Purificación y trasplante de células progenitoras miógena derivan exosomas para mejorar la función cardiaca en ratones distróficos musculares de Duchenne

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para mejorar transitoriamente la función cardiaca en ratones de la distrofia muscular de Duchenne mediante el trasplante de exosomas derivados de células progenitoras miógena normal.

Resumen

Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad genética recesiva x-ligada causada por una carencia de la proteína distrofina funcional. No se puede curar la enfermedad, y conforme avanza la enfermedad, el paciente desarrolla síntomas de insuficiencia cardíaca congestiva, miocardiopatía dilatada y arritmias. Los ratones mutantes DMD^MDX no expresan distrofina y se utilizan comúnmente como un modelo de ratón de la DMD. En nuestro reciente estudio, se observó que la inyección intramiocárdica de tipo ancho (WT)-progenitor miógena exosomas derivados de células (MPC-Exo) transitoriamente restauran la expresión de distrofina en el miocardio de ratones mutantes DMD^MDX , asociada con una mejora transitoria de la función cardiaca, lo que sugiere que WT-MPC-Exo puede proporcionar una opción para aliviar los síntomas cardiacos de la DMD. Este artículo describe la técnica de purificación de MPC-Exo y el trasplante en corazones de ratones mutantes DMD^MDX .

Introducción

Distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una X-ligado recesiva, progresiva enfermedad neuromuscular causada por una mutación en el gen de la DMD y la pérdida de distrofina funcional¹. Distrofina se expresa principalmente en el miocardio y músculo esquelético y menos se expresa en el músculo liso, glándulas endocrinas y neuronas^2,3. DMD es el tipo más común de distrofia muscular con una incidencia de uno por cada 3.500 a 5.000 niños recién nacidos en todo el mundo^4,5. Individuos suelen desarrollan necrosis muscular progresiva, pérdida de independiente a pie en la adolescencia temprana y la muerte en las décadas de segunda a tercera de sus vidas debido a la insuficiencia cardíaca y la insuficiencia respiratoria⁶.

Miocardiopatía dilatada, arritmias e insuficiencia cardíaca congestiva son manifestaciones cardiovasculares comunes de DMD^7,8. No se puede curar la enfermedad, tratamiento de apoyo puede mejorar los síntomas o retrasar la progresión de la insuficiencia cardíaca, pero es muy difícil mejorar la función de corazón^9,10.

Similares para los pacientes con DMD distrofia muscular X-ligado (MDX) ratones son deficientes en la proteína de distrofina y presente síntomas de cardiomiopatía¹¹y por lo tanto son ampliamente utilizados en la investigación DMD asociado miocardiopatía. Con el fin de restaurar la distrofina en los músculos afectados, terapia de células madre alogénico ha demostrado para ser un eficaz tratamiento para la DMD^12,13,14. Exosomas, vesículas de membrana 30-150 nm secretadas por varios tipos celulares, juegan un papel clave en la comunicación de célula a célula a través de transporte de material genético, ARN mensajero (ARNm) como no-codificación RNAs^{15,16,17 ,18,19,20,21}.

Nuestros estudios previos han demostrado que los exosomas derivados de células progenitoras miógeno (MPC), como línea de celular C2C12, pueden transferir dystrophin mRNA al host cardiomiocitos después de inyección cardiaca directa²², indicando que entrega alogénico de Exosomas derivados de MPC (MPC-Exo) transitorio pueden restaurar la expresión del gen DMD en ratones MDX. Este artículo se centra en técnicas de purificación y trasplante MPC-Exo.

Protocolo

Los animales fueron tratados según protocolos aprobados y normas de bienestar animal del institucional cuidado Animal y del Comité de uso del colegio médico de Georgia en la Universidad de Augusta.

1. aislamiento y purificación de exosomas derivados de MPC

1. Semilla 5 x 10⁶ C2C12 células en una placa de cultivo celular de 15 cm con 20 mL completa Dulbecco modifican medio del águila (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina G y estreptomicina 100 de μg/mL. Incubar a 37 ° C y 5% CO₂.
2. Preparar medio agotado de exosomas por ultracentrifugación de FBS a 100.000 x g de 18 h a 4 ° C utilizando un rotor oscilante de cubo. Deseche los pellets.
3. Reemplazar el DMEM completo con medio exosomas-agotado cuando las células de la capa monomolecular a 80% de confluencia en la placa de cultivo.
4. Utilizar una pipeta para recoger el sobrenadante de la placa de cultivo celular cada 48 h para un total de tres veces. Recoger el sobrenadante en tubos de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 150 x g durante 10 min eliminar las células restantes.
5. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar restos celulares. Ultracentrífuga el medio filtrado en tubos ultra claros usando el rotor oscilante de cubo a 100.000 x g durante 120 min a 4 ° C para precipitar exosomas.
6. Resuspender el precipitado que contiene los exosomas en tampón fosfato salino (PBS) y llenar el tubo muy claro todo con PBS. Realizar la ultracentrifugación de esta suspensión a 100.000 x g durante 120 min a 4 ° C para eliminar proteínas contaminantes.
7. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de exosomas en 100 μl PBS. Almacenar a-80 ° C para su uso futuro.
8. Para el análisis de microscopia electrónica, colocar 3 μl de suspensión de exosomal en una cuadrícula de formvar recubierto cobre microscopio 200 malla por 5 min a temperatura ambiente. Continuar con acetato de uranilo estándar tinción²³. Examinar la red semiseco por microscopía electrónica de transmisión.

2. intramiocárdica exosomas entrega

Nota: Utilizamos seis ratones de cada grupo.

1. Anestesiar ratones DBA/2J-DMD^MDX (hombre; > 10 meses de edad y peso corporal (PC) > 18 g) con la inyección intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg P.C. de ketamina combinada con 10 mg/kg BW de xilacina y confirmar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie.
2. Fijar cada ratón en posición supina sobre una plataforma quirúrgica con cinta para sujetar cada miembro y colocar una sutura 3-0 horizontalmente por debajo de los dientes superiores para mantener la mandíbula superior en lugar.
3. Aplicar la crema depilatoria en el lado izquierdo del pecho de ratón para quitar la piel de la piel.
4. Realizar intubación endotraqueal a través de la cavidad bucal mediante un catéter 24 G y ventilar el ratón con aire a una velocidad de 195 respiraciones/min con un ventilador de roedor (véase la Tabla de materiales).
5. Desinfectar la piel con alcohol al 75% y yodo povidona al 10%.
6. Haga una incisión oblicua de 10\u201215 de mm desde el borde esternal izquierdo en la axila izquierda, corte de músculo pectoral mayor y pectoral menor por una tijera, luego realizar una toracotomía izquierda a través del cuarto espacio intercostal. Suavemente Introduzca las bandas retractor para separar la cavidad torácica en un ancho de 10 mm. Tenga cuidado para evitar daños en el pulmón izquierdo.
7. Utilizar dos pinzas rectas para quitar el pericardio, los separe y colocarlos detrás de las puntas del separador para exponer el corazón. MPC-Exo de inyectar (50 μg en 30 μL PBS) o 30 μL PBS (como control) intramyocardially en la pared anterior del ventrículo izquierdo utilizando una aguja de insulina 31 G en un sitio.
8. Use suturas de nylon 6-0 para cerrar la cavidad torácica, músculos pectorales y la piel en secuencia.
9. Recuperar ratones. Una vez que la respiración espontánea rítmica está presente, quite los ratones del respirador y extubación. Observar y registrar la condición de ratones después de la cirugía.

3. ecocardiografía

Nota: Un único observador cegado a los grupos experimentales realiza ecocardiografía y análisis de datos.

1. Dos días después del trasplante de PBS/exosomas, anestesiar los ratones con 1\u20122% isoflurano.
2. Fijar un ratón en la posición supina con cinta y aplique el gel acústico precalentado en el área izquierda del pecho.
3. Evaluar la función ventricular izquierda por ecocardiografía como se describió anteriormente^16,24.
   1. Obtener la vista de eje largo paraesternal de ventrículo izquierdo (LV) en dos dimensiones (modo B) y luego gire la sonda de ultrasonido 90° para obtener una vista de eje corto del LV a nivel del músculo papilar.
   2. Grabar imágenes ecocardiográficas modo M y medir diámetro telediastólico ventricular izquierdo (DDVI), volumen telesistólico ventricular izquierdo (LVESD), volumen telediastólico ventricular izquierdo (VTDVI) y el volumen telesistólico ventricular izquierdo (VTSVI).
      Nota: Acortamiento fraccional (% FS) = [(LVEDD − LVESD) / DDVI] x 100 y fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI %) = [(LVEDV − LVESV) / VTDVI] x 100.

4. inmunohistoquímica

1. Dos días después del trasplante de PBS/exosomas, anestesiar ratones (véase el paso 2.1) y cortar el esternón abierto para exponer la cavidad torácica. Disecar la vena cava inferior e inundar el corazón por el ápice del ventrículo izquierdo con 3 mL de PBS, seguido de 3 mL de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente, usando un catéter de mariposa con una aguja de 25 G conectada a una jeringa de 5 mL.
2. Incorporar corazones fijos en parafina y cortadas en secciones de 5 μm de espesor.
3. Desparafinizar portaobjetos en xileno y rehidratar en soluciones de etanol en el siguiente orden: xileno 100% (3 min), xileno 100% (3 min), 100% de etanol (1 min), etanol al 100% (1 minuto), etanol al 95% (1 minuto), etanol al 80% (1 minuto), H₂O (1 min).
4. Fijar las secciones de tejido con paraformaldehído al 4% por 8 min a temperatura ambiente.
5. Sumerja los portaobjetos en citrato de sodio (0,01 M, pH 6.0) y realizar recuperación de antígeno utilizando un recuperador de antígeno.
6. Permeabilizar las secciones por 1 h a temperatura ambiente con 1% polietilenglicol éter terc-Octylpheny PBS.
7. Bloque de secciones con 5% de suero de cabra en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
8. Incubar las secciones con diluido de anticuerpo primario (anticuerpo anti-distrofina) en PBS (1: 100) durante la noche a 4 ° C, luego lavar tres veces con PBS durante 5 minutos.
9. Incubar las secciones con diluido de anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 había conjugado anti-conejo de cabra IgG) en PBS (1: 400) por 45 min a temperatura ambiente.
10. Control autofluorescence usando un amortiguamiento de Autofluorescencia kit (véase la Tabla de materiales).
11. Medio de montaje de uso con DAPI (vea la Tabla de materiales) para montar las diapositivas.
12. Observar diapositivas debajo de un microscopio confocal.

Resultados

Un diagrama de flujo para aislar y purificar exosomas de células C2C12 se muestra en la figura 1A. Para confirmar la presencia de exosomas, realizamos análisis de microscopia electrónica de transmisión. Imagen de microscopía electrónica de transmisión (figura 1B) muestra la morfología de las vesículas de forma brillante y redonda de exosomas C2C12 derivados. Mancha blanca /negra occidental análisis confirmaron la presencia de ma...

Discusión

El método de aislamiento de exosomas pura es esencial para el estudio de la función de exosomas. Una de las técnicas comunes para el aislamiento de exosomas es polietilenglicoles (PEGs) mediada por precipitación^17,18,25. Exosomas pueden ser precipitada en las clavijas y peleteado por centrifugación a baja velocidad. Mediada por PEG purificación es muy conveniente y de bajo costo, no necesita ningún equipo avanzado, pero hay preo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y mu; m Filtro	Fisherbrand	09-720-004
15 cm Plato de cultivo celular	Thermo Fisher Scientific	157150
catéter 24 G	TERUMO	SR-OX2419CA
31 G aguja de insulina	BD 328291
4% paraformaldehído	Affymetrix	AAJ19943K2
50 mL Tubos de centrífuga	Thermo Fisher Scientific	339652
6-0 sutura	Pro Advantage by NDC	P420697
Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG Thermo	Fisher Scientific	A-11008
Antibiótico Solución Antimicótica Corning		30-004-CI
Anticuerpo anti-distrofina	Abcam	ab15277
Antígeno retriever	Aptum Biologics	R2100-US Kit de enfriamiento de	recuperación de antígenos
	Vector Laboratories	SP-8400
C2C12 línea celular	ATCC	CRL-1772
Centrífuga	Unico	C8606
Change-A-Tip Cauterias de alta temperatura	Bovie Medical Corporation	HIT
Microscopía confocal	Zeiss	Zeiss 780 Ratones confocales
verticales DBA/2J-mdx	The Jackson Laboratory	013141
DMEM	Corning	10-013-CM
Suero Fetal Bovino (FBS)	Corning	35-011-CV
Suero de cabra	MP Biomedicals, LLC	191356
Isoflurano	Patterson Veterinario	07-893-1389
Ketamina	Henry Schein	056344
Medio de montaje con DAPI	Vector Laboratories	H-1500
Juego de retractores para ratones	Kent Scientific	SURGI-5001
Éter de polietilenglicol terc-octilfenilo	Fisher Scientific	BP151-100
Ventilador para roedores	Harvard Apparatus	55-7066
SW-28 Rotor Ti	Beckman	342207
La plataforma	de imágenes Vevo 2100Sistema de ultrasonido FUJIFILM VisualSonics	Vevo 2100
Ultracentrífuga	Beckman	365672
Tubos ultratransparentes	Beckman	344058
xilacina (XylaMed)	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	1XYL003 8XYL006