Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identifikation af orexin og Endocannabinoide receptorer hos voksne zebrafisk ved hjælp af Immunoperoxidase og immunofluorescens metoder

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Præsenteret her er protokoller for immunhistokemiske karakterisering og lokalisering af orexin peptid, orexin receptorer, og endocannabinoide receptorer i tarmen og hjernen af normale og kost-induceret fedme (Dio) voksne: zebrafisk modeller ved hjælp af immunoperixidase og dobbelte immunofluorescens metoder.

Abstract

Immun histokemi (IHC) er en meget følsom og specifik teknik, der er involveret i påvisning af Target antigener i vævs sektioner med mærkede antistoffer. Det er en MultiStep proces, hvor optimering af hvert trin er afgørende for at opnå det optimale specifikke signal. Gennem IHC kan der påvises distribution og lokalisering af specifikke biomarkører, som afslører oplysninger om evolutionær bevaring. Desuden giver IHC mulighed for at forstå udtryks-og distributions ændringer af biomarkører under patologiske forhold, såsom fedme. IHC, hovedsagelig immunofluorescens teknik, kan anvendes i voksne zebrafisk til at detektere organiseringen og distributionen af phylogenerede molekyler, men en standard IHC-protokol er ikke estasblished. Orexin og endocannabinoide er to meget velbevaret systemer, der er involveret i kontrol af fødeindtagelse og fedme patologi. Rapporteret her er protokoller, der anvendes til at få oplysninger om orexin peptid (oxa), orexin receptor (Ox-2R), og cannabinoid receptor (CB1R) lokalisering og distribution i tarmen og hjernen af normale og kost-induceret fede (Dio) voksne: zebrafisk modeller. Også beskrevet er metoder til immunoperoxydaseteknik og dobbelt immunofluorescens, samt forberedelse af reagenser, fiksering, paraffin-indlejring, og kryoprotektion af zebrafiske væv og forberedelse til en endogen aktivitet-Blokering trin og baggrund modfarvning. Det komplette sæt af parametre er opnået fra tidligere IHC eksperimenter, hvorigennem vi har vist, hvordan immunofluorescens kan hjælpe med forståelsen af oxs, Ox-2R, og CB1R distribution, lokalisering, og bevaring af udtrykket i voksne: zebrafisk Væv. De resulterende billeder med meget specifik signalintensitet førte til bekræftelsen af, at zebrafisk er egnede dyremodeller til immunohistokemiske studier af distribution, lokalisering og evolutionær bevaring af specifikke biomarkører i fysiologiske og patologiske tilstande. De protokoller, der præsenteres her, anbefales til IHC-eksperimenter i voksne zebrafisk.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) er en veletableret klassisk teknik, der anvendes til at identificere cellulære eller vævs komponenter (antigener) ved antigen-antistof interaktion1,2. Det kan bruges til at identificere lokalisering og distribution af målbiomolekyler i et væv. IHC anvender immunologiske og kemiske reaktioner til påvisning af antigener i vævs afsnit3. De vigtigste markører, der anvendes til visualisering af antigen-antistof interaktioner omfatter fluorescerende farvestoffer (immunofluorescens) og enzym-substrat farve reaktioner (immunoperoxidase), både konjugeret til antistoffer4. Brug af mikroskopisk observation er muligt at bestemme lokalisering af mærkede væv, som omtrent svarer til lokalisering af målantigen i vævet.

Der findes to metoder til fluorescerende eller kromogeniske reaktioner til påvisning af protein: den direkte påvisningsmetode, hvor det specifikke primære antistof er direkte mærket; og den indirekte detektionsmetode, hvor det primære antistof er ukonjugeret, mens det sekundære antistof bærer etiketten5,6,7. Den indirekte metode har nogle fordele, som primært er dens signal forstærkning. Desuden, i modsætning til andre molekylære og cellulære teknikker, med immunofluorescens, er det muligt at visualisere fordelingen, lokalisering, og coexpression af to eller flere proteiner differentielt udtrykt i celler og væv7. Valget af den detekterings metode, der anvendes, afhænger af eksperimentelle detaljer.

Til dato, IHC er meget udbredt i grundforskning som et kraftfuldt og vigtigt redskab til at forstå fordelingen og lokalisering af biomarkører og den generelle profilering af forskellige proteiner i biologisk væv fra humane til hvirvelløse dyr8, 9 ud af , 10 stk. , 11. teknikken hjælper med at vise et kort over protein ekspression i et stort antal normale og ændrede dyreorganer og forskellige vævstyper, der viser mulig ned-eller op-regulering af udtryk induceret af fysiologiske og patologiske ændringer. IHC er en meget følsom teknik, der kræver nøjagtighed og det korrekte valg af metoder for at opnå optimale resultater12. Først og fremmest kan mange forskellige faktorer, såsom fiksering, Cross-reaktivitet, antigen hentning, og følsomhed af antistoffer føre til falsk positive og falsk negative signaler13. Udvælgelsen af antistoffer er et af de vigtigste trin i IHC og afhænger af antigen specificiteten og dens affinitet til det protein og de arter, der er omfattet af undersøgelsen7.

For nylig har vi optimeret IHC teknik til at detektere medlemmer af orexin/hypocretin og endocannabinoide systemer i voksne: zebrafisk væv. Vi har primært fokuseret på fiksering, vævs integrering ved hjælp af to forskellige tilgange, skæring og montage (hvilket kan påvirke opløsningen og detaljerne under mikroskopisk analyse) og blokering (for at forhindre falsk positiver og reducere baggrunden)14. Andre vigtige karakteristika er antistof specificitet og selektivitet og reproducerbarhed af individuelle IHC-protokoller. Nøglen til at give antistof specificitet er brugen af negative kontroller (herunder ingen primære antistoffer eller væv, der vides ikke at udtrykke målproteinerne) samt positive kontroller (herunder væv, der er kendt for at udtrykke målproteinerne)15 . Udvælgelsen af antistoffer mod IHC sker på grundlag af deres Arts specificitet (sandsynligheden for, at de reagerer med det antigen, der er af interesse), og de antigen-antistof-bindings detektionssystemer, der anvendes4,5,6 ,7. I tilfælde af immunoperoxidase bestemmes reaktions farven ved valg af det udfællende kromogen, sædvanligvis diaminobenzidin (brun)16. På den anden side, jegmmunofluorescence udnytter antistoffer konjugeret med en fluorophor at visualisere protein udtryk i frosne væv sektioner og giver mulighed for nem analyse af flere proteiner i forhold til det kromogene detekteringssystem 5 ) i , 7. der er

I immunoperoxidaseteknikken er det sekundære antistof konjugeret til biotin, et linker-molekyle, der kan rekruttere et kromogen reporter molekyle [Avidin-biotin Complex (ABC)], hvilket fører til forstærkning af farvnings signalet. Med ABC reporter-metoden reagerer enzymet peroxidase med 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB), hvilket producerer en intenst brunfarvet farvning, hvor enzymet binder sig til det sekundære antistof, som derefter kan analyseres med et almindeligt lysmikroskop. ABC farvning, på grund af den høje affinitet af begærlighed for biotin, producerer en hurtig og optimal reaktion, med få sekundære antistoffer knyttet til stedet for den primære antistof reaktivitet. Denne kromogene detektionsmetode giver mulighed for en densitometrisk analyse af signalet, der giver semi-kvantitative data baseret på korrelationen af brune signal niveauer med protein Expression niveauer18.

