Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación

Resumen

La estabilidad térmica de la actividad enzimática se mide fácilmente por calorimetría isoterma de titulación (ITC). Ensayos de estabilidad de la proteína la mayoría actualmente utilizan medir proteína despliegue, pero no proporcionan información sobre la actividad enzimática. CCI permite la determinación directa del efecto de las modificaciones de la enzima sobre la estabilidad de la actividad enzimática.

Resumen

Este trabajo demuestra un nuevo método para medir la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). La tasa pico de calor observada después de una sola inyección de la solución sustrato en una solución de enzima se correlaciona con la actividad enzimática. Múltiples inyecciones de sustrato en la misma solución de enzima con el tiempo muestran la pérdida de actividad enzimática. El ensayo tiene carácter autónomo, que requiere muy poco tiempo de personal y es aplicable a la mayoría de los medios de comunicación y las enzimas.

Introducción

Las enzimas son proteínas capaces de catalizar una amplia variedad de reacciones orgánicas. Función de más enzimas en solución acuosa a cerca de pH neutro, evitando el uso de solventes agresivos. Debido a su alta selectividad, enzima catalizado reacciones producen menos (en algunos casos ningunos subproductos) subproductos de catalizadores no selectivos tales como ácidos y bases¹. Esto es especialmente relevante en la fabricación de alimentos en todas las reacciones químicas deben hacerse para que el producto final es seguro para el consumo humano. Actualmente, se utilizan enzimas para producir jarabe de maíz de alta fructosa²,³de queso, cerveza⁴, leche sin lactosa⁵y otros productos alimentarios importantes. Aunque este trabajo se centra en el uso de enzimas en la industria de alimentos, hay muchos otros usos para las enzimas incluidas en síntesis química y de la droga verde.

La utilidad de las enzimas es limitada por la estabilidad de la actividad enzimática, que depende del mantenimiento de la estructura tridimensional de la enzima. La estructura de la enzima puede ser estabilizada por modificaciones como pegilación⁶, inmovilización en un soporte sólido⁷modificaciones genéticas⁸y formulaciones. En la actualidad, estabilidad de la enzima por lo general se mide por calorimetría diferencial de barrido (DSC) y ensayos de actividad enzimática de extremo⁹. DSC mide la temperatura a la que se desarrolla una enzima; a mayor temperatura, más estable la estructura. Sin embargo, la pérdida de actividad ocurre a menudo en una temperatura más baja que se requiere para desplegar la enzima o dominios dentro de la enzima¹⁰. Por lo tanto, DSC no es suficiente para determinar si una modificación de la enzima aumenta la estabilidad de la actividad enzimática. Análisis de enzima de extremo son generalmente intensivos en el tiempo, requieren de múltiples muestras y suelen implican una reacción colorimétrica juntada que no es aplicable a soluciones muy coloreadas u opacas o suspensiones.

Este trabajo muestra un método para la medición directa de la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). CCI mide la tasa de calor liberado o absorbido durante el curso de una reacción. Puesto que casi todas las reacciones producen o absorben calor, ITC puede utilizarse para la mayoría de las reacciones catalizadas por enzima, incluyen reacciones que no tienen una reacción acoplada o se producen en medios opacos como la leche. ITC se ha utilizado por muchas décadas para medir parámetros cinéticos químicos para muchos tipos de reacciones, pero el protocolo que presentamos se centra en el uso de TIC para medir la tasa máxima de calor de las reacciones enzima-catalizadas y demuestra que la actividad enzimática es linealmente correlacionada con la tasa máxima de calor. ITC las medidas de tasas de máximo calor en su mayoría son autónomas y requieren de muy poco tiempo personal para configurar y analizar.

Protocolo

1. preparación de muestras

1. 1.000 mL de tampón de acetato de sodio de 0.1 M a pH 4.6
   1. Medir 800 mL de agua destilada en un matraz aforado de 1.000 mL.
   2. Peso 8,2 g de acetato de sodio anhidro y añadir en el vaso.
   3. Coloque el vaso en una placa de agitación, colocar una varilla de agitación en el vaso, encienda la placa de agitación y revuelva hasta que se disuelva completamente.
   4. Cuando se haya disuelto completamente el acetato de sodio anhidro, medir el pH de la solución con un medidor de pH calibrado.
   5. Añadir 1 M HCl o NaOH por lo tanto para obtener el pH deseado de 4.6.
   6. Añadir agua destilada hasta el volumen total es de 1.000 mL.
   7. Almacenar a temperatura ambiente hasta su uso.
2. Solución de enzima
   1. Preparar 10 mL de la botella de solución dentro de la gama 10-30 mg/mL por primera medición 8 mL del 0,1 M sodio acetato buffer pH 4.6 de 15 mL graduado de enzima.
   2. Añadir la solución tampón en un tubo cónico de 15 mL con enzima y agite vigorosamente hasta que la enzima se haya disuelto.
   3. Agregue una solución búfer más hasta que el volumen total es de 10 mL.
   4. Almacenar la solución de enzima a 4 ° C hasta su uso.
3. Solución de sustrato
   1. Para preparar una solución de sustrato dentro de la gama de 300-600 mM, calcular la cantidad de sustrato necesario en gramos para hacer la concentración deseada.
   2. Pesar el sustrato y colocar en un vaso de precipitados de 100 mL vidrio
   3. Medir 20 mL de la solución tampón utilizando un cilindro aforado de 25 mL y añada en el vaso de vidrio.
   4. Coloque el vaso en una placa de agitación y coloque una varilla de agitación magnética en el vaso. Encender la calefacción y ajustar en consecuencia la velocidad de agitación.
   5. Permiten revolviendo para continuar hasta que el sustrato se haya disuelto.
   6. Verter la solución de sustrato en un tubo cónico de 50 mL y agregar 0.1 M sodio tampón de acetato pH 4.6 hasta el volumen total es de 45 mL. Mezclar por agitación.
   7. Almacenar la solución de sustrato a temperatura ambiente hasta su uso.

