Artículo de método

En Vivo inhibición de MicroRNA para disminuir el crecimiento tumoral en ratones

DOI:

10.3791/59322

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23 de agosto de 2019

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1Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM, 2Ciberonc, Instituto de Salud Carlos III

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe los modelos de xenoinjerto y ratón ortotópico de la tumorigenesis tiroidea humana como una plataforma para probar los tratamientos inhibidores basados en microARN. Este enfoque es ideal para estudiar la función de los ARN no codificantes y su potencial como nuevas dianas terapéuticas.

Resumen

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Los MicroRNAs (miRNAs) son reguladores importantes de la expresión génica a través de su capacidad para desestabilizar el ARNm e inhibir la traducción de arNM objetivo. Un número cada vez mayor de estudios han identificado los miRNAs como biomarcadores potenciales para el diagnóstico y pronóstico del cáncer, y también como dianas terapéuticas, añadiendo una dimensión adicional a la evaluación y el tratamiento del cáncer. En el contexto del cáncer de tiroides, la tumorigenesis se debe no sólo a mutaciones en genes importantes, sino también a la sobreexpresión de muchos miRNAs. En consecuencia, el papel de los miRNA en el control de la expresión del gen tiroideo está evolucionando como un mecanismo importante en el cáncer. En este documento, presentamos un protocolo para examinar los efectos de la administración de inhibidores de miRNA como una modalidad terapéutica en el cáncer de tiroides utilizando xenoinjerto tumoral humano y modelos de ratón ortotópico. Después de diseñar células tumorales tiroideas estables que expresan GFP y luciferasa, las células se inyectan en ratones desnudos para desarrollar tumores, que pueden ser seguidos por bioluminiscencia. La inhibición in vivo de un miRNA puede reducir el crecimiento tumoral y regular las metas del gen del miRNA. Este método se puede utilizar para evaluar la importancia de un miRNA in vivo determinado, además de identificar nuevas dianas terapéuticas.

Introducción

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El cáncer de tiroides es una neoplasia maligna endocrina con una incidencia creciente, aunque en términos generales tiene un buen resultado1. Sin embargo, algunos pacientes desarrollan formas agresivas de la enfermedad que son intratables y las bases moleculares no se entienden mal2.

Los miRNAs son ARN no codificantes de 22 nucleótidos que regulan la expresión génica en muchos tejidos, normalmente por unión de pares de bases a la región no traslacional de 3' (3'UTR) de ARN mensajeros objetivo (RNRa), desencadenando la degradación del ARNm o la represión traslacional 3 <....

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Protocolo

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La experimentación con animales se llevó a cabo en cumplimiento de la Ley de la Comunidad Europea (86/609/CEE) y la ley española (R.D. 1201/2005), con la aprobación del Comité de ética del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, España).

1. Inoculación de flanco de células y tratamiento de antagomiR intratumoral

  1. Preparación celular
    1. Diseñar una línea celular de cáncer de tiroides humana Cal62 (mutaciones KRASG12R y p53A161D) para sobreexpresar una construcción transgénica que expresa constitutivamente GFP y luciferasa (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Seleccione las células....

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Resultados

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Usamos dos modelos de ratones diferentes para determinar si la neutralización de un miRNA podría suprimir el crecimiento tumoral. En consecuencia, las células de tiroides de tumores humanos Cal62-luc se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de ratones desnudos para generar un modelo de xenógrafo. Después de dos semanas, se establecieron tumores que se podían medir con pinzas. En ese momento, los ratones se inyectaron por vía intratumoral con el inhibidor del miR-146b, o un control adecuado, y se siguió el volumen .......

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Discusión

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Este artículo describe un método para estudiar la función in vivo de un miRNA con el fin de entender mejor su papel en la iniciación y progresión del tumor, y su potencial como diana terapéutica en el cáncer de tiroides. Los modelos de xenoinjerto tumoral aquí descritos se basan en el uso de células que pueden ser rastreadas por su señal de bioluminiscencia, permitiendo la medición del crecimiento tumoral in vivo bajo la influencia de un tratamiento. Además, describimos el uso de un tratamiento basado en miRNA para el cá.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Raquel Arocha Riesco por su ayuda en el tratamiento y cuidado de ratones. Agradecemos al Dr. J. Blanco (Instituto Catalán de Química Avanzada-CSIC) y al Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (España) por regalar las células CMV-Firefly luc- IRES-EGFP y Cal62-Luc, respectivamente.

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AntagomiR: Inhibidor del miARN mirVanaThermo Fisher4464088In Vivo Ready
Matrix Matrix: Matrigel Matrix de membrana basal de alta concentraciónCorning#354248
anticuerpo DICERAbcamab14601IHQ: 1/100
In vivo reactivo de administración: Reactivo Invivofectamine 3.0Thermo FisherIVF3005
In vivo software de imagen: IVIS-Lumina II Imaging SystemCaliper Life Sciences
miRNA, control negativo #1Thermo Fisher4464077In Vivo Ready
Anticuerpo PCNAAbcamab92552WB: 1/2.000
Anticuerpo PTENSanta Cruzsc-7974WB: 1/1.000
XenoLight D-Luciferin - Sustrato bioluminiscente de sal K+PerkinElmer122799diluido en PBS
Control negativo: mirVana Inhibidor de

Referencias

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  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al.

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Etiquetas

Inhibici n de microARNmodelo de c ncer de tiroidesinyecci n tumoral ortot picaim genes de bioluminiscenciatratamiento con antagomiRan lisis del crecimiento tumorall nea celular CAL 62modelo de rat n nudeinyecci n retroorbitariasustrato de D luciferina

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