracelulares relacionadas con la formación de biopelículas.

Introducción

Fosfatasa alcalina (ALP) ubicuo se expresa en tanto de células procariotas y eucariotas¹. Puede catalizar la hidrólisis de monofosfato de diferentes moléculas como nucleótidos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato y anhídridos del ácido fosfórico. En los seres humanos, ALP eucariota está presente en muchos tejidos incluyendo el hígado, hueso, intestino y placenta². Juega un papel importante en la fosforilación de proteínas, crecimiento de la célula, apoptosis, la célula de vástago procesos así como mineralización esquelética normal. ALP eucariota es también un indicador clave del suero para la presencia de enfermedades en huesos, hígado y otros tejidos/órganos cuando elevada^3,4.

ALP procariota se ha detectado en una variedad de células bacterianas, incluyendo⁵de e. coli, S. aureus^6,7 y algunas bacterias de rumen común en los suelos⁸. Actividad de fosfatasa alcalina bacteriana ha sido utilizado como un biosensor en la detección de pesticidas, metales pesados⁹ y¹⁰de contaminación bacteriana. La expresión constitutiva de ALP se ha utilizado para identificar estafilococos¹¹ y diferenciar Serratia de Enterobacter¹². Se sugirió que la producción constitutiva de ALP está correlacionado con patogenicidad en estafilococos¹³. Aunque ALP ha sido estudiado en diferentes configuraciones^3,4, sin embargo, poco se divulga para su actividad y función en las culturas de los biofilms.

El biofilm se ha documentado para tener una diferente funcionamiento vida bacteriana en comparación con su contraparte de célula bacteriana libre-que viven¹⁴. En S. aureus, la formación de biofilm se ha identificado en una variedad de condiciones clínicas y representa la resistencia a los antibióticos y la inflamación crónica^15,16. Muchas moléculas habían sido divulgadas en una matriz de la biopelícula como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, pero el mecanismo de formación de biofilm no es completamente entendido¹⁴. Para entender el papel de ALP en la formación de biopelículas, cultivadas de biopelículas de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96 y mide la actividad de fosfatasa alcalina usando para-nitrophenylphosphate (pNFF).

La molécula pNFF está lista para usar sustrato para fosfatasa alcalina y ha sido ampliamente utilizado para medir la actividad ALP^6,17,18. Este ensayo colorimétrico se basa en la conversión para-nitrofenil fosfato (pNFF) de para-nitrofenol resultando en un producto coloreado a 405 nm. En comparación con otros análisis de fosfatasa alcalina convencional, tales como gel de agarosa electroforesis¹⁹, precipitación de (WGA) de la aglutinina de germen de trigo, y WGA-HPLC²⁰, este análisis es altamente específico, sensible, fácil de reproducir y más importante, permite la alta rendimiento de procesamiento.

Protocolo

1. medio preparación

1. Preparar 1 L de caldo de soja tríptica (TSB): en 1 L de agua destilada, agregar 15 g de digerido pancreático de caseína, 5 g de papaic recopilación de harina de soja, 3 g de cloruro sódico, 2,5 g de dextrosa y 2.5 g de fosfato dipotásico. Esterilizar antes de uso.
2. Para Agar peptona de soja (TSA), añadir 15 g de agar en 1 L de TSB, autoclave. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente. A continuación, vierta en una proporción de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).
3. Medio de cultivo de biofilm: Añadir 10 g de glucosa a 1 L de esterilizado TSB. Esterilizar por filtración usando un filtro de 0.2 μm.

2. formación del Biofilm de S. aureus en placa de cultivo de tejidos bien 96

Nota: El biofilm de S. aureus se cultiva como se describió anteriormente^6,21.

1. Inocular una colonia individual de S. aureus de TSA en 10 mL de TSB y crecer durante la noche a 37 ° C.
2. Diluir la cultura durante la noche en 10 mL de TSB/glucosa (10 g/L) en una proporción de 1: 100 (v/v). Vórtice suavemente a la mezcla para una concentración constante.
3. Transferir 200 mL de cultura diluida en un total de 18 pozos (más para los grupos experimentales, tal control de biofilm no para sugerir una relación con la actividad ALP⁶) de una 96 placa bien. Uso de tríos para cada momento: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min. Consulte el paso 3.2.
4. Incube la placa bien 96 a 37 ° C durante 24 h para la formación de biofilm^6,21.
5. Decantar el sobrenadante por aspiración.
6. Lave cada uno con 1 x solución de tampón fosfato (PBS, pH 7,4), centrifugar durante 5 min a 15.000 x g y decantar el sobrenadante por aspiración.

3. medición de la actividad ALP en Biofilm de S. aureus

Nota: Actividad de la ALP se midió como descrito^6,18.

1. Añadir 75 mL de tampón substrato ALP consisten pNFF disponible en el mercado para cada bien del paso 2.6 y comenzar el tiempo de grabación. Registrar cada momento por triplicado.
2. Después de la incubación durante un tiempo variado: min 0 (control), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min respectivamente, añaden 75 μl de NaOH 5 de M para detener la reacción.
3. Centrifugar la placa por 5 min a 15.000 x g.
4. Transferir 100 μl de sobrenadante a un nuevo plato bien 96 para medición colorimétrica.
5. Medir la absorbancia de cada bien a 405 nm usando un 96 bien placa de lector. Utilizar el tiempo de 0 min punto de pozos para control de ruido de fondo de 405 nm.
6. Repetir todo el experimento en tres platos bien 96 individuales.

Resultados

La figura 1 muestra un resultado representativo de la actividad de la ALP de culturas de biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96. 75 μL de solución de pNFF comercialmente disponibles se añadió a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente. Después de la incubación para diferentes tiempos (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min, respectivamente) 75 μL de NaOH M 5 fue agregado para detener la reacción. El producto entonces...

Discusión

En nuestro análisis, hemos utilizado pNFF como el sustrato de la fosfatasa alcalina. Se trata de una solución de trabajo diseñada para ELISA y dilución no es necesario. Después de la hidrólisis por ALP, un producto amarillo se desarrolla y puede ser medido a 405 nm. Al final de la reacción enzimática, brevemente se centrifugó la placa bien 96 y transfirió el sobrenadante a un plato bien 96 fresco para medir absorbancia con el lector. Se encontró que este paso de centrifugado extra es crítica, puesto que aumenta la consis...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	VWR	9002-18-0
Centrífuga Eppendorf	Thomas Scientific	5810
Gluosa	VWR	50-99-7
Pellets de NaOH	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrofenilfosfato (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Las concentraciones típicas de sustratos líquidos de pNPP, a menudo utilizados en ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA), oscilan entre 10 y 50 mM. Al igual que la mayoría de los sustratos líquidos de pNPP listos para usar, como el que se usa aquí, la concentración exacta de pNPP no se revela debido a su naturaleza patentada.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Lector de placas	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Agar de soja tríptico            15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
Caldo de soja tríptico:          g/L Digestión pancreática de caseína............ 15.0 Compendio Papático de Harina de Soja......... 5.00 Cloruro de sodio.............................. 3.00 Dextrosa........................................   2.50 Fosfato dipotásico.................. 2.50	VWR	90006-098
Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos	BD	6902D09	Fondo en forma de U