Med immunofluorescens teknikker er samtidig påvisning af flere proteiner mulig på grund af forskellige fluorchrominers evne til at udsende lys ved unikke bølgelængder, men det er vigtigt at vælge fluorokromer omhyggeligt for at minimere spektral overlap 5. Desuden minimerer brugen af primære antistoffer i forskellige værtsarter vanskeligheder med hensyn til kryds reaktivitet. I dette tilfælde genkender hvert artsspecifikt sekundært antistof kun én type primær antistof. Fluorescerende reportere er små organiske molekyler, herunder kommercielle derivater, såsom Alexa fluor farvestoffer.

Mange dyremodeller bruges til at forstå særlige fysiologiske og patologiske tilstande. Til dato er det fastslået, at mange metaboliske veje er bevaret i løbet af udviklingen. Derfor kan IHC-studier i modelorganismer såsom zebrafisk give indsigt i tilblivelsen og vedligeholdelsen af patologiske og ikke-patologiske tilstande17. Det er et formål med denne rapport at illustrere IHC protokoller, der kan udføres på voksne zebrafiske væv og anvendes til at opnå detaljerede billeder af distributionen og lokalisering af OXA, OX-2R, og CB1R på perifert og centralt niveau. Også rapporteret er protokoller for anvendelse af to store IHC indirekte metoder i perifert og centralt væv af voksne zebrafish. Beskrevet er den indirekte metode, som giver mulighed for signal forstærkning i tilfælde, hvor et sekundært antistof konjugeres til et fluorescerende farvestof (immunofluorescens metode) eller enzym reporter (immunoperoxidasemetode). Både kromogeniske og fluorescerende detekteringsmetoder besidder fordele og ulemper. Rapporteret i denne protokol er brugen af IHC, hovedsagelig immunofluorescens, i voksne zebrafisk, en dyremodel udbredte til at studere systemer, der er evolutionære bevaret på tværs af forskellige fysiologiske og patologiske betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. immunoperoxidase-protokol

Bemærk: zebrafiskene blev fremstillet af Prof. Omid Safari (Department of Fisheries, Faculty of naturressourcer og miljø, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran)10.

