Este protocolo permite la conversión rápida y eficiente de células madre pluripotentes inducidas en neuronas motoras con una identidad espinal o craneal, mediante la expresión ectópica de factores de transcripción de vectores piggyBac inducibles.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac
En este artículo
Resumen
Resumen
Describimos aquí un método para obtener neuronas motoras craneales y espinales funcionales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC). La conversión directa en neurona motora se obtiene mediante la expresión ectópica de módulos alternativos de factores de transcripción, a saber, Ngn2, Isl1 y Lhx3 (NIL) o Ngn2, Isl1 y Phox2a (NIP). NIL y NIP especifican, respectivamente, la identidad de la neurona motora espinal y craneal. Nuestro protocolo comienza con la generación de líneas IPSC modificadas en las que Nil o NIP están integrados de forma estable en el genoma a través de un vector transposón piggybac. La expresión de los transgenes es inducida entonces por doxiciclina y lleva, en 5 días, a la conversión de los IPSC en progenitores MN. La posterior maduración, durante 7 días, conduce a poblaciones homogéneas de los MNs espinales o craneales. Nuestro método tiene varias ventajas sobre los protocolos anteriores: es extremadamente rápido y simplificado; no requiere infección viral o más aislamiento MN; permite generar diferentes subpoblaciones de MN (espinales y craneales) con un notable grado de maduración, como lo demuestra la capacidad de disparar trenes de potenciales de acción. Además, se puede obtener un gran número de neuronas motoras sin purificación de poblaciones mixtas. las neuronas motoras espinales y craneales derivadas de iPSC se pueden utilizar para el modelado in vitro de la esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades neurodegenerativas de la neurona motora. Las poblaciones de neuronas motoras homogéneas pueden representar un recurso importante para la detección de fármacos específicos del tipo celular.
Introducción
La degeneración de la neurona motora (MN) desempeña un papel causal en las enfermedades humanas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la atrofia muscular espinal (SMA). El establecimiento de sistemas de modelos celulares in vitro adecuados que recapitulan la complejidad del MN humano es un paso importante hacia el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que están dotadas de notables propiedades de diferenciación plurilinaje, se han derivado ahora de un número de pacientes afectados por las enfermedades de las neuronas motoras1,2. Las líneas adicionales de iPSC que transportan mutaciones patógenas asociadas a las enfermedades de MN han sido generadas por la edición génica, comenzando por el control "saludable" de las células madre pluripotentes3. Estas líneas representan herramientas útiles para el modelado de enfermedades in vitro y la detección de fármacos, siempre que estén disponibles los métodos apropiados para la diferenciación de iPSC en MNs. La razón detrás del desarrollo de este método es proporcionar a la comunidad científica interesada en las enfermedades del MN con un protocolo de diferenciación rápido y eficiente que da lugar a los MNs funcionales maduros. La primera ventaja de este método es su plazo de ejecución. Otro punto de fuerza relevante proviene de la eliminación de cualquier paso de purificación. Finalmente, el protocolo se puede utilizar para generar dos poblaciones distintas de neuronas motoras.
La posibilidad de generar diferentes subtipos de MNs es particularmente relevante para el modelado de enfermedades de manganeso. No todos los subtipos de MN son igualmente vulnerables en ELA y SMA y la aparición de síntomas en diferentes unidades de motor influye en gran medida en el pronóstico. En la ELA, el inicio de la columna vertebral con síntomas que comienzan en las extremidades superiores e inferiores conduce a la muerte en aproximadamente 3-5 años4. Por el contrario, el inicio bulbar, comenzando con la degeneración del MNs craneal, tiene un peor pronóstico. Por otra parte, el porcentaje de inicio bulbar es significativamente mayor en pacientes con mutaciones en las proteínas de unión al ARN FUS y TDP-43 que en individuos con mutaciones de SOD15. Casi la totalidad de los protocolos alternativos de diferenciación MN se basa en la actividad del ácido retinoico (RA), que confiere un carácter espinal a diferenciar iPSCs6,7,8. Esto limita la posibilidad de estudiar los factores intrínsecos, que podrían ser protectores en los subtipos específicos de MN9,10.
