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Artículo de método

Identificación de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros

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DOI:

10.3791/59331

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24 de junio de 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, 2UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta una estrategia alternativa al método analógico tóxico convencional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos mediante el uso de marcadores ricos en codón raros para lograr precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente.

Resumen

Para satisfacer el creciente mercado de aminoácidos, se necesitan cepas de producción de alto rendimiento. Los aminoácidos sobreproductores se identifican convencionalmente aprovechando las competiciones entre los aminoácidos y sus análogos. Sin embargo, este método analógico es de baja precisión, y los análogos adecuados para aminoácidos específicos son limitados. Aquí, presentamos una estrategia alternativa que permite un cribado preciso, sensible y de alto rendimiento de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros. Esta estrategia se inspira en el fenómeno del sesgo de uso de codón en la traducción de proteínas, para el cual los codones se clasifican en comunes o raros en función de sus frecuencias de ocurrencia en el ADN de codificación. La traducción de codones raros depende de sus ARN de transferencia raras correspondientes (tRNAs), que no pueden ser completamente cargados por los aminoácidos cognados bajo inanición. Teóricamente, los tRNAs raros se pueden cargar si hay un excedente de los aminoácidos después de cargar los isoacceptors comunes sinónimos. Por lo tanto, las traducciones retardadas causadas por codones raros podrían restaurarse mediante la alimentación o las sobreproducciones intracelulares de los aminoácidos correspondientes. Bajo esta suposición, se establece un sistema de selección o cribado para identificar a los sobreproductores de aminoácidos reemplazando los codones comunes de los aminoácidos dirigidos por sus alternativas raras sinónimos en los genes de resistencia a los antibióticos o los genes codificación de proteínas fluorescentes o cromogénicas. Demostramos que las expresiones proteicas pueden verse obstaculizadas en gran medida por la incorporación de codones raros y que los niveles de proteínas se correlacionan positivamente con las concentraciones de aminoácidos. Usando este sistema, los sobreproductores de múltiples aminoácidos pueden ser fácilmente expulsados de las bibliotecas de mutaciones. Esta estrategia basada en codón raro sólo requiere un solo gen modificado, y el huésped es menos propenso a escapar de la selección que en otros métodos. Ofrece un enfoque alternativo para la obtención de aminoácidos sobreproductores.

Introducción

La producción actual de aminoácidos depende en gran medida de la fermentación. Sin embargo, los valoradores y rendimientos para la mayoría de las cepas de producción de aminoácidos están por debajo de las crecientes demandas del mercado global de aminoácidos que vale miles de millones de dólares1,2. La obtención de sobreproductores de aminoácidos de alto rendimiento es fundamental para la actualización de la industria de aminoácidos.

La estrategia tradicional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos explotalas competiciones entre los aminoácidos y sus análogos en la síntesis de proteínas 3,4. Estos análogos son capaces de cargar los tRNA que reconocen los aminoácidos correspondientes y así inhibir las elongaciones de las cadenas de péptidos, lo que conduce a un crecimiento detenido o muerte celular5. Una manera de resistir las tensiones analógicas es aumentar las concentraciones de aminoácidos intracelulares. Los aminoácidos enriquecidos superarán a los análogos para los tRNA finitos y asegurarán la síntesis correcta de proteínas funcionales. Por lo tanto, las cepas que sobreviven a los análogos pueden ser seleccionados y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos correspondientes.

Aunque resultó exitoso en la selección de los sobreproductores para aminoácidos como L-leucina6, la estrategia basada en analógico sufren de graves inconvenientes. Una preocupación importante es la resistencia analógica originada por el proceso de mutagénesis o a través de mutaciones espontáneas. Las cepas con resistencia pueden escapar de la selección bloqueando, exportando o degradando los análogos5. Otra preocupación son los efectos secundarios tóxicos de los análogos en otros procesos celulares7. Como consecuencia, las cepas que sobreviven a la selección analógica pueden no ser los sobreproductores de aminoácidos, mientras que los sobreproductores deseados podrían ser falsamente exterminados debido a los efectos secundarios negativos.