  1. Vævs dissektion
    1. Ofrer zebrafiskene ved nedsænkning i isvand (5 dele is/1 del vand, 4 °C); forlade dem, indtil ophør af alle bevægelser for at sikre døden ved hypoxi.
    2. Fjern hurtigt tarmen og hjernen med følgende dissektionsmetode:
      1. Tør fisken på et papirhåndklæde, og anbring den på en dissekere måtten, der blokerer den ventrale del af øjen soklen og den kødfulde del af halen.
      2. For tarmen: skær huden og forsigtigt fjerne huden og underliggende muskler fra siden af fisken, indtil de indre organer er synlige. Fjern tarmen fra kroppen hulrum strække det ud.
      3. Til hjernen: Fjern hovedet med et barberblad. Fjern blødt væv fra den ventrale side af kraniet med pincet. Åbn kraniet og fjern knoglen fra den ventrale side af hjernen. Fjern huden og kraniet knogler fra Rygsiden af hjernen. Fjern hjernen.
  2. Vævs fiksering
    1. De dissekere væv fastsættes ved nedsænkning i fersk 4% paraformaldeyde (PFA) i fosfatbuffer (PB, pH 7,4, 4 °C) i 3 timer ved stuetemperatur (RT).
      1. Forbered 0,1 M PB ved at opløse 1,755 g af NaH2po4H2O og 4,575 g af Na2HPO4 i 450 ml destilleret vand (DH2O), og Juster til en pH-værdi på 7,4 med den nødvendige mængde NaOH 1N.
      2. 4% PFA opløses 4 g PFA i 100 mL 0,1 M PB (pH 7,4) ved omrøring på en varmeplade. Når en temperatur på 60 °C er nået, tilsættes 2-4 dråber NaOH 1N for at opnå en klar opløsning. Venstre PFA 4% på RT og styre pH. Juster pH-værdien til 7,4.
        Bemærk: vævs fiksering for mere end 4-6 timer kan føre til over binding, som maskerer antigener, begrænser antistof-epitope binding. Fikserings tidspunkt afhænger af vævs størrelse.
  3. Væv indlejring
    1. Skyl vævene 5x for 5 min hver ved nedsænkning i 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Dehydrerer vævet ved efterfølgende nedsænkning i alkohol 70% (6 min.), 80% (6 min.), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min) og 100% (1 min).
    3. Afklare væv ved fordybelse i 100% alkohol: xylen (1:1) i 10 min, derefter 2x i xylen for 5 min hver.
    4. Infiltrere vævet med paraffin (56 °C) to gange i 1 time hver ved direkte nedsænkning i paraffin.
    5. Integrer vævet i paraffinblokke ved stuetemperatur (RT) og opbevares ved RT indtil skæring.
  4. Vævs skæring
    1. Skær væv i koronale eller sagittale sektioner med 8 μm tykkelse med en mikrotom, og saml sektionerne i hver anden serie på klæbe glas slides på vandet og varmet ved 38 °C.
    2. Tør slidene med sektioner ved 37 °C natten over.
  5. Afparaffinisation og rehydratering af vævs sektioner
    1. Afvoks sektionerne ved nedsænkning i xylen i 5 minutter efterfulgt af nedsænkning i xylen i 3 min.
    2. Genhydrat sektionerne ved efterfølgende lysbilleder nedsænkning i alkohol 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), og anbring derefter diasene i dH2O (5 min).
      Bemærk: helt afvoks sektionerne, før reaktionen påbegyndes. Hvis sektionerne stadig har spor af paraffin, skal du udføre en ekstra fordybelse i xylen i 5 minutter eller mere.
  6. Genfinding af antigen
    1. Behandl afsnittene med citratbuffer (0,01 M, pH 6,0) ved at nedsænke diasene i opløsningen og varme i en mikrobølge ovn i 5 minutter ved maksimal effekt.
    2. Lad sektionerne køle af.
    3. Gentag cyklussen af 5 min i mikrobølgeovnen ved maksimal effekt for at fuldføre antigen genfinding.
      1. Der fremstilles citratbuffer (0,01 M, pH 6,0) ved at opløse 2,10 g citronsyre i 100 mL dH2o og 5,882 g natriumcitrat i 200 ml DH2o. Bland natriumcitrat (0,01 m) med citronsyre (0,01 m) ved et 1:4 forhold efter volumen og Indstil pH-værdien til 6 ved hjælp af HCl 0,1 N.
  7. Blokering af endogene peroxidase
    1. Afgrænp vævs området på slidene med en solvens bestandig pen.
    2. Skyl afsnittene 3 gange, 5 min hver med en Tris-Buffered saltvandsopløsning (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. Forbered 0,1 M TBS ved at opløse 12,1 g trizma base og 9 g NaCl i 950 mL dH2O og justér til pH 7,3 med HCL 0,1 n.
    3. Bloker den endogene peroxidase aktivitet ved at glide nedsænkning i en opløsning på 0,75% H2O2 i 5 min ved rt.
      1. Forbered 0,75% H2o2 opløsningen opløse 5 ml 30% h2o2 i 195 ml DH2o.
        Bemærk: ndogenholdige enzymer kan reagere med IHC reagenser og give falsk positive resultater. Desuden, meget vaskulære væv udtrykke mange endogene peroxidase, som kan føre til intens uspecifikke farvning og baggrundsniveauer. Behandling med 0,75% H2O2 slukker endogene peroxidase og reducerer signifikant den uspecifikke baggrund.
  8. Blokering af ikke-specifikke Bindi ng sites og vævs permeabilisering
    1. Vævs afsnittene inkuperes med TBS/0,4% Triton (TBS-T) blokerende buffer, der indeholder det primære antiserum (NRS), i 30 minutter ved RT for at blokere ikke-specifikke bindingssteder.
      1. Forbered 0,4% Triton ved at opløse 0,4 mL Triton X-100 i 100 mL TBS.
      2. Der fremstilles blokerende buffer-TBS-T-opløsning ved at opløse 1% af det normale serum i TBS, der indeholder 0,4% Triton X-100 (1 mL af det normale serum + 8,2 mL TBS + 0,8 mL 0,48 Triton X-100).
        Bemærk: Vælg arten af dyret serum afhængigt af værten for det sekundære antistof (f. eks. Når du bruger et ged anti-kanin sekundært antistof, skal du bruge normalt gede serum).
  9. Vævs inkubation med primært antistof
    1. Delene inkueres i en fugtig æske ved RT med primære antistoffer fortyndet i TBS-T. Plette sektionerne med følgende primære antistof:
