Uso de la tinción de inmunofluorescencia en la cara para observar directamente las células endoteliales vasculares

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la tinción de inmunofluorescencia para observar las células endoteliales de la aorta del ratón directamente. Esta técnica es útil cuando se estudia el fenotipo celular y molecular de las células endoteliales en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis.

Resumen

Los cambios aberrantes en el fenotipo endotelial y la morfología se consideran eventos iniciales en la patogénesis de la aterosclerosis. La observación directa del endotelio intacto proporcionará información valiosa para comprender los eventos celulares y moleculares en las células endoteliales disfuncionales. Aquí, describimos una técnica de tinción de inmunofluorescencia en la cara modificada que permite a los científicos obtener imágenes claras de la superficie endotelial intacta y analizar los patrones de expresión de moléculas in situ. El método es simple y confiable para observar toda la monocapa endotelial en diferentes sitios de la aorta. Esta técnica puede ser una herramienta prometedora para entender la fisiopatología de la aterosclerosis, especialmente en una etapa temprana.

Introducción

Los primeros cambios en la vasculatura se inician principalmente en el endotelio, que funciona como una barrera selectiva entre la sangre y la pared del vaso con sus complejos de unión hermética intercelular¹. La evidencia sustancial apunta a un papel crítico para los efectos mecánicos del flujo sanguíneo en la modulación de la función endotelial². Tensión de cizallamiento fluido, fuerza de fricción generada por el flujo sanguíneo, da forma diferencial a lamorfología y función celular endotelial, dependiendo de los paradigmas de flujo específicos en diferentes sitios vasculares 2,

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghái.

1. Perfusión del ratón aorta

1. Brevemente, anestesia ratones C57BL/6 de 12 semanas de edad con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal). Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente la cola.
   NOTA: Si no se observa ningún movimiento, el animal está lo suficientemente anestesiado para iniciar los experimentos.
2. Pegue las patas del ratón a una pila de toallas de papel con cintas adhesivas.

Resultados

Un ratón C57BL/6 de 12 semanas de edad fue eutanasiado y perfundido con salina normal que contenía 40 unidades/ml de heparina y, entonces, preenfriado 4% paraformaldehyde. La aorta del ratón se expuso bajo un microscopio de disección (Figura1), diseccionada y cortada longitudinalmente (Figura2). En face la tinción de inmunofluorescencia de las células endoteliales vasculares se realizó como se ilustra en la F.......

Discusión

El endotelio está expuesto a numerosos factores proaterogénicos, incluyendo lípidos, mediadores inflamatorios, y tensión de cizallamiento fluido^1,11,12. La observación directa de las células endoteliales in situ proporciona las ventajas especiales para analizar los cambios en la morfología celular, las uniones intercelulares y los patrones de expresión de moléculas en respuesta a los estímulos de lesión.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Montaje antidecoloración	Servicebio	G1401
Pinza Delicada	RWD Ciencias de la Vida	F11001-11
Tijeras Delicadas	RWD Ciencias	S12003-09
Pinza de disección	RWD Ciencias de la Vida	F12005-10
Tijeras de resorte Mciro	RWD Ciencias de la Vida	S11001-08
Éter de polioxietileno octilfenilo (Triton X-100)	Amresco	M143
Polisorbato 20 (Tween 20)	Amresco	0777
Anticuerpo VCAM-1	Abcam	ab134047
Anticuerpo VE-Cadherin	BD Biosciences 555289
Alexa Fluor 555 etiquetado anti-conejo IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 marcado microscopio de escaneo láser anti-rata	IgG invitrogen	A-21208
nbsp;	Carl Zeiss

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