Aquí, se presenta una estrategia novedosa basada en la ley del sesgo de codón con el fin de lograr identificaciones precisas y rápidas de los sobreproductores de aminoácidos. La mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un triplete de nucleótidos que es favorecido de manera diferente por los organismos huésped8,9. Algunos codones rara vez se utilizan en las secuencias de codificación y se conocen como los codones raros. Sus traducciones en aminoácidos se basan en los tRNAs cognados que llevan los aminoácidos correspondientes. Sin embargo, los arnms que reconocen codones raros suelen tener abundancias mucho más bajas que los arba de los codones comunes10,11. En consecuencia, estos raros tRNAs son menos propensos a capturar los aminoácidos libres en las competiciones con otros isoaceptadores, y las traducciones de las secuencias ricas en codón raro comienzan a desacelerar se o incluso se terminan cuando las cantidades de aminoácidos son limitadas 10. Las traducciones podrían, teóricamente, restaurarse si hay un excedente de aminoácidos después de cargar los TRNA comunes sinónimos debido a sobreproducciones o alimentación adicional de los aminoácidos correspondientes12. Si el gen rico en codón raro codifica un marcador de selección o cribado, las cepas que presentan los fenotipos correspondientes pueden identificarse fácilmente y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos.

La estrategia anterior se aplica para establecer una selección y un sistema de cribado para la identificación de los sobreproductores de aminoácidos. El sistema de selección utiliza genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanR) como marcadores, mientras que el sistema de cribado utiliza los genes que codifican las proteínas fluorescentes fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes [GFP]) o cromogénicas (por ejemplo, PrancerPurple). Los genes marcadores en ambos sistemas se modifican reemplazando los números definidos de los codones comunes para el aminoácido dirigido por su rara alternativa sinónima. Las cepas de la biblioteca de mutaciones que albergan el gen marcador rico en codón raro se seleccionan o examinan en condiciones adecuadas, y los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos pueden ser fácilmente identificados. El flujo de trabajo comienza con la construcción del sistema genético marcador rico en codón poco raro, seguido de la optimización de las condiciones de trabajo, y luego la identificación y verificación de los aminoácidos sobreproductores. Esta estrategia independiente del análogo se basa en el dogma en la traducción de proteínas y se ha verificado prácticamente para permitir la identificación precisa y rápida de los sobreproductores de aminoácidos. Teóricamente, podría emplearse directamente a aminoácidos con codones raros y a todos los microorganismos. En total, la estrategia basada en codón raro servirá como una alternativa eficiente al enfoque convencional basado en analógico cuando los análogos adecuados para aminoácidos específicos no están disponibles, o cuando una alta tasa de falsos positivos es la principal preocupación. El siguiente protocolo utiliza leucina rara codón para demostrar esta estrategia en la identificación de los sobreproductores de Escherichia coli L-leucina.