      1. Goat antistof mod OX-2R fortyndet 1:200, som genkender C-terminalen af proteinet.
      2. Ged antistof mod OX-A fortyndet 1:200 [orexin-A (C-19)], som genkender C-terminalen af proteinet.
        Bemærk: Sørg for, at det primære antistof reagerer med biomolekyle af interesse. Definer, med hvilken indbegrebet af biomolekyle det primære antistof reagerer ved hjælp af gen-tilpasningen. For eksempel er den Ox-a epitop blevet kortlagt mellem AA 50 – 100 af human Ox-a (O43612), hvorimod Ox-2R epitop er blevet kortlagt nær den sidste 50 AA på C-terminalen af menneske.
  10. Vævs inkubation med sekundært antistof
    1. Skyl sektionerne 3x i 5 min hver med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Der inkubieres afsnittene for 1,5 h ved RT med biotinyleret sekundært antistof og kanin-anti-gede immunglobulin (H + L) konjugeret med biotin, derefter fortyndes 1:100 i TBS-T.
      Bemærk: test og Find de forskellige fortyndinger af både primære og sekundære antistoffer for at finde den optimale fortynding, der giver mulighed for reduktion af baggrunden.
  11. Peroxidase-reaktion
    1. Skyl sektionerne 3x i 5 min hver med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Der inkubieres sektioner med avidin-biotin Complex (ABC) i 1 time.
      1. Forbered ABC-opløsning ved at tilføje to dråber komponent A efterfulgt af to dråber komponent B i 5 mL TBS.
    3. Skyl sektionerne 3x i 5 min hver med 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Behandl afsnittene med kromogen substratet 3, 3 '-diaminobenzidin-4 (DAB).
      1. Forbered DAB-opløsningen ved at tilføje en dråbe (ca. 30 μL) DAB-kromogen koncentrat til 1 mL DAB-fortyndingsvæske og bland godt før brug.
        Bemærk: Forbered ABC-opløsningen mindst 30 min før brug, og opbevar komplekset ved 4 °C, indtil det bruges til at give stabil Avidin/biotin binding. Forbered den friske DAB-arbejds løsning, Anvend på vævs afsnittene, og udvikl indtil farven er passende. Når den kromogene reaktion omdanner epitop steder til en brun farve og intensiteten af signalet er passende for billeddannelse, gå videre til næste trin. Timingen af DAB-udvikling kan variere fra et par sekunder til 10 minutter. For OX-A og OX-2R 1, 2 min er nok. Håndter DAB med forsigtighed, da det er kræftfremkaldende.
  12. Vævs tørring og montering
    1. Skyl alle afsnittene 3x i 5 min hver med 0,1 M TBS (pH 7,3) for at standse DAB-reaktionen.
    2. Dehydrerer sektionerne ved efterfølgende lysbilleder nedsænkning i alkohol 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Klargøre skiver ved fordybelse 2x i xylen 10 min hver.
    4. Monter afsnittene med DPX (dibutylphthalatxylen) mountant til histologi, og tilsæt to dråber monterings medier til lysbilleder og topping langsomt med dæksedler.
      Bemærk: da nedsænkning af væv i stigende koncentrationer af alkohol under dehydrering resulterer i alkohol indtrængning af væv og udskiftning af vand med alkohol, bestemme en præcis dehydrering tid og ikke over dehydrere væv. Udfør fordybelse i xylen efter dehydrering for at afklare vævet og fjerne eventuel overskydende eller resterende alkohol.
  13. Kontrol
    1. Gentag afsnit 1.1 – 1.12, og udelad det primære antistof og/eller Erstat det primære antistof eller det sekundære antistof IgG med TBS (negative kontroller).
    2. Gentag afsnit 1.1 – 1.12 for at absorbere hvert primært antistof med et overskud af det relative peptid (100 mg peptid/1 mL fortyndet antiserum).
    3. Gentag afsnit 1.1 – 1.12 ved hjælp af forskellige væv som positiv kontrol (f. eks. muse vævet).
      Bemærk: Forbered alle buffere friske, kort før du starter. Fjern forsigtigt den overskydende væske ved hvert trin med en pipette eller filtrerpapir rundt om sektionerne, og Sørg altid for, at sektionerne er våde.
  14. Billed erhvervelse og-analyse
    1. Erhverve digitale billeder under konstant lys belysning og ved samme forstørrelse ved hjælp af et mikroskop udstyret med et digitalt kamera.
    2. Udfør en semikvantitativ analyse af farvnings intensiteten ved hjælp af billedbehandlingssoftware (Se tabel over materialer).
      1. Åbn de optagne billeder, i. LIF-eller. TIFF-filformat, til evaluering af indekser for OX-A eller OX2-R positivitet.
      2. Vælg knappen under mål , og klik på Manuel counti. Tæl antallet af farvede celle profiler direkte fra skærmen ved at placere et mærke på positive celler ved at klikke med musen.
      3. Vælg et område af interesseområdet (ROI) (3 x 103 μm2) for at kvantificere immun signalets tæthed (optisk tæthed, OD).
      4. Bestem pixel med den højeste intensitet (høj positiv) og mindst intensitet (negativ) inde i det analyserede billede for at tildele nul som værdien af baggrunden (dvs. en del af væv blottet for farvede celler).
      5. Vurder OD ved at arbejde på en logaritmisk skala af absorbans. I digital billedanalyse varierer lysstyrken for DAB-pixlen fra den mørkeste (0 værdi) til den lyseste (255-værdi) skygge.
      6. Bestem OD ved at afbilde et histogram af følgende: log10(255/I), hvor "i" er den pixel intensitetsværdi, der gives af programmet og bestemmes ved at trække baggrunden.
        Bemærk: den permanente og stabile immunoperoxydaseteknik-reaktion kan til enhver tid analyseres under et lysfelt-mikroskop. Udfør optællingen af mærkede celler på alternativt afsnit for at undgå dobbelttælling af den samme celle fra tilstødende sektioner.

