Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

Resumen

Este protocolo permite la conversión rápida y eficiente de células madre pluripotentes inducidas en neuronas motoras con una identidad espinal o craneal, mediante la expresión ectópica de factores de transcripción de vectores piggyBac inducibles.

Resumen

Describimos aquí un método para obtener neuronas motoras craneales y espinales funcionales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC). La conversión directa en neurona motora se obtiene mediante la expresión ectópica de módulos alternativos de factores de transcripción, a saber, Ngn2, Isl1 y Lhx3 (NIL) o Ngn2, Isl1 y Phox2a (NIP). NIL y NIP especifican, respectivamente, la identidad de la neurona motora espinal y craneal. Nuestro protocolo comienza con la generación de líneas IPSC modificadas en las que Nil o NIP están integrados de forma estable en el genoma a través de un vector transposón piggybac. La expresión de los transgenes es inducida entonces por doxiciclina y lleva, en 5 días, a la conversión de los IPSC en progenitores MN. La posterior maduración, durante 7 días, conduce a poblaciones homogéneas de los MNs espinales o craneales. Nuestro método tiene varias ventajas sobre los protocolos anteriores: es extremadamente rápido y simplificado; no requiere infección viral o más aislamiento MN; permite generar diferentes subpoblaciones de MN (espinales y craneales) con un notable grado de maduración, como lo demuestra la capacidad de disparar trenes de potenciales de acción. Además, se puede obtener un gran número de neuronas motoras sin purificación de poblaciones mixtas. las neuronas motoras espinales y craneales derivadas de iPSC se pueden utilizar para el modelado in vitro de la esclerosis lateral amiotrófica y otras enfermedades neurodegenerativas de la neurona motora. Las poblaciones de neuronas motoras homogéneas pueden representar un recurso importante para la detección de fármacos específicos del tipo celular.

Introducción

La degeneración de la neurona motora (MN) desempeña un papel causal en las enfermedades humanas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la atrofia muscular espinal (SMA). El establecimiento de sistemas de modelos celulares in vitro adecuados que recapitulan la complejidad del MN humano es un paso importante hacia el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que están dotadas de notables propiedades de diferenciación plurilinaje, se han derivado ahora de un número de pacientes afectados por las enfermedades de las neuronas motoras^1,2. Las líneas adicionales de iPSC que transportan mutaciones patógenas asociadas a las enfermedades de MN han sido generadas por la edición génica, comenzando por el control "saludable" de las células madre pluripotentes³. Estas líneas representan herramientas útiles para el modelado de enfermedades in vitro y la detección de fármacos, siempre que estén disponibles los métodos apropiados para la diferenciación de iPSC en MNs. La razón detrás del desarrollo de este método es proporcionar a la comunidad científica interesada en las enfermedades del MN con un protocolo de diferenciación rápido y eficiente que da lugar a los MNs funcionales maduros. La primera ventaja de este método es su plazo de ejecución. Otro punto de fuerza relevante proviene de la eliminación de cualquier paso de purificación. Finalmente, el protocolo se puede utilizar para generar dos poblaciones distintas de neuronas motoras.

La posibilidad de generar diferentes subtipos de MNs es particularmente relevante para el modelado de enfermedades de manganeso. No todos los subtipos de MN son igualmente vulnerables en ELA y SMA y la aparición de síntomas en diferentes unidades de motor influye en gran medida en el pronóstico. En la ELA, el inicio de la columna vertebral con síntomas que comienzan en las extremidades superiores e inferiores conduce a la muerte en aproximadamente 3-5 años⁴. Por el contrario, el inicio bulbar, comenzando con la degeneración del MNs craneal, tiene un peor pronóstico. Por otra parte, el porcentaje de inicio bulbar es significativamente mayor en pacientes con mutaciones en las proteínas de unión al ARN FUS y TDP-43 que en individuos con mutaciones de SOD1⁵. Casi la totalidad de los protocolos alternativos de diferenciación MN se basa en la actividad del ácido retinoico (RA), que confiere un carácter espinal a diferenciar iPSCs^6,7,8. Esto limita la posibilidad de estudiar los factores intrínsecos, que podrían ser protectores en los subtipos específicos de MN^9,10.

