La estabilidad térmica de la actividad enzimática se mide fácilmente por calorimetría isoterma de titulación (ITC). Ensayos de estabilidad de la proteína la mayoría actualmente utilizan medir proteína despliegue, pero no proporcionan información sobre la actividad enzimática. CCI permite la determinación directa del efecto de las modificaciones de la enzima sobre la estabilidad de la actividad enzimática.
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Artículo de método
Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación
En este artículo
Resumen
Resumen
Este trabajo demuestra un nuevo método para medir la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). La tasa pico de calor observada después de una sola inyección de la solución sustrato en una solución de enzima se correlaciona con la actividad enzimática. Múltiples inyecciones de sustrato en la misma solución de enzima con el tiempo muestran la pérdida de actividad enzimática. El ensayo tiene carácter autónomo, que requiere muy poco tiempo de personal y es aplicable a la mayoría de los medios de comunicación y las enzimas.
Introducción
Las enzimas son proteínas capaces de catalizar una amplia variedad de reacciones orgánicas. Función de más enzimas en solución acuosa a cerca de pH neutro, evitando el uso de solventes agresivos. Debido a su alta selectividad, enzima catalizado reacciones producen menos (en algunos casos ningunos subproductos) subproductos de catalizadores no selectivos tales como ácidos y bases1. Esto es especialmente relevante en la fabricación de alimentos en todas las reacciones químicas deben hacerse para que el producto final es seguro para el consumo humano. Actualmente, se utilizan enzimas para producir jarabe de maíz de alta fructosa2....
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Protocolo
1. preparación de muestras
-
1.000 mL de tampón de acetato de sodio de 0.1 M a pH 4.6
- Medir 800 mL de agua destilada en un matraz aforado de 1.000 mL.
- Peso 8,2 g de acetato de sodio anhidro y añadir en el vaso.
- Coloque el vaso en una placa de agitación, colocar una varilla de agitación en el vaso, encienda la placa de agitación y revuelva hasta que se disuelva completamente.
- Cuando se haya disuelto completamente el acetato de sodio anhidro, medir el pH de la solución con un medidor de pH calibrado.
- Añadir 1 M HCl o NaOH por lo tanto para obtener el pH deseado de 4.6.
- Añadir agua....
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Resultados
Los resultados representativos figura 1 y figura 5 muestran los datos de dos enzimas, lactasa e invertasa. Lactasa e invertasa catalizan la hidrólisis de un disacárido en dos monosacáridos, endothermically y exotérmico, respectivamente. Ambas reacciones enzimáticas fueron funcionadas en concentraciones que impiden la saturación de la enzima.
Los datos de lactasa demuestran cómo datos ITC pueden utilizarse para estimar la estabilidad d.......
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Discusión
Una gran ventaja del análisis de estabilidad de enzima ITC descrito aquí es la automatización. Una vez todos los buffers adecuados y soluciones, el tiempo de cada ensayo es aproximadamente 15 minutos para la persona que realiza el ensayo. Por el contrario, los ensayos convencionales para la actividad de la invertasa y la lactasa requieren aproximadamente 2 horas con la participación continua de la persona que realiza el ensayo y muchos ensayos de actividad enzimática toman mucho más trabajo. En una publicación anterior, .......
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| a-Lactosa | Fisher Scientific | desconocido (demasiado viejo) | 500g |
| Acetato de Sodio, Anhidro 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactasa | MP Bio | 100780 | 5g |
| Solución de ácido hidrocólico, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 Medidor de | 500 ml |
| - pH | VWR | 89231-622 | |
| Etanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | |
| Micro-90 de | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (solución de limpieza) |
Referencias
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn S....
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Reimpresiones y permisos