Consistente con un trabajo anterior en las células madre embrionarias de ratón11, hemos demostrado recientemente que en la expresión ectópico de iPSCs humanos de Ngn2, Isl1 y LHX3 (Nil) induce una identidad de MN espinal, mientras que Ngn2 y Isl1 más PHOX2A (NIP) especifican el mns craneal12. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo eficiente, que conduce a la producción de MNs humanos dotados de propiedades funcionales en un plazo de 12 días. El propósito de este método es obtener, en un corto período de tiempo y sin la necesidad de purificación (por ejemplo, por FACS), poblaciones celulares altamente enriquecidas para MNs con identidad espinal o craneal.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. mantenimiento de las IPSC humanas
-
Preparación de placas recubiertas de matriz
- Descongelar un vial de 5 mL de matriz (ver tabla de materiales) a 4 ° c durante la noche. Las existencias de matrices originales vienen en diferentes concentraciones de existencias y las alícuas se realizan de acuerdo con el factor de dilución indicado en la hoja de datos, específico para el lote individual. Es importante mantener el vial y los tubos fríos para evitar el gelificante prematuro de la matriz. Dosificar la matriz en alícuas en criotubos prerefrigerados sobre hielo. Congele las alícuas no utilizadas a-20 ° c.
- Coloque una alícuota sobre hielo durante aproximadamente 2 h para descongelar.
- Diluir la alícuota de la matriz con 20 mL de DMEM/F12 fría en un tubo cónico de 50 mL.
- Mezclar bien y dosificar 1 mL de matriz diluida en platos de 35 mm (cantidades equivalentes por área superficial de otros platos).
- Mantenga los platos que contienen la matriz diluida durante 1 h a temperatura ambiente para permitir el recubrimiento.
Nota: Los platos, sellados con parafilm, se pueden almacenar a 4 ° c durante un máximo de 2 semanas.
-
Preparación de la solución de acción (20 ml) y 1x alícullitas de trabajo del reactivo de disociación de células suaves (ver tabla de materiales).
- Disolver el polvo a 10 mg/mL en PBS (CA2 +/mg2 + gratis).
- Filtro esterilizar a través de una membrana filtrante de 0,22 μm.
- Preparar 20 alícuts (1 mL cada uno) y almacenar a-20 ° c.
- Antes de su uso, diluir una alícuota en PBS (CA2 +/mg2 + libre) a 1 mg/ml (1x de trabajo alícuotas).
Nota: 1x alícuotas de trabajo se pueden almacenar a 4 ° c durante hasta 2 semanas.
-
Passaging IPSC humanos.
- Antes de comenzar: si se almacena a 4 ° c, las placas recubiertas previamente calientes en la incubadora a 37 ° c durante 20-30 min. precalentarse a temperatura ambiente la cantidad de medio de iPSC humano (ver tabla de materiales) necesaria. Precalente el DMEM/F12.
- Aspirado medio de cultivo.
- Enjuague los IPSC con PBS (CA2 +/mg2 + gratis).
- Añadir 1x solución de disociación suave (0,5 mL para un plato de 35 mm). Incubar a 37 ° c hasta que los bordes de las colonias comiencen a desprenderse de la placa, por lo general 3-5 min.
- Aspirar la solución de disociación suave, teniendo cuidado de no separar las colonias de iPSC.
- Lavar las células con DMEM/F12 (2 mL para un plato de 35 mm) y aspirar a no separar las células. Repite este paso una vez más.
- Añadir medio humano iPSC (1 mL para una antena de 35 mm).
- Separe suavemente las colonias con un levantador de células y transfiera a un tubo de 15 mL.
- Rompa con cuidado los grumos de la célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo con un P1000 pipeteador 3-4 veces.
- Aspirar el sobrenadante de la placa (s) recubierta por matriz.
- Sembrar las células en el volumen de cultivo apropiado del medio de la iPSC humana. La relación de división puede variar de línea a línea y es de aproximadamente 1:4-1:8. Cambia el medio diariamente.
2. la generación de líneas iPSC inducibles NIL y NIP
-
Transfección celular.
- Enjuague las células con PBS (CA2 +/mg2 + libre).
- Añadir reactivo de disociación celular (ver tabla de materiales) (0,35 ml para un plato de 35 mm) e incubar a 37 ° c hasta que las células individuales estén separadas (5-10 min).