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Protocolo

1. Construcción de los plásmidos que expresan los genes marcadores ricos en codón raros

  1. Seleccione un gen marcador que contenga un número adecuado de codones comunes para el aminoácido dirigido.
    NOTA: Para la L-leucina, el gen de resistencia a la kanamicina kanR, que contiene 29 codones de leucina, de los cuales 27 son codones comunes, se utiliza para la construcción del sistema de selección13. El gen gfp, que contiene 17 codones comunes de 19 codones de leucina, o el gen de codificación de proteínas púrpuraprancerpurple (ppg), que alberga 14 codones comunes de leucina, se utiliza para el sistema de cribado (TablaSuplementaria 1 ).
  2. Sustituya los codones comunes en los genes marcadores por el codón raro sinónimo. Para L-leucina, sustituya sus codones en kanR, gfpo ppg por el raro codón CTA, generando kanR-RC, gfp-RCo ppg-RC, respectivamente13 ( Tabla Complementaria 1).
    NOTA: La frecuencia del codón raro en los genes marcadores afectará a la rigel del sistema de selección o cribado. En general, aumentar el número de codones raros aumentará la rigeldel del sistema de selección o cribado. Para lograr la selección o la fuerza de cribado adecuada, diseñe una serie de genes marcadores que albergan diferentes números de codones raros y compare sus efectos.
  3. Genere bloques de construcción de los genes marcadores ricos en codón raros utilizando herramientas como GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) para la síntesis de genes. Alternativamente, ordene los genes marcadores de los servicios comerciales de síntesis de genes.
    1. En la página GeneDesign, elija Diseño de bloquesed.
    2. Pegue las secuencias de los genes marcadores ricos en codón raro en el cuadro Secuencia.
    3. Defina la longitud de superposición entre los oligos de ensamblaje; tenga en cuenta que el valor predeterminado 40 bp funciona bien para la mayoría de las secuencias.
      NOTA: Consulte el manual en línea para obtener más instrucciones sobre la configuración de los demás parámetros.
    4. Haga clic en el botón Diseñar bloques de creación y ordene los oligonucleótidos que aparecen en la página.
  4. Sintetizar los genes modificados con codón raro mediante la síntesis precisa basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)15.
  5. Ligar el kan raro-rico en codón R-RC a vector pET-28a, gfp-RC a pSB1C3, y ppg-RC a CPB-37-44116.
    NOTA: Los mapas plásmidos pET-28a y pSB1C3 están disponibles en la base de datos de plásmido en línea SnapGene (TablaSuplementaria 1); el mapa de plásmido CPB-37-441 está disponible en el sitio web de proteínacromogénica DE ATUM.
    1. En hielo, agregue el vector y los fragmentos del marcador en una relación molar de 1:1 a 7,5 l de mezcla de ensamblaje (ver Tabla de Materiales)a un volumen total de 10 l. Incubar la muestra a 50oC durante 1 h.
    2. Transformar 5 ml del producto de montaje en 50 s de celdas competentes (ver la Tabla de Materiales)a 42 oC durante 30 s.
    3. Recuperar las células en SOC (caldo súper óptimo con represión catabolizada) medio a 37 oC durante 1 h, placarlas en el medio de agar LB (caldo de lisógena), e incubarlas a 37 oC durante la noche.
    4. Inocular la colonia en medio LB e incubar a 37oC durante 8 h.
    5. Aísle el plásmido utilizando un kit comercial preferido.