2. immunofluorescens-protokol

  1. Vævs dissektion
    1. Opofrelse og dissekere dyrene som beskrevet i afsnit 1,1.
  2. Vævs fiksering
    1. Fastgør tarmen og hjernen ved nedsænkning i 3 timer i 4% PFA ved 4 °C.
      1. Forbered PB og 4% PFA som i afsnit 1.2.1.
        Bemærk: fikserings tiden afhænger af vævs størrelsen. Vævs fiksation for mere end 4-6 timer kan føre til over binding, som maskerer antigener og begrænser antistof-epitope binding.
  3. Væv indlejring
    1. Skyl vævet 3x i 5 min hver med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Til kryoprotektion overføres vævene til 20% saccharose i PB (0,1 M, pH 7,4) og opbevares natten over ved 4 °C. Derefter overføres vævene til 30% saccharose i 0,1 M PB (pH 7,4) og opbevares i en ekstra nat ved 4 °C.
    3. Integrer væv i en blok af optimale skæring temperatur (OCT) sammensatte. For at gøre dette, forberede en lille Dewar af flydende nitrogen, tage aluminiumsfolie, og skær den i halve for at skabe en gryde. Gryden, der indeholder vævet fyldt med OLT-forbindelsen, skal dyppes i det flydende kvælstof, indtil OLT-forbindelsen afkøles. Det frosne væv kan opbevares ved-80 °C indtil skæring.
  4. Vævs skæring
    1. De frosne vævs blokke overføres til en kryostat ved-20 °c og skæres i koronale eller sagittale-sektioner på 10 μm.
    2. Væv opsamles i alternative serielle sektioner på klæbe glas, der egner sig til Immunohistokemi, og opbevares ved-20 °C indtil brug.
      Bemærk: Opbevar slides mellem-20 °C og 4 °C i en mørk slide boks eller slide bog.
  5. Blokering af uspecifikke bindingssteder og vævs gennemtrængabilitering
    1. Afgrænp vævs området på sliden med en solvens resistent pen.
    2. Skyl sektionerne 3x i 5 min hver med 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Der inkuleeres sektioner med 1% normalt æsel serum opløst i permeabiliserings bufferen PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) i 30 min ved RT for at permeabilisere cellemembranen og blokere de ikke-specifikke bindingssteder.
      1. Forbered Triton X-100 0,3% opløsning 0,3 mL Triton X-100 i 100 mL 0,1 M PB (pH 7,4).
      2. Klargør blokerings opløsningen til at opløse 1% normalt æsel serum i PB, der indeholder 0,3% TritonX-100.
        Bemærk: de dyrearter af serum, der anvendes i permeabiliserings-og blokerende buffere, er afhængige af værten for det sekundære antistof.
  6. Inkubation med blanding af primære antistoffer
    1. Skyl sektionerne 3x i 5 min hver med 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Delene inkuperes i en fugtig æske ved RT med en blanding af primære antistoffer fortyndet i PB-T. Følgende blandinger af primære antistoffer kan anvendes: ged antistof mod OX-2R fortyndet 1:100/kanin antistof mod CB1R fortyndet 1:100, eller ged antistof mod OX-A fortyndet 1:100/kanin antistof mod CB1R fortyndet 1:100.
  7. Inkubation med blanding af sekundære antistoffer
    1. Skyl sektionerne 3x i 5 min hver med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Inkubeter sektionerne i 2 timer ved RT med 1) en blanding af æsel anti-kanin Alexa fluor 488-konjugeret sekundært antistof og æsel anti-ged Alexa fluor 594-konjugeret sekundært antistof fortyndet 1:100 i PB-T; eller 2) en blanding af æsel anti-ged Alexa fluor 488-konjugeret sekundært antistof og æsel anti-kanin Alexa fluor 594-konjugeret sekundært antistof fortyndet 1:100 i PB-T.
      Bemærk: Brug sekundære antistoffer, der er udviklet i samme dyre Host. Det normale serum skal tilhøre de samme arter af det sekundære antistof (f. eks. anvende sekundære antistoffer, der er udviklet i æsel og et æsel normalt serum). Fortynde de primære og sekundære antistoffer med blokerende buffer, der indeholder vaskemidlet, for at øge cellernes permeabilisering og reducere baggrunden.
  8. Vævs montering
    1. Skyl sektionerne 3x i 5 min hver med 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Counterstain afsnittene med nuklear Dye DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) tilberedt opløsning 1,5 μL DAPI (1 mg/mL) i 3 mL PB.
    3. Coverslip-dias med monterings medium (Se tabel over materialer). Dette vandige monterings medium stabiliserer vævsprøven og pletter for langvarig brug. Fluorescerende prøver kan opbevares i mørke ved 4 °C. For at forlænge levetiden for fluorofores, brug et antifodret monterings medium.
      Bemærk: Vælg et godt monterings medium. En af de vigtigste parametre for monterings midler er brydningsindekset (nD), som bør være omkring 1,5, brydningsindekset af glas. Det monterings medium, der anvendes her, kan især anvendes med præparatet fremstillet til enzym-og lipid-bestemmelser (dvs. prøvemateriale, der ikke må dehydreres med en stigende række alkohol).
  9. Kontrol
    1. Gentag afsnit 2.1 – 2.8, uden det primære eller sekundære antistof, eller Erstat det primære eller sekundære antisera med PB (negativ kontrol) i det specifikke trin.
    2. Gentag afsnit 2.1 – 2.8, præabsorber ende hvert primært antistof med et overskud af det relative peptid (100 mg peptid/1 mL fortyndet antiserum).
    3. Gentag afsnit 2.1 – 2.8 på udsnit af musens hjerne (positiv kontrol).
      Bemærk: Forbered alle buffere frisk, kort før du starter. Fjern overskydende væske forsigtigt ved hvert trin med en pipette eller filtrerpapir rundt om sektionerne, og Sørg altid for, at afsnittet er fugtigt.
  10. Billed erhvervelse
    1. Brug et confokal mikroskop udstyret med en x-y-z motoriseret fase, digital kamera, og erhvervelse og billedanalyse software såsom NIS-Elements C at observere og analysere de immunofarvede sektioner. Erhverve digitale billeder ved hjælp af 5-20-40x mål.
    2. Tag billeder af hver sektion ved lav forstørrelse (10x eller 20x mål) i hver af de tilgængelige kanaler til at komponere en lav forstørrelse montage, giver et overblik over hele regionen for at lette lokalisering og dokumentation af OX-2R/CB1R anatomiske Co-udtryk. Normaliserer fluorescens billeder til maksimal kontrast og overlejring før analysen.
    3. Saml serielle Z-stakke af billeder i hele området af interesse. Få billederne gennem seks brændemaskiner (Z-Step) med fokus trin på 1 – 1,8 μm for at dække vævs volumenet, hvor OX-2R/CB1R coexpression visualiseres som gul puncta. For at gøre denne samling for hver kanal (rød, grøn, blå) separat, ved hjælp af et Z-motoriseret mikroskop.
    4. Brug en billedbehandlings deconvolution software til at deconvolve billeder ved anvendelse af ti iterationer og sammenbrud de serielle Z fly billeder i en enkelt maksimal projektion billede.
    5. Juster mikrograferne for lys og kontrast ved hjælp af Adobe Photoshop 6,01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      Bemærk: Udfør deconvolution-trinnet under observation for yderligere at formindske baggrunden. Begræns slide eksponeringen til lys for at forhindre foto blegning.
  11. Billedanalyse
    1. Udfør kvantitativ analyse af OX-2R/CB1R coexpression på Alternerede 10 μm tykke sektioner (n = 5 dyr pr. gruppe) ved at dække alle områder af interesse for hvert dyr.
    2. Kvantificere OX-2R/CB1R coexpression som antallet af gule positive puncta med et semi automatiseret system til billedanalyse. Imagins-software kan give en højere detaljeringsgrad med kvantitative data om de områder, hvor der er overlap mellem forskellige fluorescerende probaner.
    3. Kvantificere puncta ved hjælp af tærskel værktøjer til signalintensitet i de to kanaler. Åbn. Liff-,. TIFF-eller. jpg-billedfilen, og vælg billede – tærskel. Vælg automatisk indstilling eller Manuel metode , og Reguler tærsklen , indtil alle de farvede puncta er valgt. Analysér fordelingen af pixel intensiteterne i et område af billedet, der ikke indeholder nogen immun mærkede objekter, for at opnå baggrunds tærsklen. Bestem denne baggrund individuelt for hvert billede. Programmet fjerner derefter baggrunds tærsklen ved at indstille grundlinjen for pixel intensiteter til baggrundsværdien.
    4. Vælg Analysér – mål og vælg de parametre, der skal måles (puncta-intensitet-minimum, maksimum og middelværdi; antal/tæthed af det immun mærkede puncta).
    5. Tæl den gule puncta langs mængden af vævet i 4 Z-stakke for hver sektion, ved hjælp af stakke umiddelbart over eller under til det bedste fokus plan. Udelad områder uden for fokus fra analysen.
      Bemærk: Udfør optællingen af mærkede celler på alternativt afsnit for at undgå dobbelttælling af de samme celler fra kontinuerlig sektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative data for immunoperoxidasefarvningen er vist i figur 1 og figur 2. Immunohistokemisk analyse af Ox-a-og OX-2R-distributionen i tarmen hos voksne zebrafisk viste forskellige lokaliseringssteder for Ox-a og OX-2R og deres stigning i ekspression i tarmcellerne i Dio: zebrafisk. En intens brunfarvning for OX-A blev observeret i cellerne i den mediale og forreste tarm (figur 1a, A1). Den immunoexpression af OX-A gav klare signaler i de forskellige tarm-segmenter, faldende fra den forreste mod den mediale tarm (figur 1b, B1). Den negative kontrol blev anvendt som reference for baggrunden og for at bekræfte specificiteten af OX-A-signalet (figur 1E). Den forlængede eksponering for kromogen DAB resulterede i en forøgelse af baggrunds intensiteten (figur 1d). Lignende resultater blev observeret for Ox-2R immunoexpression i tarmene af Dio og kontrol diæt: zebrafisk (figur 2). Et øget Ox-A-signal i Dio voksen: zebrafisk blev ledsaget af overekspression af Ox-2R i andre tarm-indsættelser (figur 2b, B1).

Ved hjælp af immunofluorescens blev de data, der blev opnået ved immunoperoxidaseanalyse, bekræftet, hvilket lå til grund for forøgelsen af OX-A-og OX-2R-ekspressionen i tarmen hos voksne DIO-zebrafisk med hensyn til kontrol (figur 3). Desuden, ved hjælp af dobbelt immunofluorescens, det var muligt at få oplysninger om udtrykket af endocannabinoide receptor CB1R og dets Co-lokalisering med OX-A eller OX-2R i tarmen og hjernen af kontrol diæt og DIO voksne zebrafish. Fordelen ved immunofluorescens er, at det giver et mere detaljeret signal med mindre oplysninger om vævs morfologi sammenlignet med immunoperoxydaseteknik teknik. Ved hjælp af immunofluorescens metode har vi tidligere bestemt anatomiske interaktioner mellem OX-2R og CB1R i både tarmen og hjernen10.

