Colorimétrico análisis de alcalina fosfatasa actividad biofilm de S. aureus

Resumen

En este manuscrito, hemos establecido un método de alto rendimiento para cuantificar la actividad de la fosfatasa alcalina en la cultura de biofilm de S. aureus de placa de 96 pocillos cultivo de tejido

Resumen

Fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima común expresada en las células procariotas y eucariotas. Cataliza la hidrólisis de Monoésteres de fosfato de muchas moléculas en pH básico y juega un papel indispensable en el metabolismo del fosfato. En los seres humanos, ALP eucariota es una de las señales enzimáticas más frecuente en el diagnóstico de varias enfermedades, tales como colestasis y raquitismo. En S. aureus, ALP se detecta exclusivamente en la membrana de la célula; también se expresa como forma secretora. Sin embargo, poco se sabe sobre su función en la formación de biopelículas.

El objetivo de este manuscrito es desarrollar un análisis rápido y fiable para medir la actividad ALP en biofilm de S. aureus que no requiere aislamiento de proteínas. Utilizando p-nitrofenil fosfato (pNFF) como sustrato, se evaluó la actividad ALP en biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Actividad se basa en la formación del producto de la reacción soluble midiendo absorbancia nm 405. La naturaleza de alto rendimiento del método de placa de 96 bien cultura de tejido proporciona un método sensible y reproducible para ensayos de actividad de la ALP. La misma experimental establecido puede ampliarse también para medir otros marcadores moleculares extracelulares relacionadas con la formación de biopelículas.

Introducción

Fosfatasa alcalina (ALP) ubicuo se expresa en tanto de células procariotas y eucariotas¹. Puede catalizar la hidrólisis de monofosfato de diferentes moléculas como nucleótidos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato y anhídridos del ácido fosfórico. En los seres humanos, ALP eucariota está presente en muchos tejidos incluyendo el hígado, hueso, intestino y placenta². Juega un papel importante en la fosforilación de proteínas, crecimiento de la célula, apoptosis, la célula de vástago procesos así como mineralización esquelética normal. ALP eucariota es también un indicador clave del suero para la presencia de enfermeda....

Protocolo

1. medio preparación

1. Preparar 1 L de caldo de soja tríptica (TSB): en 1 L de agua destilada, agregar 15 g de digerido pancreático de caseína, 5 g de papaic recopilación de harina de soja, 3 g de cloruro sódico, 2,5 g de dextrosa y 2.5 g de fosfato dipotásico. Esterilizar antes de uso.
2. Para Agar peptona de soja (TSA), añadir 15 g de agar en 1 L de TSB, autoclave. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente. A continuación, vierta en una proporción de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).
3. Medio de cultivo de biofilm: Añadir 10 g de glucosa a 1 L de esterilizado TSB. Esterilizar por filtración usando un filtro de 0.2 μm.

Resultados

La figura 1 muestra un resultado representativo de la actividad de la ALP de culturas de biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96. 75 μL de solución de pNFF comercialmente disponibles se añadió a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente. Después de la incubación para diferentes tiempos (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min, respectivamente) 75 μL de NaOH M 5 fue agregado para detener la reacción. El producto entonces.......

Discusión

En nuestro análisis, hemos utilizado pNFF como el sustrato de la fosfatasa alcalina. Se trata de una solución de trabajo diseñada para ELISA y dilución no es necesario. Después de la hidrólisis por ALP, un producto amarillo se desarrolla y puede ser medido a 405 nm. Al final de la reacción enzimática, brevemente se centrifugó la placa bien 96 y transfirió el sobrenadante a un plato bien 96 fresco para medir absorbancia con el lector. Se encontró que este paso de centrifugado extra es crítica, puesto que aumenta la consis.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	VWR	9002-18-0
Centrífuga Eppendorf	Thomas Scientific	5810
Gluosa	VWR	50-99-7
Pellets de NaOH	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrofenilfosfato (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Las concentraciones típicas de sustratos líquidos de pNPP, a menudo utilizados en ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA), oscilan entre 10 y 50 mM. Al igual que la mayoría de los sustratos líquidos de pNPP listos para usar, como el que se usa aquí, la concentración exacta de pNPP no se revela debido a su naturaleza patentada.
10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Lector de placas	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Agar de soja tríptico            15 g/L TSB	VWR	9002-18-0
Caldo de soja tríptico:          g/L Digestión pancreática de caseína............ 15.0 Compendio Papático de Harina de Soja......... 5.00 Cloruro de sodio.............................. 3.00 Dextrosa........................................   2.50 Fosfato dipotásico.................. 2.50	VWR	90006-098
Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos	BD	6902D09	Fondo en forma de U