2. Optimización de las condiciones de selección

  1. Convierta la cepa padre utilizada para la mutagénesis en células competentes17.
  2. Transformar 50 l de las células competentes con 1 l de plásmido que lleva el kanRde tipo salvaje, y transformar otro conjunto de las células competentes con el plásmido que contiene kanR-RC29 con todo el codón de leucina reemplazado por el raro codón CTA.
  3. Añadir 950 s l de medio SOC e incubar la muestra en una coctelera a 250 rpm a 37 oC durante 1 h.
  4. Placa 100 l del cultivo celular en el medio de agar LB que contiene 50 g-ml-1 kanamicina, e incubarla a 37 oC durante aproximadamente 8 h hasta que aparezcan las colonias.
  5. Escoge las colonias que albergan el kanR de tipo salvaje y el kanR-RC29 rico en codón raro y leucina y úsalas cada una para inocular 5 ml de medio LB diluido cinco (0,2x LB) que contiene 50 g-ml-1 kanamicina. Incubar las muestras en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
    NOTA: El medio es crucial para el sistema de selección. Debe contener suficiente carbono y nitrógeno para permitir la expresión de la proteína de resistencia a los antibióticos del gen de tipo salvaje en lugar de los derivados modificados con codón raro. En este caso, la concentración de L-leucina en 1x medio LB es demasiado alta para inhibir completamente la expresión proteica de la kanRrica en codón raro. Por lo tanto, un medio LB diluido con un factor de dilución como 5 se utiliza para generar una clara diferencia en las expresiones proteicas del tipo salvaje y los genes ricos en codón raros.
  6. Transfiera 200 ml de cada uno de los cultivos celulares a una placa de 96 pocillos en triplicado en puntos de tiempo definidos (por ejemplo, 8 h, 16 h y 24 h). Mida el OD600 (densidad óptica a 600 nm) utilizando un lector de placas.
    NOTA: Si no se puede detectar una disminución en la célula OD600 para las cepas que albergan los genes marcadores ricos en codón poco raros en comparación con la OD600 de la cepa que alberga los genes marcadores de tipo salvaje, trate de aumentar la cantidad de codón raro en el marcadores o utilizar un medio más diluido.
  7. Realizar el ensayo de alimentación de aminoácidos para probar si las expresiones de los genes marcadores ricos en codón raro (por ejemplo, kanR-RC29) se pueden restaurar aumentando la concentración de los aminoácidos dirigidos.
    NOTA: Para la selección de sobreproductores de L-leucina, L-leucina se utiliza para la alimentación.
    1. Inocular las cepas que albergan el gen marcador kanR-RC29 en 5 ml de la LB de 0,2x (que contiene 50 g-mL-1 kanamicina) con o sin el suministro de 1 g. L-1 L-leucina. Inocular otros 5 ml del 0,2x LB con cepas que albergan el kanR de tipo salvaje como control. Incubar las muestras en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
    2. Mida el OD600 para cada cultivo en puntos de tiempo definidos (por ejemplo, 15 h, 17 h, 19 h y 22 h).

3. Optimización de las condiciones de cribado

  1. Transformar 50 l de la cepa padre utilizada para la mutagénesis con 1 l de plásmido (50 ng-L-1) que lleva el gfp de tipo salvaje o el ppgde tipo salvaje. Además, transforma la cepa principal con los derivados ricos en codón raro de los genes marcadores.
  2. Añadir 950 s l de medio SOC e incubar la muestra en una coctelera a 250 rpm a 37 oC durante 1 h.
  3. Placa 100 l del cultivo celular en el medio de agar LB que contiene los antibióticos apropiados (25 g-mL-1 cloranfenicol para el plg plásmido que lleva un marcador R cm, o 50 g-mL-1 kanamicina para el ppg plásmido que lleva un marcador kanR) e incubar durante la noche a 37 oC.
  4. Elija una colonia que alberga el gfp o ppg de tipo salvaje y una colonia que alberga el derivado correspondiente rico en codón raro, y transferirlos a 5 ml del medio LB debidamente diluido individualmente. Incubar las muestras en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
    NOTA: Para las cepas de E. coli que albergan el gfp-RC o ppg-RCrico en leucina rara-codon, el medio LB sin diluir (1x LB) se puede utilizar para crear diferencias significativas en las expresiones del tipo salvaje y el marcador de codón raro rico en codón Genes. Además, los promotores inducibles se utilizan para impulsar las expresiones de los genes marcadores de cribado. Comience la inducción cuando las células entren en la fase exponencial para lograr mejores discriminaciones.
  5. Para los marcadores de fluorescencia, transfiera 200 ml de cada uno de los cultivos celulares a una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos en triplicado en puntos de tiempo definidos (por ejemplo, 2 h, 4 h y 6 h). Mida el OD600 y la fluorescencia y calcule la intensidad de la fluorescencia (la relación de fluorescencia a600oD). Para marcadores cromogénicos, mida el desarrollo de color de los cultivos celulares.
    NOTA: Si no se pueden detectar intensidades de fluorescencia más bajas para las cepas que albergan el gfp-RC en comparación con la de las cepas que albergan el gfpde tipo salvaje, o si no se puede detectar un color más claro para las células que expresan la proteína púrpura del ppg-RC que del gen de tipo salvaje, trate de aumentar el número de codón raro en los genes marcadores o utilice un medio más diluido.
  6. Realice el ensayo de alimentación (véanse los pasos 2.7.1 y 2.7.2). Mida la intensidad de la fluorescencia o el desarrollo del color en los puntos de tiempo definidos (por ejemplo, 12 h, 18 h y 24 h).