Den nøjagtige analyse af immunofluorescerende billeder viste en stigning i Ox-2R/CB1R samlokalisering i tarmen hos Dio Adult: zebrafisk sammenlignet med kontrol diæt-zebrafiskene (figur 3b, C). En lignende situation blev observeret i forskellige hjerneregioner, såsom rygtelencephalon, hypothalamus (lateral, ventral, og dorsale zoner), optiske tectum, Torus lateralis, og diffuse kerne af ringere lobe (figur 4). De negative (figur 5a, B) og positive (musehjerne) (figur 5c) Kontroller blev anvendt som referencer for baggrunden og for at bekræfte specificiteten af CB1R-og OX-2R-signalerne.

Desuden, ved dobbelt immun farvning med OX-A/CB1R, det blev observeret i de orexinerge neuroner i hypothalamus, at der var en stigning i samlokalisering ledsaget af en stigning af OX-A fluorescerende signal (figur 6). Disse resultater viser, hvordan dobbelt immunofluorescens kan bidrage til at identificere fysiologisk bevaret protein udtryk, samlokalisering af målproteiner, og deres fordeling og/eller udtryk ændringer i forskellige patologiske tilstande.

Figure 1
Figur 1: orexin immunolokalisering i tarmene af DIO vs. Control diæt voksen zebrafish. (A) Ox-en immunoreaktivitet i cellerne i mediale tarmen af kontrol diæt zebrafish. (A1) OX-A immunoreactivity i cellerne i mediale tarmen af DIO zebrafish. (B) Ox-A immunoreactivity i cellerne i den forreste tarm af kontrol diæt zebrafish. (B1) OX-A immunoreactivity i cellerne i den forreste tarm af DIO zebrafish. (A1, B1) En stigning i OX-A positive celler i forskellige væv opdeling af den mediale og forreste tarm af DIO zebrafish. (C) Ox-A immunoreactivity i cellerne i den forreste tarm af Dio zebrafish. (D) immunoperoxidasereaktion for Ox-A efter langvarig udsættelse for DAB. E) negativ kontrol. Skala stang: 50 μm (A, A1, B, b1); 100 μm (C, D, E). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Orexin 2 receptor immunolokalisering i tarmen af Dio vs. Control diæt voksen zebrafish. (A) Ox-2R immunoreactivity i cellerne i mediale tarmen af kontrol diæt zebrafish. (A1) OX-2R immunoreactivity i cellerne i mediale tarmen af DIO zebrafish. (B) Ox-2R immunoreactivity i cellerne i den forreste tarm af kontrol diæt zebrafish. (B1) OX-2R immunoreactivity i cellerne i den forreste tarm af DIO zebrafish. (A1, B1) En forøgelse af OX-2R positive celler i forskellige væv opdeling af den mediale og forreste tarm af DIO zebrafish. Skala stang: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Distribution af Ox-A (grøn)/cb1r (rød) og OX-2R (rød)/CB1R (grøn) og deres Co-lokalisering med Ox-2R/CB1R (Yellow) i tarmene af Dio vs. Control diæt voksen zebrafish. A) okse-A/CB1R-Co-ekspression i tarmen af kontrol diæt voksne zebrafisk. (B) Ox-2R/CB1R-Co-ekspression i tarmen af kontrol diæt zebrafish. C) Ox-2R/CB1R-Co-ekspression i TARMEN hos Dio-voksne zebrafisk. En forøgelse af OX-2R/CB1R Co-lokalisering (gule prikker) i tarmene af DIO zebrafish. Skala stang: 25 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Distribution af Ox-2R (rød) og CB1R (grøn) og deres samlokalisering med Ox-2R/CB1R (gul) i hjernens koronale sektioner af Dio vs kontrol diæt voksen zebrafish. A) Ox-2R/CB1R-Co-ekspression i telencefon af kontrol diæt zebrafish. (A1) OX-2R/CB1R Co-Expression i telencephalon af DIO zebrafish. (B) Ox-2R/CB1R Co-udtryk i den laterale, ventrale og dorsale zone af hypothalamus, Optic tectum, Torus lateralis, diffuse kerne af den ringere lap af kontrol diæt: zebrafisk (B1) Ox-2R/CB1R Co-udtryk inden for lateral, ventrale, og rygzoner i hypothalamus, optisk tectum, Torus lateralis, og diffus kerne af den ringere lap af DIO zebrafish. (C) højere forstørrelse af optisk tectum viser Co-Expression af Ox-2R/CB1R (gul) i kontrol diæt zebrafish. (C1) Højere forstørrelse af optisk tectum viser Co-Expression af OX-2R/CB1R (gul) i DIO zebrafish. D) et særligt optisk tectum, der viser fordelingen og co-ekspression af Ox-2R/CB1R (gul) i Dio zebrafish. DAPI (blå) blev brugt til at counterstain kerner. CP: centrale posterior thalamus kerne; Dd: dorsale; DC: Central; DL: lateral; DM: medial; DP: bageste del af rygtelencephalon; HD: dorsale zone af periventrikulær hypothalamus; Hv: ventrale zone af den periventrikulære hypothalamus; LH: lateral del af hypothalamus; PGl: lateral og PGm: mediale preglomerular kerner; PGZ: periventrikulær grå zone af optisk tectum; TeO: optisk tectum; TL: Torus længde udinalis; Vd: dorsale del af ventrale telencephalon. Skala stang: 50 μm (A, A1, c, c1); 250 μm (B og B1); 25 μm (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Ox-2R og CB1R protein udtryk og specificitet i voksen hjernen af: zebrafisk og mus hippocampus. A) negativ kontrol af Ox-2R ved præabsorption med det relative peptid. (B) negativ kontrol af CB1R ved præabsorption med det relative peptid. (C) positiv kontrol af Ox-2R/CB1R i hippocampus af mus. PGZ: periventrikulær gråzone af optisk tectum; TeO: optisk tectum. Skala stang: 100 μm (A, B); 250 μm (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: fordeling af Ox-a (grøn) og CB1R (rød) og deres samlokalisering med Ox-a/CB1R (gul) i hypothalamus koronale sektioner af Dio vs kontrol diæt voksen zebrafish. (A) Ox-a/CB1R Co-udtryk i hypothalamus af kontrol diæt: zebrafisk (a1) højere forstørrelse viser okse-a/CB1R Co-udtryk i den laterale hypothalamus. Detalje af okse-A/CB1R-Co-ekspression, der viser en formodet tilstødende lokalisering af OX-A/CB1R eller samlokalisering og overlapning af OX-a/CB1R i de samme celler. (B) Ox-a/CB1R Co-udtryk i hypothalamus af Dio: zebrafisk (b1) højere forstørrelse viser øget Ox-a/CB1R Co-udtryk i den laterale hypothalamus. Detalje af okse-A/CB1R-Co-ekspression, der viser en formodet tilstødende lokalisering af OX-A/CB1R eller samlokalisering og overlapning af OX-a/CB1R i de samme celler. LH: lateral del af hypothalamus. Skala stang: 50 μm (A, B); 25 μm (A1, B1). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forberedelse af prøver

Prøveforberedelse er det første kritiske trin i IHC. En pålidelig protokol giver mulighed for vedligeholdelse af cellernes morfologi, vævs arkitektur og antigenicitet. Dette trin kræver korrekt vævs indsamling, fikse ring og skæring22,23. Formålet med fiksering er at bevare væv og reducere virkningen af vævs enzymer eller mikroorganismer. Fikserings trinnet bevarer især cellulære komponenter og biomolekyler, forhindrer autolyse og flytning af cellebestanddele (såsom antigener og enzymer), stabiliserer cellulære materialer i forhold til virkningerne af følgende procedurer, og letter immunofarvning4,7,24.