Consistente con un trabajo anterior en las células madre embrionarias de ratón¹¹, hemos demostrado recientemente que en la expresión ectópico de iPSCs humanos de Ngn2, Isl1 y LHX3 (Nil) induce una identidad de MN espinal, mientras que Ngn2 y Isl1 más PHOX2A (NIP) especifican el mns craneal¹². Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo eficiente, que conduce a la producción de MNs humanos dotados de propiedades funcionales en un plazo de 12 días. El propósito de este método es obtener, en un corto período de tiempo y sin la necesidad de purificación (por ejemplo, por FACS), poblaciones celulares altamente enriquecidas para MNs con identidad espinal o craneal.

Protocolo

1. mantenimiento de las IPSC humanas

1. Preparación de placas recubiertas de matriz
   1. Descongelar un vial de 5 mL de matriz (ver tabla de materiales) a 4 ° c durante la noche. Las existencias de matrices originales vienen en diferentes concentraciones de existencias y las alícuas se realizan de acuerdo con el factor de dilución indicado en la hoja de datos, específico para el lote individual. Es importante mantener el vial y los tubos fríos para evitar el gelificante prematuro de la matriz. Dosificar la matriz en alícuas en criotubos prerefrigerados sobre hielo. Congele las alícuas no utilizadas a-20 ° c.
   2. Coloque una alícuota sobre hielo durante aproximadamente 2 h para descongelar.
   3. Diluir la alícuota de la matriz con 20 mL de DMEM/F12 fría en un tubo cónico de 50 mL.
   4. Mezclar bien y dosificar 1 mL de matriz diluida en platos de 35 mm (cantidades equivalentes por área superficial de otros platos).
   5. Mantenga los platos que contienen la matriz diluida durante 1 h a temperatura ambiente para permitir el recubrimiento.
      Nota: Los platos, sellados con parafilm, se pueden almacenar a 4 ° c durante un máximo de 2 semanas.
2. Preparación de la solución de acción (20 ml) y 1x alícullitas de trabajo del reactivo de disociación de células suaves (ver tabla de materiales).
   1. Disolver el polvo a 10 mg/mL en PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} gratis).
   2. Filtro esterilizar a través de una membrana filtrante de 0,22 μm.
   3. Preparar 20 alícuts (1 mL cada uno) y almacenar a-20 ° c.
   4. Antes de su uso, diluir una alícuota en PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} libre) a 1 mg/ml (1x de trabajo alícuotas).
      Nota: 1x alícuotas de trabajo se pueden almacenar a 4 ° c durante hasta 2 semanas.
3. Passaging IPSC humanos.
   1. Antes de comenzar: si se almacena a 4 ° c, las placas recubiertas previamente calientes en la incubadora a 37 ° c durante 20-30 min. precalentarse a temperatura ambiente la cantidad de medio de iPSC humano (ver tabla de materiales) necesaria. Precalente el DMEM/F12.
   2. Aspirado medio de cultivo.
   3. Enjuague los IPSC con PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} gratis).
   4. Añadir 1x solución de disociación suave (0,5 mL para un plato de 35 mm). Incubar a 37 ° c hasta que los bordes de las colonias comiencen a desprenderse de la placa, por lo general 3-5 min.
   5. Aspirar la solución de disociación suave, teniendo cuidado de no separar las colonias de iPSC.
   6. Lavar las células con DMEM/F12 (2 mL para un plato de 35 mm) y aspirar a no separar las células. Repite este paso una vez más.
   7. Añadir medio humano iPSC (1 mL para una antena de 35 mm).
   8. Separe suavemente las colonias con un levantador de células y transfiera a un tubo de 15 mL.
   9. Rompa con cuidado los grumos de la célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo con un P1000 pipeteador 3-4 veces.
   10. Aspirar el sobrenadante de la placa (s) recubierta por matriz.
   11. Sembrar las células en el volumen de cultivo apropiado del medio de la iPSC humana. La relación de división puede variar de línea a línea y es de aproximadamente 1:4-1:8. Cambia el medio diariamente.