4. Identificación de los aminoácidos sobreproductores

  1. Inocular 100 l de la cultura de los mutantes en 5 ml de medio LB (2% v/v) e incubarlo en una coctelera a 250 rpm a 37 oC hasta que los valores de OD600 alcancen 0,4.
  2. Convierte a los mutantes en células competentes17.
  3. Transformar 50 l de las células mutantes con 1 l de plásmido (50 ng-L-1) llevando el marcador de selección kanR-RC29 o los marcadores de cribado gfp-RC o ppg-RC. Añadir 950 sl de medio SOC y girar la muestra en una coctelera de 37 oC durante 1 h.
  4. Seleccione sobreproductores de aminoácidos.
    1. Centrifugar el cultivo celular a 4.000 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y añadir 5 ml de medio de 0,2x LB que contenga 50 g-mL-1 kanamicina. Incubar la muestra en una coctelera de 37 oC durante la noche.
    2. Placa rinde el cultivo nocturno (p. ej., 100 l, depende de la densidad celular del cultivo) en un medio de agar LB de 0,2x que contiene 50 g-mL-1 kanamicina e incubaa a 37 oC durante 12 h.
      NOTA: Las colonias desarrolladas son los candidatos de los sobreproductores de aminoácidos dirigidos y, en este caso, los sobreproductores de L-leucina.
  5. Prueba los aminoácidos sobreproductores.
    1. Placar el número adecuado de células (p. ej., 100 l) que albergan el marcador de cribado (como se describe en el paso 4.3) en el medio de agar LB que contiene el antibiótico adecuado (25 g-ml-1 cloranfenicol para el cribado con gfp-RC y 50 g-ml -1 kanamicina para cribado con ppg-RC) e incubar a 37oC durante 8 h.
    2. Inocular el medio DE LB que contiene el antibiótico adecuado (ver paso 4.5.1) con cada colonia de la placa. Incubar las muestras en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
    3. Mida el OD600 y la fluorescencia y calcule la intensidad de la fluorescencia si se utiliza gfp-RC. Mida el desarrollo de color de los cultivos celulares si se utiliza ppg-RC. Tenga en cuenta que las cepas que presentan una mayor intensidad de fluorescencia o un color más profundo que el de la cepa madre son los sobreproductores de aminoácidos candidatos y, en este caso, los sobreproductores de L-leucina.
      NOTA: La clasificación celular activada por fluorescencia también es adecuada para identificar a los productores de alta célula de una sola célula cuando se utilizan genes de proteínas fluorescentes ricos en codón raros para el cribado.
  6. Verificar las productividades de aminoácidos de las cepas candidatas.
    1. Inocular 5 ml de medio LB con cada una de las cepas candidatas y dejar que las células crezcan durante la noche en una coctelera a 250 rpm a 37 oC.
    2. Cosecha las células de 1 ml del cultivo celular por centrifugación a 4.000 x g durante 2 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 1 ml de agua estéril.
    3. Inocular 20 ml de medio M9 que contenga un 4% de glucosa con 200 ml de la suspensión celular e incubar en una coctelera de 250 ml a 250 rpm a 37oC durante 24 h.
    4. Centrífuga 1 ml del medio de cultivo a 4.000 x g durante 5 min. Transfiera 200 l del sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 ml. Preparar soluciones de L-leucina (grado HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 y 1 g. L-1 como estándares.
    5. Añadir 100 l de trietilamina de 1 mM y 100 l de isotiocianato de fenilo de 1 M al sobrenadante y a las normas, mezclarlos suavemente e incubarlos a temperatura ambiente durante 1 h18.
      ADVERTENCIA: La trietilamina y el isotiocianato de fenilo pueden causar quemaduras graves en la piel y daños en los ojos y son perjudiciales si se inhalan. Use guantes y una máscara y, si es posible, realice este paso en una campana de humo.
    6. Añadir 400 s de n-hexano al mismo tubo y vórtice durante 10 s. Filtrar la fase inferior que contiene los derivados de aminoácidos a través de una membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 m.
      ADVERTENCIA: n-hexano puede causar irritación de la piel. Use guantes y ropa protectora. Si entra en contacto con la piel, enjuague la piel con abundante agua.
    7. Preparar la fase móvil A mezclando 0,1 M de acetato de sodio (pH 6,5) y acetonitrilo en una proporción volumétrica de 99,3:0,7. Preparar acetonitrilo (80% v/v) como fase móvil B. Filtrar todas las fases móviles a través de membranas de politetrafluoroetileno de 0,2 m.
      ADVERTENCIA: El acetonitrilo es dañino si se inhala y puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Use guantes y ropa protectora y realice este paso en una campana de humo.
    8. Ejecutar 1 l de la muestra en un ultra-HPLC equipado con una columna C18 de acuerdo con el programa de elución en la Tabla 1 con un caudal de 0,42 ml-min-1 y una temperatura de columna de 40 oC. Detectar los aminoácidos objetivo a 254 nm con un detector de matriz de diodos y calcular sus concentraciones mediante la asignación de las áreas pico a la curva estándar.
Tiempo (min)Fase móvil A (%)Fase móvil B (%)
0982
3.57030
74357
7.10100
11982