Før skæring, væv er tilberedt og konserveret gennem paraffin indlejring (immunoperoxidase metode) eller nedfrosne (frysning i kryomedia, i flere immunofluorescens metoder). Konserveringsmetoden er knyttet til fikserings typen7. Efter fiksering og konservering skæres vævet af en mikrotom, hvis den er indlejret i paraffin, eller af en kryostat, hvis den er indlejret i et kryomedia. Væv er typisk skåret i et tykkelse område på 8-10 μm og monteret på slides. For immunoperoxydaseteknik farvning kan prøven kræve yderligere trin for at afsløre epitoper for antistof binding, herunder afparaffinisation og antigen retrieveal25,26. Det skal erindres, at over binding kan forårsage epitop maskering, mens under binding kan forårsage lidt at ingen positive signal med tung kant farvning.

Blokering og baggrunds reduktion

I immunoperoxidasemetoden er den høje affinitet af begærlighed til biotin sandsynligvis ansvarlig for den hurtige produktion af baggrunds farvning. Da Avidin-biotin-reaktionen desuden er irreversibel, kan baggrunden ikke fjernes18,27. Under IHC kan høj baggrund også fremstilles ved uspecifikke bindinger til endogene vævs biotines. Hydrofobe og ioniske interaktioner (såsom dem, der fremstilles af kollagen og andre bindevæv såsom epitel og adipocytter), samt endogene enzymaktivitet, er vigtige årsager til baggrunds farvning. Endogene biotin eller enzymer og hydrofobe binding skal minimeres før antistof farvning, som kan opnås ved tilsætning af et vaskemiddel, såsom Triton X-100, i blokerings bufferne28.

Brugen af 0,3%-0,4% Triton X-100 i blokerende buffere giver også mulighed for fuld permeabilisering af antistoffer i vævs sektioner. Hertil kommer, at selv om antistoffer fortrinsvis er specifikke for en epitope, er partiel binding til steder på ikke-specifikke proteiner mulig, hvilket fører til høj baggrunds farvning29. De uspecifikke bindinger kan maskere signalet fra målantigen30. For at reducere uspecifikke baggrunds farvning, bør prøverne inkueres med en buffer, der blokerer uspecifikke reaktive sites. Almindelige blokerende buffere omfatter normalt serum-eller bovint serumalbumin30. Arten af det blokerende serum skal være den samme som værten for det sekundære antistof. Det anbefales at bestemme den bedste inkubationstid. Koncentrationen af det normale serum i blokerings bufferen er en anden vigtig bestemmelse31. For at eliminere baggrunds farvningen er det desuden afgørende at anvende den optimale fortynding af de primære og sekundære antistoffer. Således skal inkubationstid vælges omhyggeligt ud over temperaturen (dvs. øge tiden, hvis der udføres ved 4 °C, reducere tiden, hvis på RT) og detekteringssystem.

Valg af antistof

Udvælgelsen af antistoffer mod IHC farvning er vigtig og kan påvirke forsøgsresultatet32. For at sikre, at antistoffet reagerer korrekt, skal den anerkendte epitop tages i betragtning. Forståelse af målet protein og dets funktion, væv og subcellulære lokalisering, og om det undergår post-translationelle modifikationer kan bidrage til at bestemme valget af antistof. Et andet vigtigt skridt er afprøvning af forskellige koncentrationer af primære/sekundære antistof for at holde baggrunden og aspecificitet på et minimumniveau kompatibel med et bestemt signal. Desuden er det vigtigt at kontrollere artens reaktivitet for at bekræfte den primære og sekundære antistof kompatibilitet og det primære antistof evne til at genkende antigen målet i dets oprindelige kropsbygning. Et andet vigtigt skridt for primære antistof valg er Genjustering. Dette sikrer, at det primære antistof reagerer med biomolekyle af interesse og giver oplysninger om, hvilken epitop er anerkendt af antistoffet i en bestemt dyremodel. Genjustering giver også mulighed for at vælge antistoffer i stand til at genkende epitoper, der er evolutionære bevaret.

Kontrol

For at afklare specificiteten af antistoffer, et vigtigt aspekt er udførelsen af kontrollerne, som gør det muligt påvisning af specifikke farvning. Kontrollerne omfatter: i) et væv, der vides at udtrykke antigenet som en positiv kontrol; II) et væv, der vides ikke at udtrykke antigenet som en negativ kontrol; III) udeladelse af det primære antistof eller absorption af det primære antistof med et specifikt peptid for at bekræfte, at det sekundære antistof ikke krydsreagerer med andre vævs komponenter14,33.

I IHC teknikker, kan flere trin give problemer, før du opnår den endelige farvning. Stærk baggrunds farvning og uspecifikke målantigen farvning kan være forårsaget af endogene biotin eller primær/sekundær antistof Cross-reactivity og dårlig enzymaktivitet eller primær antistof potens. Baggrunds farvning og uspecifikke bindinger kan forebygges ved at blokere de endogene enzymer før inkubationen med det primære antistof. Brug af normal serum er den bedste måde at blokere ikke-specifikke interaktioner30. Valget af blokerings buffer afhænger af den anvendte detektionsmetode. Desuden kan et væv, der vides ikke at være udtryk for målantigen som negativ kontrol, fungere som reference til bestemmelse af mængden af baggrunds farvning34. Depositionen af kromogen eller fluorescerende signal i den negative kontrol bekræfter tilstedeværelsen af uspecifikke pletter. Desuden, utilstrækkelig blokering tid blokerer fører til en høj baggrund, mens overdreven blokering fører til et lavt signal35.