- Separación de células cuidadosamente completa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con un P1000 pipeteador 3-4 veces.
- Recoger en un tubo de 15 mL y añadir PBS (CA2 +/mg2 + gratis) a 10 ml. Cuente las celdas.
- Pellet 106 células y resuspendio en 100 μl de buffer R (incluido en el kit de electroporación celular, ver tabla de materiales).
- Añadir ADN plásmido para la transfección: 4,5 μg de vector transponibles (EPB-BSD-TT-Nil o EPB-BSD-TT-NIP12) y 0,5 μg del plásmido transposasa de piggybac13.
- Transfect con el sistema de electroporación celular (ver tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante y como se describió anteriormente3 con los siguientes parámetros: 1.200 V de voltaje, 30 ms de ancho, 1 pulso. Siembra las células en un medio humano iPSC complementado con 10 μM Y-27632 (inhibidor de la roca, ver tabla de materiales) en un plato recubierto con matriz de 6 mm.
-
Selección con antibióticos.
- Dos días después de la transfección, añadir 5 μg/mL de blasticidina al medio de cultivo.
- La mayoría de las células no transfectadas morirán a las 48 h de la selección de blasticidina. Mantenga las células en blastidina durante al menos 7-10 días para contrarrestar la selección de las células que no han integrado los transgenes en el genoma.
- Mantener las células transfectadas de forma estable como una población mixta, compuesta de células con diferentes números de transgenes y diferentes sitios de integración, o aislar clones individuales.
- Prepare un plato adicional para comprobar la expresión efectiva de los transgenes, tras 1 μg/mL de inducción de doxiciclina, por RT-PCR con imprimadores específicos de transgénicos para Ngn2 (forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Reverso: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), como se describió anteriormente12.
- En esta etapa, congelar las existencias de las nuevas líneas NIL-y NIP-iPSC en el medio de congelación para los iPSCs humanos (ver tabla de materiales).
3. diferenciación de la neurona motora
- Disocie las células con el reactivo de disociación celular tal como se describe (pasos 2.1.1.-2.1.3.). Recoger las células disociadas en un tubo de 15 mL y diluir con 5 volúmenes de DMEM/F12. Pellet de las células y resuspendio en el medio humano iPSC complementado con inhibidor de la roca de 10 μM. Cuente las células y las semillas en los platos recubiertos con matriz a una densidad de 62.500 células/cm2.
- El día después, reemplace el medio con DMEM/F12, complementado con 1x análogo de L-glutamina estable, 1x suplemento de cultivo celular de aminoácido no esencial (NEAA) y 0.5 x penicilina/estreptomicina, y conteniendo 1 μg/mL de doxiciclina. Esto se considera como día 0 de diferenciación. En el día 1, refresque el medio y la doxiciclina.
- En el día 2, cambie el medio a medio Neurobasal/B27 (medio Neurobasal complementado con 1x B27, 1x análogo de L-glutamina estable, 1x NEAA y 0,5 x penicilina/estreptomicina), conteniendo 5 μM de DAPT, 4 μM SU5402 y 1 μg/mL de doxiciclina (ver tabla de materiales ). Refresca el medio y la doxiciclina todos los días hasta el día 5.
-
Día 5: disociación de células con reactivo de disociación celular (ver tabla de materiales).
- Enjuague las células con PBS (CA2 +/mg2 + libre).
- Añadir el reactivo de disociación celular (0,35 mL para un plato de 35 mm) e incubar a 37 ° c hasta que toda la monocapa de la célula se separe del plato. Tenga en cuenta que las celdas individuales no se separarán durante la incubación.
- Añadir 1 mL de DMEM/F12 y recoger las células en un tubo de 15 mL.
- Separación de células cuidadosamente completa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con un P1000 pipeteador 10-15 veces.
- Añada 4 mL de DMEM/F12 y cuente las células.
- En esta etapa, se congelan los progenitores de la neurona motora en el medio de congelación celular (ver tabla de materiales), según las instrucciones del fabricante.
- Pellet de las células y resuspendio en medio neuronal (Neurobasal/B27 medio complementado con 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF y 200 ng/mL ácido L-ascórbico, ver tabla de materials) complementado con inhibidor de roca de 10 μm.