2. la generación de líneas iPSC inducibles NIL y NIP

1. Transfección celular.
   1. Enjuague las células con PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} libre).
   2. Añadir reactivo de disociación celular (ver tabla de materiales) (0,35 ml para un plato de 35 mm) e incubar a 37 ° c hasta que las células individuales estén separadas (5-10 min).
   3. Separación de células cuidadosamente completa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con un P1000 pipeteador 3-4 veces.
   4. Recoger en un tubo de 15 mL y añadir PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} gratis) a 10 ml. Cuente las celdas.
   5. Pellet 10⁶ células y resuspendio en 100 μl de buffer R (incluido en el kit de electroporación celular, ver tabla de materiales).
   6. Añadir ADN plásmido para la transfección: 4,5 μg de vector transponibles (EPB-BSD-TT-Nil o EPB-BSD-TT-NIP¹²) y 0,5 μg del plásmido transposasa de piggybac¹³.
   7. Transfect con el sistema de electroporación celular (ver tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante y como se describió anteriormente³ con los siguientes parámetros: 1.200 V de voltaje, 30 ms de ancho, 1 pulso. Siembra las células en un medio humano iPSC complementado con 10 μM Y-27632 (inhibidor de la roca, ver tabla de materiales) en un plato recubierto con matriz de 6 mm.
2. Selección con antibióticos.
   1. Dos días después de la transfección, añadir 5 μg/mL de blasticidina al medio de cultivo.
   2. La mayoría de las células no transfectadas morirán a las 48 h de la selección de blasticidina. Mantenga las células en blastidina durante al menos 7-10 días para contrarrestar la selección de las células que no han integrado los transgenes en el genoma.
   3. Mantener las células transfectadas de forma estable como una población mixta, compuesta de células con diferentes números de transgenes y diferentes sitios de integración, o aislar clones individuales.
   4. Prepare un plato adicional para comprobar la expresión efectiva de los transgenes, tras 1 μg/mL de inducción de doxiciclina, por RT-PCR con imprimadores específicos de transgénicos para Ngn2 (forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Reverso: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), como se describió anteriormente¹².
   5. En esta etapa, congelar las existencias de las nuevas líneas NIL-y NIP-iPSC en el medio de congelación para los iPSCs humanos (ver tabla de materiales).

3. diferenciación de la neurona motora

1. Disocie las células con el reactivo de disociación celular tal como se describe (pasos 2.1.1.-2.1.3.). Recoger las células disociadas en un tubo de 15 mL y diluir con 5 volúmenes de DMEM/F12. Pellet de las células y resuspendio en el medio humano iPSC complementado con inhibidor de la roca de 10 μM. Cuente las células y las semillas en los platos recubiertos con matriz a una densidad de 62.500 células/cm².
2. El día después, reemplace el medio con DMEM/F12, complementado con 1x análogo de L-glutamina estable, 1x suplemento de cultivo celular de aminoácido no esencial (NEAA) y 0.5 x penicilina/estreptomicina, y conteniendo 1 μg/mL de doxiciclina. Esto se considera como día 0 de diferenciación. En el día 1, refresque el medio y la doxiciclina.
3. En el día 2, cambie el medio a medio Neurobasal/B27 (medio Neurobasal complementado con 1x B27, 1x análogo de L-glutamina estable, 1x NEAA y 0,5 x penicilina/estreptomicina), conteniendo 5 μM de DAPT, 4 μM SU5402 y 1 μg/mL de doxiciclina (ver tabla de materiales ). Refresca el medio y la doxiciclina todos los días hasta el día 5.
4. Día 5: disociación de células con reactivo de disociación celular (ver tabla de materiales).
   1. Enjuague las células con PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} libre).
   2. Añadir el reactivo de disociación celular (0,35 mL para un plato de 35 mm) e incubar a 37 ° c hasta que toda la monocapa de la célula se separe del plato. Tenga en cuenta que las celdas individuales no se separarán durante la incubación.
   3. Añadir 1 mL de DMEM/F12 y recoger las células en un tubo de 15 mL.
   4. Separación de células cuidadosamente completa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con un P1000 pipeteador 10-15 veces.
   5. Añada 4 mL de DMEM/F12 y cuente las células.
   6. En esta etapa, se congelan los progenitores de la neurona motora en el medio de congelación celular (ver tabla de materiales), según las instrucciones del fabricante.
   7. Pellet de las células y resuspendio en medio neuronal (Neurobasal/B27 medio complementado con 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF y 200 ng/mL ácido L-ascórbico, ver tabla de materials) complementado con inhibidor de roca de 10 μm.
   8. Siembra las células en poli-ornitina/laminado-o alternativamente en soportes recubiertos con matriz a la densidad de 100.000 células/cm². Utilice soportes plásticos μ-Slide con recubrimiento de polímero (ver tabla de materiales) para el análisis de inmunostaining.
5. En el día 6, cambiar el medio con medio neuronal fresca desprovista de inhibidor de la roca. En los próximos días, refresque la mitad del medio cada 3 días. El medio de cultivo debe cambiarse muy cuidadosamente para evitar el desprendimiento de la superficie.