I immun operoxidase farvning, tilstedeværelsen af endogene peroxidase i vævet er en anden årsag til brun baggrund deposition. Behandlingen med H2O2 før inkubationen med det primære antistof blokerer den endogene peroxidase36,37. Tværtimod, i immunofluorescens, fiksering spiller en central rolle i dannelsen af autofluorescens. For at undgå autofluorescens skal den bedste fikserings metode, fikserings tidspunkt og tilberedning af væv vælges omhyggeligt. Et andet kritisk trin i IHC er validering af det primære antistof. Et antistof anses for at være gyldigt, hvis det frembringer et konsistent og specifikt farvnings mønster i en bestemt vævs-eller celle/under celle komponent, og hvis præabsorption af det primære antistof med et specifikt peptid ikke giver farvning38. I immunofluorescens er den uspecifikke binding en tilsvarende fluorescerende intensitet under tre farve-fluorescerende detektorer, mens signalet er variabelt, da der anvendes forskellige fluorescerende konjugeret sekundære antistoffer. Disse aspekter af IHC væv forberedelse og antistof farvning skal adresseres for at overvinde farvning spørgsmål.

IHC, selv om en forholdsvis enkel teknik, præsenterer nogle begrænsninger og afhænger af mange faktorer39. Et af de afgørende punkter er formalin fiksering, som kan ændre udtrykket af post-Translation modificerede proteiner. På den anden side kan formalin-fast paraffin-indlejret væv opbevares på lang sigt ved stuetemperatur, mens frosne væv kun kan opbevares i op til et år ved-80 °C. Desuden kan frosne væv beskadiges ved dannelsen af iskrystaller, som kan påvirke de under cellulære detaljer ændre IHC farvning40,41. Med hensyn til vores undersøgelser, var det vanskeligste aspekt at finde specifikke primære antistoffer mod: zebrafisk molekyler. Selv om: zebrafisk er blevet anerkendt som en gyldig dyremodel med en meget bevaret grad af struktur, meget få antistoffer er blevet udviklet, der kan genkende specifikke proteiner og andre molekyler i: zebrafisk. For at overvinde disse begrænsninger, er det vigtigt at validere antistof specificitet af vestlig blotting analyse og Genjustering.

Stigende interesse for IHC metoder har ført til udvikling af meget specifikke immun farvning, der kan hjælpe undersøgelses undersøgelser42. IHC bliver brugt med stigende hyppighed til at identificere tilstedeværelsen af specifikke molekylære markører og deres ændringer på tværs af forskellige patologier. De to tilgange illustreret her, immunoperoxydaseteknik og immunofluorescens, har respektive fordele og ulemper43. Paraffin-indlejret væv, der anvendes i immunoperoxydaseteknik teknik, kan give mulighed for høj opløsning af celler og væv og afsløre detaljer om fordelingen og mængden af Target proteiner44,45. Paraffin-indlejrede væv er dog ikke egnet til immunofluorescens, da paraffin kan maskere antigenicitet og føre til uspecifikke fluorescens46. På den anden side bevarer kryosektion af PFA-fikseret væv endogene antigenicitet og fører til et fald i uspecifikke fluorescens. Selv om den tekniske kvalitet af kryosektioner er meget lavere end for paraffin-indlejret væv, de kan give gyldige resultater ved hjælp af IHC teknik47.

Desuden, mens paraffin indlejring bedre bevarer morfologiske detaljer, kryopræservering bedre bevarer enzym og antigen udtryk, hvilket fører til mere detaljerede immunofarvning. Immunofluorescens teknikken giver også mulighed for nutidig påvisning af to eller tre forskellige biomolekyler, der afslører mulige interaktioner, som illustreret i vores tidligere arbejde for orexin og endocannabinoide systemer10. Blandt de teknikker, der anvendes til at påvise fordelingen og niveauerne af specifikke biomolekyler, tillader IHC ikke blot bestemmelse af specifikke morfologiske udtryk og distribution af molekyler og proteiner, men også muligheden for at udføre kvantitative Analyse.

Ved hjælp af immunofluorescens, kan codistribution og coexpression af biomolekyler også forstås yderligere, samt mulige interaktioner og deres ændringer i tilfælde af forskellige patologier48. Confokal mikroskopi, i løbet af de sidste 20 år, er ofte blevet brugt til at studere cellulære og subcellulære distribution af talrige proteiner i pattedyr hjernen. Fluorescens mikroskopi giver også mulighed for visualisering (ved hjælp af fluorophores eller fluorescerende farvestoffer) af specifikke strukturer af interesse, såsom proteiner, organeller og andre biologiske stoffer; sådanne signaler kan anvendes i både faste og levende biologiske systemer til billede specifikke subcellulære strukturer49. Den potentielle modulatoriske funktion af biomolekyler i specifikke celle segmenter kan udforskes via visualisering af deres udtryks mønstre, hvorimod den rolle, som protein signalering i vævet kan være afdækket via den Neuro anatomiske fordeling af metabolisk enzym-ekspression eller receptorer.

Den præsenterede tekniske arbejde introducerer IHC tilgange, hovedsagelig immunofluorescens, at studere to meget bevaret systemer, orexin og endocannabinoid, i en voksen: zebrafisk model. Især kan immunofluorescens metoder anvendes til at bestemme fordelingen, relative mængde og anatomiske interaktioner af specifikke proteiner i målvæv. Kryopræservering af PFA-fikseret væv bevarer meget følsomme proteiner, der er modtagelige for hurtig nedbrydning. Desuden er kryopræservering menes at bedre bevare antigen og antigenicitet, og det giver mulighed for at studere efter oversættelse modificerede proteiner og DNA.

Selv om frosne væv (sammenlignet med paraffin-indlejrede sektioner) er tykkere, hvilket hæmmer evnen til at observere væv morfologi i detaljer, confokal mikroskopi giver mulighed for prøve visualisering i stor detalje og forbedrer Imaging kapaciteter. Desuden kan immunofluorescens anvendes til kvantitativ analyse af farvnings intensiteten, og densitometrisk analyse af signalet giver kvantitative data. Dette giver mulighed for at bestemme korrelationer af fluorochrom signal niveauer med protein Expression niveauer ved at se på områder af co-lokalisering. Dette arbejde beskriver og illustrerer protokoller, der kan bruges til at studere evolutionære bevaring af vigtige proteiner i den voksne zebrafisk. Brugen af IHC, hovedsagelig immunofluorescens, hos voksne zebrafisk kan hjælpe med at fremhæve nytten af denne dyremodel i studiet af det morfologiske udtryk og fordelingen af højt konserveres biomolekyler, samt afsløre mulige ændringer på tværs af forskellige patologiske tilstande, der er forbundet med human fysiologisk logi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af Fondi Ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, University of Sannio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Biokemi Immunohistokemi immunoperoxidase orexin receptor endocannabinoide receptor zebrafiskhjerne zebrafisktarm
Identifikation af orexin og Endocannabinoide receptorer hos voksne zebrafisk ved hjælp af Immunoperoxidase og immunofluorescens metoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imperatore, R., D'Angelo, L., De… More

Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter