Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.
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Artículo de método
Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent
En este artículo
Resumen
Resumen
La piel es el órgano más grande del cuerpo y tiene muchas funciones. La piel actúa como barrera física y protector del cuerpo y regula las funciones corporales. Biomimética es la imitación de los modelos, sistemas y elementos de la naturaleza con el fin de resolver problemas humanos complejos1. Biomimética de la piel es una herramienta útil para la medicina regenerativa in vivo y in vitro investigación. Las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSCs) tienen la característica de la proliferación ilimitada y la capacidad de diferenciación de tres capas germinales. IPSCs humanos se generan de varias células primarias, como las células sanguíneas, queratinocitos, fibroblastos y más. Entre ellos, células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) han emergido como una fuente alternativa de la célula desde la perspectiva de la medicina regenerativa allogeneic. CBMCs son útiles en medicina regenerativa porque leucocito humano antígeno (HLA) escribir es esencial para la célula del sistema bancario. Nos proporcionan un método para la diferenciación de CBMC-iPSCs en queratinocitos y los fibroblastos y para la generación de un organoide de piel 3D. Fibroblastos y queratinocitos derivados de iPSC CBMC tienen características similares a una línea celular primaria. Los organoides de la piel 3D se generan superponiendo una capa epidérmica en una capa dérmica. Mediante el trasplante de este organoide 3D de la piel, se genera un modelo de ratones humanizados. Este estudio demuestra que un organoide de piel derivado de iPSC humana 3D puede ser una herramienta novedosa, la alternativa para la investigación dermatológica in vitro e in vivo.
Introducción
La piel cubre la superficie exterior del cuerpo y protege órganos internos. La piel tiene varias funciones, incluyendo la protección contra patógenos, absorber y almacenar agua, regular la temperatura del cuerpo y excretar el cuerpo de residuos2. Injertos de piel se pueden clasificar dependiendo de la fuente de la piel; injertos con piel de otro donante se denominan aloinjertos e injertos utilizando la piel del propio paciente son autoinjertos. Aunque un autoinjerto es el tratamiento preferido debido a su riesgo de rechazo baja, biopsias de la piel son difíciles de realizar en pacientes con lesiones severas o un número insuficiente de células d....
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran animales fueron realizados conforme a la ley de bienestar de animales de laboratorio, la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y las directrices y políticas para la experimentación de roedor proporcionan por el cuidado institucional de Animal y Uso (IACUC) Comité de la escuela de medicina de la Universidad Católica de Corea. El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (CUMC-2018-0191-01). La IACUC y el Departamento de animales laboratorio (DOLA) de la Universidad Católica de Corea, Songeui Campus acreditado la instalación de laboratorio de Corea....
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Resultados
Piel se compone, en su mayor parte, de la epidermis y la dermis. Queratinocitos son el tipo principal de célula de la epidermis, y los fibroblastos son el tipo principal de célula de la dermis. En figura 1se muestra el esquema de la diferenciación del keratinocyte. CBMC-iPCSc se mantuvieron en un plato cubierto de vitronectina (figura 1B). En este estudio, hemos diferenciado CBMC-iPSCs en queratinocitos y fibroblastos con formac.......
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Discusión
IPSCs humanas se han sugerido como una nueva alternativa para la medicina regenerativa personalizada17. Derivados del paciente personalizados iPSCs reflejan características de los pacientes que pueden utilizarse para el modelado de enfermedades, detección de drogas y trasplante autólogo18,19. El uso de iPSCs derivados del paciente también puede superar problemas con respecto a células primarias, la falta de un número adecuado de células y .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Corea salud tecnología R & D proyectos, Ministerio de sanidad, bienestar y familia, República de Corea (H16C2177, H18C1178).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Adenina | Sigma | A2786 | Componente del medio de diferenciación para fibroblastos |
| Medio AggreWell (medio de formación EB) | STEMCELL | 05893 | |
| Formación EB Anticuerpo anti-fibronectina | abcam | ab23750 | Marcador de fibroblastos |
| Anticuerpo anti-KRT14 | abcam | ab7800 | Marcador de queratinocitos |
| Anticuerpo anti-Loricrina | abcam | ab85679 | Marcador de estrato córneo |
| Anticuerpo anti-p63 | abcam | ab124762 | Marcador de queratinocitos |
| Anticuerpo anti-Vimentina | Santa cruz | sc-7558 | Marcador de fibroblastos |
| BAND AID TEJIDO FLEXIBLE | Johnson & | Johnson-Bandage | |
| Matriz de membrana basal (Matrigel) | BD | 354277 | Componente del medio de diferenciación para fibroblastos |
| BLACK SILK sutura | AILEEE | SK617 | Injerto de piel |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Componente del medio epitelial para organoide cutáneo 3D |
| Colágeno tipo I | BD | 354236 | organoide |
| cutáneo 3DColágeno tipo IV | Santa-cruz | sc-29010 | Componente del medio de diferenciación para el queratinocito |
| Queratinocitos definidos-Medio libre de suero | Gibco | 10744-019 | Componente del medio de diferenciación para el queratinocito |
| DMEM, | Gibco | 11995065 | Componente del medio de diferenciación |
| DMEM/F12 Medio | Gibco | 11330-032 | Componente de medio de diferenciación |
| Medio Essential 8 | Medio Gibco | A1517001 | iPSC medio |
| FBS, Calificado | Corning | 35-015-CV | Componente del medio de diferenciación para fibroblastos y queratinocitos |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Componente del medio de diferenciación para fibroblastos |
| Insulina | Invtrogen | 12585-014 | Componente del medio de diferenciación para fibroblastos y queratinocitos |
| Tijera curva estándar Iris | Professional | PC-02.10 | Instrumental quirúrgico |
| Queratinocitos Medio libre de suero | Gibco | 17005-042 | Componente del medio de diferenciación para queratinocitos |
| ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio sal hidrato | Sigma | A8960 | Componente del medio de diferenciación para el queratinocito |
| MEM Aminoácido no esencial | Gibco | 1140050 | Componente del medio de diferenciación para fibroblastos |
| Pinza Meriam Pulgar 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Instrumento quirúrgico |
| NOD. CB17-Prkdc SCID/J | El Laboratorio Jackson 001303 | Cepa de ratones para injerto de piel | |
| Placa de Petri 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Artículos de plástico |
| Recombinante Humano BMP-4 | R& D | 314-BP | Componente del medio de diferenciación para queratinocitos |
| Proteína EGF humana recombinante | R& D | 236-EG | Componente del medio de diferenciación para queratinocitos |
| Ácido retinoico | Sigma | R2625 | Componente del medio de diferenciación para queratinocitos |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Artículos de plástico |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Componente del medio epitelial para el organoide de la piel 3D |
| Insertos de membrana recubiertos de colágeno Transwell-COL& nbsp; | Corning | CLS3492 | Artículos de plástico para organoides de piel 3D |
| Vitronectina | Tecnologías de la vida | A14700 | Cultivo iPSC |
| Y-27632 Clorhidrato de | dihidro peprotech | 1293823 | cultivo iPSC |
Referencias
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epiderm....
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Reimpresiones y permisos
