En Vivo Microscopía bicolor tridimensional para estudiar las respuestas vasculares realizadas por la eyección ATP local utilizando una micro-pipette de vidrio

Resumen

Presentamos un procedimiento de eyección local optimizado utilizando una micropipeta de vidrio y un método rápido de imagen hiperpila de dos fotones, que permite la medición precisa de los cambios de diámetro capilar y la investigación de su regulación en tres dimensiones.

Resumen

El mantenimiento de la función cerebral normal requiere un suministro suficiente y eficiente de oxígeno y nutrición por una compleja red de vasos. Sin embargo, la regulación del flujo sanguíneo cerebral (CBF) se entiende incompletamente, especialmente a nivel capilar. La microscopía de dos fotones es una poderosa herramienta ampliamente utilizada para estudiar CBF y su regulación. Actualmente, este campo está limitado por la falta de estudios in vivo sin microscopía de dos fotones que examinen (1) las respuestas de la CBF en tres dimensiones, (2) las respuestas vasculares realizadas y (3) las intervenciones localizadas dentro de la red vascular. Aquí, describimos un método 3D in vivo usando microscopía de dos fotones para estudiar las respuestas vasculares realizadas provocadas por la eyección local de ATP con una micro-pipeta de vidrio. Nuestro método utiliza imágenes rápidas y repetitivas de dos fotones hiperpila que proporcionan mediciones precisas de diámetro mediante la proyección de intensidad máxima de las imágenes obtenidas. Además, demostramos que este método también se puede utilizar para estudiar las respuestas astrocíticas de calcio 3D. También discutimos las ventajas y limitaciones de la inserción de micropipetas de vidrio y la imagen de hiperpila de dos fotones.

Introducción

El cerebro tiene una alta tasa de consumo de energía. Alrededor del 20% del oxígeno y el 25% de la glucosa consumida por el cuerpo humano se dedican a la función cerebral, mientras que el cerebro sólo ocupa el 2% de la masa corporal total. El mantenimiento de la función cerebral normal requiere un suministro suficiente y eficiente de oxígeno y nutrición por flujo sanguíneo en una compleja red de vasos. La actividad cerebral local y el flujo sanguíneo cerebral (CBF) están estrechamente acoplados, dependiendo de las propiedades funcionales de las neuronas, astrocitos, pericitos, células musculares lisas (SCD) y células endoteliales (ECs)¹. Recien....

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con animales fueron aprobados por el Comité Nacional de Ética de Danés de acuerdo con las directrices establecidas en el Convenio del Consejo Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados Utilizados con Fines Experimentales y Otros Fines Científicos y cumplieron con las directrices de ARRIVE. Este es un procedimiento terminal con los ratones eutanasiados antes de la recuperación anestésica.

1. Preparación prequirúrgica

1. Limpie la mesa quirúrgica y todo el área circundante con 70% de etanol. Limpie y seque completamente las herramientas quirúrgicas antes de ....

Resultados

Una vez completada la cirugía, los ratones fueron transportados al microscopio de dos fotones (Figura1A). Se insertó una micropipe de vidrio que contenía 1 mM de ATP cerca del vaso sanguíneo de destino en la ubicación objetivo (Figura1B).

Realizamos imágenes de hiperpila mientras dabamos una bocanada de 1 mM ATP (Figura2A,Video Suplementario 1

Discusión

Un desafío para los estudios vasculares es la medición precisa de los diámetros de los vasos. El método que describimos aquí utilizó un objetivo piezoeléctrico motorizado para crear imágenes hiperapiladas rápidas y repetitivas mediante microscopía de dos fotones. En primer lugar, este método permite exámenes repetidos de la arteriola penetrante, 1o orden y 2o orden capilares sin pérdida de enfoque y condujo al descubrimiento de respuestas vasculares lentamente realizadas en capilares in vivo. En seg.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa	Sigma – Aldrich	A6138	Aplicar sobre la corteza expuesta para protección
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Compuesto de hinchazón de manchas a color rojo fluorescente
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilatador y vasoconstrictor, compuesto de inhalación
Pegamento y activador de cianoacrilato	Adhesivos Loctite	y pegamento SF7452	para piezas de metal y cubreobjetos
Ojo lubricante	Neutro Ofta, Ophtha A/S, Dinamarca		Mantenga los ojos de ratón humectados
FITC-dextrano	Sigma-Aldrich	FD500S	Colorante de suero sanguíneo, color verde fluorescente
NG2DsRatones	Jackson Laboratory	8241	Estos ratones transgénicos expresan una variante de proteína fluorescente roja (DsRed) bajo el control del promotor NG2 (Cspg4)
de ratón pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Vectores virales específicos de astrocitos portadores de indicadores de calcio codificados genéticamente
TRITC-dextrano	Sigma-Aldrich	52194	Colorante de suero sanguíneo, color fluorescente rojo
Lista de equipos
Bomba de aire	WPI	PV830	Dar presión de aire a la pipeta de soplado Analizador
gases en sangre	Radiómetro	ABL 700	Medir los niveles de gases en sangre
Monitor de presión arterial	World Precision Instruments	BP-1	Monitor de presión arterial aterial
Controlador de temperatura corporal	CWE	Modelo TC-1000	Mantenga la temperatura corporal del ratón en el rango fisiológico
Capnógrafo	Harvard Apparatus	Type 340	Monitoree el CO2 final de la espiración
del mouse Estimulador eléctrico	A.M.P.I.	ISO-flex	Aplicar estimulación de la almohadilla de bigotes
Ventilador mecánico	Harvard Apparatus	D-79232	Ventilar mecánicamente el ratón en el rango fisiológico
Tirador de micropipetas	Sutter Instrument	P-97
Microscopio de dos fotones	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
strong>Lista de instrumentos quirúrgicos
Pinza anatómica	Lawton	09-0007
Pinza angulada y equilibrada	S& T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Tijera de iris	Lawton	05-1450
Pinza microvascular	S& T AG	462
Catéteres vasculares para ratones	Verutech	100828