Tabla 1: Programa de elución para la cuantificación de aminoácidos.

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Resultados

Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de600 OD para las cepas que albergan el gen de resistencia a los antibióticos ricos en codón poco raros en comparación con la cepa que alberga el gen de resistencia a los antibióticos de tipo salvaje cuando se cultiva en un medio(Figura 1a). En las mismas condiciones, la disminución de la OD600 celular se hace más evidente a medida que aumenta el número de codones raro...

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Discusión

El número de codones raros en los genes marcadores y el medio de selección o cribado son críticos para inhibir las expresiones proteicas de los genes marcadores modificados con codón raro. Si no se puede detectar ninguna diferencia significativa entre las expresiones proteicas de los genes marcadores de tipo salvaje y sus derivados, aumentar el número de codones raros o usar un medio limitado por nutrientes puede amplificar las diferencias. Sin embargo, si el efecto de inhibición es demasiado fuerte, las expresiones prot...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado conjuntamente por la National Natural Science Foundation of China (subvención no 21676026), el Programa Nacional de I+D Clave de China (concesión no 2017YFD0201400) y la China Postdoctoral Science Foundation (concesión no 2017M620643). Las obras en el Instituto de Avance de la UCLA (Suzhou) fueron apoyadas por las subvenciones internas de la provincia de Jiangsu y el Parque Industrial de Suzhou.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetonitriloThermo51101
EasyPure HiPure Plásmido MiniPrep KitTransgenEM111-01
EasyPure Kit de Extracción Rápida de Gel TransgenEG101-01
Gibson Mezcla maestra de ensamblajeNEBE2611S
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósidoSolarbioI8070
L-leucinaSigmaL8000
Lector de microplacasBiotekSynergy 2
n-hexanoThermoH3061
Isotiocianato de feniloSigmaP1034
PrancerPurple CPB-37-441ATUMCPB-37-441
TransStar FastPfu Fly ADN polimerasaTransgenAP231-01
TrietilaminaSigmaT0886
Cromatografía líquida de ultra alta resoluciónAgilent1290 Infinity II
Tipo salvaje C. glutamicumATCC13032
XL10-Gold E. coli célula competenteAgilent200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 columnaAgilent959759-902K

Referencias

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