2. realizar el experimento

1. Preparando el instrumento ITC
   1. Asegúrese de que la celda de referencia está cargada con 350 μl de agua destilada. Antes de cargar la enzima en la célula de la muestra, verificar que la celda de la muestra se haya limpiado.
   2. Limpieza de protocolo-llene la jeringa de carga con 500 μl de solución de limpieza de 2% (Tabla de materiales), Inserte cuidadosamente la aguja en la celda de muestra, llene la celda y Extraiga lentamente el líquido usando la misma jeringa. Deseche el líquido en un vaso de precipitados. Repita este paso dos veces con solución de limpieza de 2% (Tabla de materiales), tres veces con etanol al 70% y luego lavar diez veces con agua destilada.
   3. Llene la jeringa de carga con 450 μl de solución enzimática, cuidadosamente Inserte la aguja hasta el fondo de la celda de muestra y presionar el émbolo hasta la línea μl 100 lentamente para evitar la formación de burbujas de aire.
   4. Lavar la jeringa de titulación de 50 μL con agua destilada tres veces por colocar la punta de la aguja en el agua poco a poco tomando el agua en la jeringa, luego distribuye el agua en un recipiente de desechos.
   5. Eliminar el agua residual mediante enjuague con solución de sustrato tres veces.
   6. Llene la jeringa de titulación con solución de sustrato mediante la elaboración de la solución hasta que la jeringa está llena sin burbujas de aire.
   7. Con la jeringa en la solución de substrato, saque el émbolo y aproximadamente 2 μl de aire para entrar en la parte superior de la jeringa y vuelva a insertar el émbolo.
   8. Retire la manija de la bureta de la ITC, colocar la jeringa dentro del mango de la bureta y atornille hasta que quede apretado.
   9. Limpie la punta del agitador con una pelusa, luego cuidadosamente coloque el mango de la bureta en el instrumento ITC y trabarlo en su lugar.

3. configuración del ITCrun

1. En el equipo, Abra ITCrun y haga clic en configurar.
2. Revolvimiento de velocidad , haga clic en y a 350 RPM. Compruebe el tamaño de la jeringa (μL) y asegurar que está en 50 μl.
3. La temperatura y pulse Actualizar. Se recomienda que este paso sea realizado por lo menos 1 h antes de preparar la ITC. Esto permite suficiente tiempo para que el instrumento para calentar o enfriar según sea necesario.
4. Para la configuración del experimento, seleccione valoración incremental.
5. Haga clic en Insertar para las inyecciones. Ajustar el intervalo de inyección a 5.400 s, volumen de inyección (μL) 4 y el número de inyecciones a 4. Pulse OK para confirmar la configuración.
6. En el cuadro equilibrado, seleccione Auto-equilibrar y grande espera que calienta. (Si los calores esperados son pequeños, uno puede seleccionar pequeños bajo calores esperados, sin embargo, esto aumentará el tiempo de equilibrado).
7. Establezca la línea de base inicial a 300 s.
8. Para iniciar la ejecución, haga clic en el iniciar símbolo junto a la velocidad de agitación y haga clic en iniciar que se encuentra al lado el símbolo de la llave.
9. Guarde el archivo y que el instrumento a ejecutar.

4. Análisis de datos

1. Abra el archivo en NanoAnalyze. Haga clic en datos y seleccionar columnas de datos.
2. Seleccionar todos los datos, copiar y luego pegar los datos en Microsoft Excel.
3. Ajuste cero basal añadiendo el valor deseado en el 300 s para que sea cero. Esta corrección se aplica a toda la columna de valores de índice de calor.
4. Encontrar el valor mínimo o máximo de la tasa de calor para cada inyección mediante la ecuación: =MIN(cell:cell) o MAX(cell:cell). Cada punto de datos representa la actividad enzimática máxima de la enzima en cada inyección.
5. Trazar gráficos de los valores de MIN o MAX contra el tiempo en que el valor se produjo durante la valoración.

Resultados

Los resultados representativos figura 1 y figura 5 muestran los datos de dos enzimas, lactasa e invertasa. Lactasa e invertasa catalizan la hidrólisis de un disacárido en dos monosacáridos, endothermically y exotérmico, respectivamente. Ambas reacciones enzimáticas fueron funcionadas en concentraciones que impiden la saturación de la enzima.

Los datos de lactasa demuestran cómo datos ITC pueden utilizarse para estimar la estabilidad d...

Discusión

Una gran ventaja del análisis de estabilidad de enzima ITC descrito aquí es la automatización. Una vez todos los buffers adecuados y soluciones, el tiempo de cada ensayo es aproximadamente 15 minutos para la persona que realiza el ensayo. Por el contrario, los ensayos convencionales para la actividad de la invertasa y la lactasa requieren aproximadamente 2 horas con la participación continua de la persona que realiza el ensayo y muchos ensayos de actividad enzimática toman mucho más trabajo. En una publicación anterior, ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
a-Lactosa	Fisher Scientific	desconocido (demasiado viejo)	500g
Acetato de Sodio, Anhidro 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactasa	MP Bio	100780	5g
Solución de ácido hidrocólico, 1N	Fisher Scientific	SA48-500 Medidor de	500 ml
- pH	VWR	89231-622
Etanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL
Micro-90 de	Fisher Scientific	NC024628	1L (solución de limpieza)

sobremesa de 1 galón