- Siembra las células en poli-ornitina/laminado-o alternativamente en soportes recubiertos con matriz a la densidad de 100.000 células/cm2. Utilice soportes plásticos μ-Slide con recubrimiento de polímero (ver tabla de materiales) para el análisis de inmunostaining.
- En el día 6, cambiar el medio con medio neuronal fresca desprovista de inhibidor de la roca. En los próximos días, refresque la mitad del medio cada 3 días. El medio de cultivo debe cambiarse muy cuidadosamente para evitar el desprendimiento de la superficie.
4. Análisis de inmunostaining
- Fijación celular. Enjuagar las células con PBS (con CA2 +/mg2 +) e incubar durante 15 min en un 4% de PARAFORMALDEHÍDO en PBS (con CA2 +/mg2 +) a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y se sospecha que causa cáncer. Evite el contacto con la piel y los ojos y manipule bajo una campana de emanaciones químicas. - Permeabilize con PBS (con CA2 +/mg2 +) que contiene 0,1% Triton X-100 durante 5 min a temperatura ambiente.
- Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en solución de bloqueo de anticuerpos (ABS: 3% BSA en PBS con CA2 +/mg2 +).
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos primarios en ABS: anti-TUJ1 (1:1000; conejo) y anti-Oct4 (1:200; ratón) o anti-CHAT (anti-colina acetiltransferasa; 1:150; cabra). Ver tabla de materiales.
- Incubar por 45 min a temperatura ambiente con el par de anticuerpo secundario de burro apropiado en ABS: Alexa Fluor 647 (1:250), anti-conejo Alexa Fluor 594 (1:250) y anti-Goat Alexa Fluor 488 (1:250). Ver tabla de materiales.
- Incubar en 0,4 μg/mL DAPI durante 5 min a temperatura ambiente para etiquetar núcleos.
- Monte las células con medio de montaje (ver tabla de materiales) para la toma de imágenes en un microscopio de fluorescencia.
5. Caracterización funcional mediante parches-abrazaderas de grabación
- Prepare la solución externa (NES) con equilibrio HEPES como sigue: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mm MgCl2, 10 mm HEPES y 10 mm de glucosa. Establezca la osmolaridad entre 290-300 mΩ. Ajuste el pH a 7,3 utilizando 1N NaOH y almacene la solución a 4 ° c.
- Preparar la solución interna: 140 mM K-gluconato, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mm HEPES, 2 mm mg-ATP, 0,3 mm na-GTP. Ajuste el pH a 7,3 con 1M de KOH y compruebe que la osmolaridad está configurada en alrededor de 290 mΩ. Congelar la solución a-20 ° c en pequeñas alícullias.
- Antes de ejecutar los experimentos, precalentar la solución de NES en un baño de agua a unos 28-30 ° c.
- Tire de algunas Micropipetas de borosilicato (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) con una resistencia de punta: 5-6 MΩ y llenar con la solución intracelular antes de montarse en el portapipetas.
Nota: Recuerde los alambres de plata de cloruro del electrodo de grabación y el electrodo de referencia en lejía durante al menos 30 min para formar una capa uniforme de AgCl en la superficie del alambre. - Transferir la placa de Petri en la cámara de grabación y dejar que la cámara con la solución de NES a 1-2 mL/min. Deje que el flujo pase a través de un calentador en línea establecido a temperatura de 30 ° c con el fin de mantener la solución caliente.
- Coloque la cámara de grabación electrofisiológica bajo un microscopio vertical. Grabe las corrientes de membrana con el amplificador PATCH-CLAMP y adquiera los datos con un software adecuado.
- Abra el software de control del amplificador y ajuste la ganancia de señal en el valor 1 y el filtro de Bessel a 10 kHz. Asegúrese de que el filtro de Bessel sea 2,5 veces menor que la frecuencia de muestreo.
- Establezca los protocolos experimentales para los experimentos de tensión-abrazadera y corriente-abrazadera en el software de grabación.
- En la configuración del Protocolo, marque el modo de estimulación episódica y ajuste la frecuencia de muestreo a 25 kHz. Luego, muévase a la pestaña de forma de onda y escriba el voltaje o la amplitud del paso actual y la longitud como sigue.
- Para las corrientes de sodio de voltaje cerrado, utilice 15 pasos de tensión (50 ms de duración cada uno) de-100 mV a + 40 mV (incremento de 10 mV). Ejecute el protocolo después de imponer a la célula parcheada un potencial de retención de-60 mV a través del amplificador. Del mismo modo, las corrientes de potasio cerradas por voltaje son evocadas por pasos de voltaje (250 ms de duración cada uno) de-30 mV a + 50 mV (incremento de 10 mV) sosteniendo la célula grabada a-40 mV.
- Para investigar las propiedades de disparo de los MNs craneales y espinales derivados de iPSC, células de abrazadera, en modo de corriente-abrazadera, a un potencial de membrana de-70 mV y utilizar 4 pulsos de corriente (1 s de duración cada uno) de amplitud creciente (de + 20 pA a + 80 pA; 20 pA incremento).
- Adquiera para cada corriente activada por voltaje las corrientes, la actividad de cocción evocada y tres propiedades pasivas como la capacitancia de célula entera (cm), la resistencia de la membrana celular (RM) y el potencial de la membrana en reposo (RMP).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En la figura 1se muestra una descripción esquemática del método de diferenciación. Los IPSC humanos (WT I, línea3) fueron transfectados con EPB-BSD-TT-Nil o EPB-BSD-TT-NIP, generando, tras la selección de blasticidina, líneas celulares estables e inducibles12, en lo sucesivo denominadas IPCS-Nil e IPSC-NIP, respectivamente. Las células diferenciadoras se caracterizaron por la expresión del marcador de pluripotencia OCT4 y el marcador panneurona...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo permite convertir eficientemente los IPSC humanos en neuronas motoras espinales y craneales gracias a la expresión ectópica de factores de transcripción específicos del linaje. Estos transgenes son inducibles por doxiciclina y se integran de forma estable en el genoma gracias a un vector basado en Transposon piggyBac. En una población mixta, una o varias copias del vector piggyBac se integrarán aleatoriamente en el genoma de las células individuales, aumentando el riesgo de alteraciones de la integridad de...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Los autores desean agradecer el servicio de imágenes del centro de vida nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, para el apoyo y asesoramiento técnico. Estamos agradecidos a los miembros del centro para la vida Nano Ciencia para la discusión útil. Este trabajo fue apoyado parcialmente por una subvención de AriSLA (piloto Grant 2016 "StressFUS") a AR.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Reactivo de disociación celular |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Acetiltransferasa anticolina. Anticuerpo primario utilizado en ensayos de inmunotinción. RRID: AB_2079751; Número de lote: 2971003 |
| anti-cabra Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Anticuerpo secundario utilizado para ensayos de immonofluorescencia. RRID: AB_2534102; Número de lote: 1915848 |
| anti-ratón Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Anticuerpo secundario utilizado para ensayos de monofluorescencia. RRID: AB_162542; Número de lote: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Anticuerpo primario utilizado en ensayos de inmunotinción. RRID: AB_398736; Número de lote: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Anticuerpo primario utilizado en ensayos de inmunotinción. Número de lote: E0117 |
| anti-conejo Alexa Fluor 594 | Ciencias Inmunológicas | IS-20152-1 | Anticuerpo secundario utilizado para ensayos de immonofluorescencia |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Anticuerpo primario utilizado en ensayos de inmunotinción. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Suplemento sin suero para el mantenimiento de las células neuronales |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Medio de congelación celular, utilizado aquí para los progenitores de neuronas motoras |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Factor neurotrófico derivado del cerebro |
| Blasticidina | Sigma-Aldrich | 203350 | Antibiótico nucleósido que inhibe la síntesis de proteínas en procariotas y eucariotas |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Albúmina sérica bovina. Agente bloqueante para evitar la unión inespecífica de anticuerpos en ensayos de inmunotinción |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | Productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| Software Clampex 10 | Dispositivos moleculares | Clampex 10 | Sistema de registro de corrientes de membrana |
| Corning Matrigel Matrix con calificación hESC | CorningPreparación de la membrana basal reconstituida del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Se utiliza para la adhesión de iPSC a soportes de plástico y vidrio | ||
| CRYOSTEM ACF MEDIOS DE CONGELACIÓN | Biological Industries | 05-710-1E | Medio de congelación para iPSC humanas |