4. Análisis de inmunostaining

1. Fijación celular. Enjuagar las células con PBS (con CA^{2 +}/mg^{2 +}) e incubar durante 15 min en un 4% de PARAFORMALDEHÍDO en PBS (con CA^{2 +}/mg^{2 +}) a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y se sospecha que causa cáncer. Evite el contacto con la piel y los ojos y manipule bajo una campana de emanaciones químicas.
2. Permeabilize con PBS (con CA^{2 +}/mg^{2 +}) que contiene 0,1% Triton X-100 durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en solución de bloqueo de anticuerpos (ABS: 3% BSA en PBS con CA^{2 +}/mg^{2 +}).
4. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente con anticuerpos primarios en ABS: anti-TUJ1 (1:1000; conejo) y anti-Oct4 (1:200; ratón) o anti-CHAT (anti-colina acetiltransferasa; 1:150; cabra). Ver tabla de materiales.
5. Incubar por 45 min a temperatura ambiente con el par de anticuerpo secundario de burro apropiado en ABS: Alexa Fluor 647 (1:250), anti-conejo Alexa Fluor 594 (1:250) y anti-Goat Alexa Fluor 488 (1:250). Ver tabla de materiales.
6. Incubar en 0,4 μg/mL DAPI durante 5 min a temperatura ambiente para etiquetar núcleos.
7. Monte las células con medio de montaje (ver tabla de materiales) para la toma de imágenes en un microscopio de fluorescencia.

5. Caracterización funcional mediante parches-abrazaderas de grabación

1. Prepare la solución externa (NES) con equilibrio HEPES como sigue: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mm MgCl₂, 10 mm HEPES y 10 mm de glucosa. Establezca la osmolaridad entre 290-300 mΩ. Ajuste el pH a 7,3 utilizando 1N NaOH y almacene la solución a 4 ° c.
2. Preparar la solución interna: 140 mM K-gluconato, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl₂, 10 mm HEPES, 2 mm mg-ATP, 0,3 mm na-GTP. Ajuste el pH a 7,3 con 1M de KOH y compruebe que la osmolaridad está configurada en alrededor de 290 mΩ. Congelar la solución a-20 ° c en pequeñas alícullias.
3. Antes de ejecutar los experimentos, precalentar la solución de NES en un baño de agua a unos 28-30 ° c.
4. Tire de algunas Micropipetas de borosilicato (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) con una resistencia de punta: 5-6 MΩ y llenar con la solución intracelular antes de montarse en el portapipetas.
   Nota: Recuerde los alambres de plata de cloruro del electrodo de grabación y el electrodo de referencia en lejía durante al menos 30 min para formar una capa uniforme de AgCl en la superficie del alambre.
5. Transferir la placa de Petri en la cámara de grabación y dejar que la cámara con la solución de NES a 1-2 mL/min. Deje que el flujo pase a través de un calentador en línea establecido a temperatura de 30 ° c con el fin de mantener la solución caliente.
6. Coloque la cámara de grabación electrofisiológica bajo un microscopio vertical. Grabe las corrientes de membrana con el amplificador PATCH-CLAMP y adquiera los datos con un software adecuado.
7. Abra el software de control del amplificador y ajuste la ganancia de señal en el valor 1 y el filtro de Bessel a 10 kHz. Asegúrese de que el filtro de Bessel sea 2,5 veces menor que la frecuencia de muestreo.
8. Establezca los protocolos experimentales para los experimentos de tensión-abrazadera y corriente-abrazadera en el software de grabación.
9. En la configuración del Protocolo, marque el modo de estimulación episódica y ajuste la frecuencia de muestreo a 25 kHz. Luego, muévase a la pestaña de forma de onda y escriba el voltaje o la amplitud del paso actual y la longitud como sigue.
10. Para las corrientes de sodio de voltaje cerrado, utilice 15 pasos de tensión (50 ms de duración cada uno) de-100 mV a + 40 mV (incremento de 10 mV). Ejecute el protocolo después de imponer a la célula parcheada un potencial de retención de-60 mV a través del amplificador. Del mismo modo, las corrientes de potasio cerradas por voltaje son evocadas por pasos de voltaje (250 ms de duración cada uno) de-30 mV a + 50 mV (incremento de 10 mV) sosteniendo la célula grabada a-40 mV.
11. Para investigar las propiedades de disparo de los MNs craneales y espinales derivados de iPSC, células de abrazadera, en modo de corriente-abrazadera, a un potencial de membrana de-70 mV y utilizar 4 pulsos de corriente (1 s de duración cada uno) de amplitud creciente (de + 20 pA a + 80 pA; 20 pA incremento).
12. Adquiera para cada corriente activada por voltaje las corrientes, la actividad de cocción evocada y tres propiedades pasivas como la capacitancia de célula entera (cm), la resistencia de la membrana celular (RM) y el potencial de la membrana en reposo (RMP).

Resultados

En la figura 1se muestra una descripción esquemática del método de diferenciación. Los IPSC humanos (WT I, línea³) fueron transfectados con EPB-BSD-TT-Nil o EPB-BSD-TT-NIP, generando, tras la selección de blasticidina, líneas celulares estables e inducibles¹², en lo sucesivo denominadas IPCS-Nil e IPSC-NIP, respectivamente. Las células diferenciadoras se caracterizaron por la expresión del marcador de pluripotencia OCT4 y el marcador panneurona...

Discusión

Este protocolo permite convertir eficientemente los IPSC humanos en neuronas motoras espinales y craneales gracias a la expresión ectópica de factores de transcripción específicos del linaje. Estos transgenes son inducibles por doxiciclina y se integran de forma estable en el genoma gracias a un vector basado en Transposon piggyBac. En una población mixta, una o varias copias del vector piggyBac se integrarán aleatoriamente en el genoma de las células individuales, aumentando el riesgo de alteraciones de la integridad de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	productos químicos para soluciones electrofisiológicas
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Reactivo de disociación celular
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Acetiltransferasa anticolina. Anticuerpo primario utilizado en ensayos de inmunotinción. RRID: AB_2079751; Número de lote: 2971003
anti-cabra Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Anticuerpo secundario utilizado para ensayos de immonofluorescencia. RRID: AB_2534102; Número de lote: 1915848
anti-ratón Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Anticuerpo secundario utilizado para ensayos de monofluorescencia. RRID: AB_162542; Número de lote: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Anticuerpo primario utilizado en ensayos de inmunotinción. RRID: AB_398736; Número de lote: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Anticuerpo primario utilizado en ensayos de inmunotinción. Número de lote: E0117
anti-conejo Alexa Fluor 594	Ciencias Inmunológicas	IS-20152-1	Anticuerpo secundario utilizado para ensayos de immonofluorescencia
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Anticuerpo primario utilizado en ensayos de inmunotinción. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Suplemento sin suero para el mantenimiento de las células neuronales
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Medio de congelación celular, utilizado aquí para los progenitores de neuronas motoras
BDNF	PreproTech	450-02	Factor neurotrófico derivado del cerebro
Blasticidina	Sigma-Aldrich	203350	Antibiótico nucleósido que inhibe la síntesis de proteínas en procariotas y eucariotas
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Albúmina sérica bovina. Agente bloqueante para evitar la unión inespecífica de anticuerpos en ensayos de inmunotinción
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
Software Clampex 10	Dispositivos moleculares	Clampex 10	Sistema de registro de corrientes de membrana
Corning Matrigel Matrix con calificación hESC			CorningPreparación de la membrana basal reconstituida del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Se utiliza para la adhesión de iPSC a soportes de plástico y vidrio
CRYOSTEM ACF MEDIOS DE CONGELACIÓN	Biological Industries	05-710-1E	Medio de congelación para iPSC humanas
D-Glucosa	Sigma-Aldrich	G5146	productos químicos para soluciones electrofisiológicas
DAPI en polvo	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-fenilindol. Tinción fluorescente que se une a la adenina– regiones ricas en timina en el ADN utilizadas para la tinción de núcleos en ensayos de immonofluorescencia
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Inhibidor de la gamma secretasa
Dispasa	Gibco	17105-041	Reactivo para la disociación suave de iPSCs humanas
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Medio basal para cultivo celular