| D-Glucosa | Sigma-Aldrich | G5146 | productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| DAPI en polvo | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Tinción fluorescente que se une a la adenina– regiones ricas en timina en el ADN utilizadas para la tinción de núcleos en ensayos de immonofluorescencia |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Inhibidor de la gamma secretasa |
| Dispasa | Gibco | 17105-041 | Reactivo para la disociación suave de iPSCs humanas |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Medio basal para cultivo celular |
| Doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891-1G& nbsp; | Se utiliza para inducir la expresión de transgenes de los vectores epB-Bsd-TT-NIL y epB-Bsd-TT-NIP |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Línea comercial de iPSC humana |
| E.Z.N.A Kit de ARN total | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit para la extracción total de ARN de células eucariotas cultivadas |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Factor neurotrófico derivado de gliales |
| Gibco Línea hiPSC episomal | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Línea iPSC humana comercial |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Una alternativa a la L-glutamina con mayor estabilidad. Mejora la salud celular. |
| Productos químicos Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | para soluciones electrofisiológicas |
| iScript Reverse Transcription Supermix para RT-qPCR | 1708841 | Bio-Rad | para el análisis de la expresión génica mediante qPCR en tiempo real |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-RAD | 172-5121 | Mezcla maestra de reacción lista para usar optimizada para PCR cuantitativa (qPCR) basada en colorantes en cualquier instrumento de PCR en tiempo real |
| K-gluconato | Sigma-Aldrich | G4500 | productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| Ácido L-ascórbico | LKT Laboratories | A7210 | Utilizado en cultivo celular como antioxidante |
| Laminina | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro |
| Microscopio confocal de barrido láser | Olimpo | iX83 FluoView1200 | Microscopio confocal para la adquisición de imágenes de inmunotinción |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| Medio de montaje | Ibidi | 50001 | Solución de montaje utilizada para ensayos de microscopía confocal e inmunofluorescencia |
| Amplificador de pinza múltiple | Molecular Devices | 700B | Sistema de registro de corrientes de membrana |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | Productos químicos para soluciones electrofisiológicas |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | no esenciales. Se utiliza como suplemento para el medio de cultivo celular, para aumentar el crecimiento y la viabilidad celular. |
| Neón 100 μ L Kit | Thermo Fisher Scientific MPK10096 | Kit de electroporación de celdas | |
| transfección de neón | Thermo Fisher Scientific | Sistema de electroporación de células | MPK5000 |
| Neurobasal | Medio Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Medio basal diseñado para el mantenimiento y la maduración a largo plazo de las poblaciones de células neuronales sin necesidad de una capa alimentadora de astrocitos |
| NutriStem-XF/FF | Industrias Biológicas | 05-100-1A | Medio de cultivo iPSC humano |
| Paraformaldehído | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 157-8 | Utilizado para la fijación celular en ensayos de inmunotinción |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Tampón de fosfato de Dulbecco Solución salina, con calcio, con magnesio |
| PBS Ca2+/Mg2+ libre | de Sigma-Aldrich | D8537-500ML | tampón de fosfato de Dulbecco, sin calcio, sin |
| penicilina de magnesio/estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333-100ML Solución de | penicilina/estreptomicina utilizada para prevenir la contaminación de cultivos celulares por bacterias. |
| poli-ornitina | Sigma-Aldrich | P4957 | Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Inhibidor selectivo del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol, t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol éter de terc-octilfenilo. Se utiliza para la permeabilización celular en ensayos de inmunotinción |
| Microscopio vertical Microscopio | Olympus | BX51VI | para registro electrofisiológico equipado con cámara CoolSnap Myo |
| Y-27632 (Inhibidor de ROCK) | Enzo Ciencias de la Vida | ALX-270-333-M005 | Inhibidor selectivo permeable a las células de la proteína quinasa (ROCK) que contiene bobina en espiral asociada a Rho. Aumenta la supervivencia de iPSC |
| μ-Slide 8 Pozo | Ibidi | 80826 | Soporte para high– Análisis microscópico final de células fijas |
Referencias
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960(2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