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G& nbsp;	Se utiliza para inducir la expresión de transgenes de los vectores epB-Bsd-TT-NIL y epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Línea comercial de iPSC humana
E.Z.N.A Kit de ARN total	Omega bio-tek	R6834-02	Kit para la extracción total de ARN de células eucariotas cultivadas
GDNF	PreproTech	450-10	Factor neurotrófico derivado de gliales
Gibco Línea hiPSC episomal	Thermo Fisher Scientific	A18945	Línea iPSC humana comercial
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	Una alternativa a la L-glutamina con mayor estabilidad. Mejora la salud celular.
Productos químicos Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	para soluciones electrofisiológicas
iScript Reverse Transcription Supermix para RT-qPCR	1708841	Bio-Rad	para el análisis de la expresión génica mediante qPCR en tiempo real
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-RAD	172-5121	Mezcla maestra de reacción lista para usar optimizada para PCR cuantitativa (qPCR) basada en colorantes en cualquier instrumento de PCR en tiempo real
K-gluconato	Sigma-Aldrich	G4500	productos químicos para soluciones electrofisiológicas
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	productos químicos para soluciones electrofisiológicas
Ácido L-ascórbico	LKT Laboratories	A7210	Utilizado en cultivo celular como antioxidante
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro
Microscopio confocal de barrido láser	Olimpo	iX83 FluoView1200	Microscopio confocal para la adquisición de imágenes de inmunotinción
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	productos químicos para soluciones electrofisiológicas
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	productos químicos para soluciones electrofisiológicas
Medio de montaje	Ibidi	50001	Solución de montaje utilizada para ensayos de microscopía confocal e inmunofluorescencia
Amplificador de pinza múltiple	Molecular Devices	700B	Sistema de registro de corrientes de membrana
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	Productos químicos para soluciones electrofisiológicas
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	no esenciales. Se utiliza como suplemento para el medio de cultivo celular, para aumentar el crecimiento y la viabilidad celular.
Neón 100 μ L Kit	Thermo Fisher Scientific MPK10096		Kit de electroporación de celdas
transfección de neón	Thermo Fisher Scientific	Sistema de electroporación de células	MPK5000
Neurobasal	Medio Thermo Fisher Scientific	21103049	Medio basal diseñado para el mantenimiento y la maduración a largo plazo de las poblaciones de células neuronales sin necesidad de una capa alimentadora de astrocitos
NutriStem-XF/FF	Industrias Biológicas	05-100-1A	Medio de cultivo iPSC humano
Paraformaldehído	Ciencias de la Microscopía Electrónica	157-8	Utilizado para la fijación celular en ensayos de inmunotinción
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Tampón de fosfato de Dulbecco Solución salina, con calcio, con magnesio
PBS Ca2+/Mg2+ libre	de Sigma-Aldrich	D8537-500ML	tampón de fosfato de Dulbecco, sin calcio, sin
penicilina de magnesio/estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333-100ML Solución de	penicilina/estreptomicina utilizada para prevenir la contaminación de cultivos celulares por bacterias.
poli-ornitina	Sigma-Aldrich	P4957	Promueve la unión y el crecimiento de las células neuronales in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Inhibidor selectivo del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol,  t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol  éter de terc-octilfenilo. Se utiliza para la permeabilización celular en ensayos de inmunotinción
Microscopio vertical Microscopio	Olympus	BX51VI	para registro electrofisiológico equipado con cámara CoolSnap Myo
Y-27632  (Inhibidor de ROCK)	Enzo Ciencias de la Vida	ALX-270-333-M005	Inhibidor selectivo permeable a las células de la proteína quinasa (ROCK) que contiene bobina en espiral asociada a Rho. Aumenta la supervivencia de iPSC
μ-Slide 8 Pozo	Ibidi	80826	Soporte para high– Análisis microscópico final de células fijas