Identificación de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros

Resumen

Este estudio presenta una estrategia alternativa al método analógico tóxico convencional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos mediante el uso de marcadores ricos en codón raros para lograr precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente.

Resumen

Para satisfacer el creciente mercado de aminoácidos, se necesitan cepas de producción de alto rendimiento. Los aminoácidos sobreproductores se identifican convencionalmente aprovechando las competiciones entre los aminoácidos y sus análogos. Sin embargo, este método analógico es de baja precisión, y los análogos adecuados para aminoácidos específicos son limitados. Aquí, presentamos una estrategia alternativa que permite un cribado preciso, sensible y de alto rendimiento de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros. Esta estrategia se inspira en el fenómeno del sesgo de uso de codón en la traducción de proteínas, para el cual los codones se clasifican en comunes o raros en función de sus frecuencias de ocurrencia en el ADN de codificación. La traducción de codones raros depende de sus ARN de transferencia raras correspondientes (tRNAs), que no pueden ser completamente cargados por los aminoácidos cognados bajo inanición. Teóricamente, los tRNAs raros se pueden cargar si hay un excedente de los aminoácidos después de cargar los isoacceptors comunes sinónimos. Por lo tanto, las traducciones retardadas causadas por codones raros podrían restaurarse mediante la alimentación o las sobreproducciones intracelulares de los aminoácidos correspondientes. Bajo esta suposición, se establece un sistema de selección o cribado para identificar a los sobreproductores de aminoácidos reemplazando los codones comunes de los aminoácidos dirigidos por sus alternativas raras sinónimos en los genes de resistencia a los antibióticos o los genes codificación de proteínas fluorescentes o cromogénicas. Demostramos que las expresiones proteicas pueden verse obstaculizadas en gran medida por la incorporación de codones raros y que los niveles de proteínas se correlacionan positivamente con las concentraciones de aminoácidos. Usando este sistema, los sobreproductores de múltiples aminoácidos pueden ser fácilmente expulsados de las bibliotecas de mutaciones. Esta estrategia basada en codón raro sólo requiere un solo gen modificado, y el huésped es menos propenso a escapar de la selección que en otros métodos. Ofrece un enfoque alternativo para la obtención de aminoácidos sobreproductores.

Introducción

La producción actual de aminoácidos depende en gran medida de la fermentación. Sin embargo, los valoradores y rendimientos para la mayoría de las cepas de producción de aminoácidos están por debajo de las crecientes demandas del mercado global de aminoácidos que vale miles de millones de dólares^1,2. La obtención de sobreproductores de aminoácidos de alto rendimiento es fundamental para la actualización de la industria de aminoácidos.

La estrategia tradicional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos explotalas competiciones entre los aminoácidos....

Protocolo

1. Construcción de los plásmidos que expresan los genes marcadores ricos en codón raros

1. Seleccione un gen marcador que contenga un número adecuado de codones comunes para el aminoácido dirigido.
   NOTA: Para la L-leucina, el gen de resistencia a la kanamicina kan^R, que contiene 29 codones de leucina, de los cuales 27 son codones comunes, se utiliza para la construcción del sistema de selección¹³. El gen gfp, que contiene 17 codones comunes de 19 codones de leucina, o el gen de codificación de proteínas púrpuraprancerpurple (ppg), que alberga 14 codones comunes de leucina, se utiliza para....

Resultados

Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de₆₀₀ OD para las cepas que albergan el gen de resistencia a los antibióticos ricos en codón poco raros en comparación con la cepa que alberga el gen de resistencia a los antibióticos de tipo salvaje cuando se cultiva en un medio(Figura 1a). En las mismas condiciones, la disminución de la OD₆₀₀ celular se hace más evidente a medida que aumenta el número de codones raro.......

Discusión

El número de codones raros en los genes marcadores y el medio de selección o cribado son críticos para inhibir las expresiones proteicas de los genes marcadores modificados con codón raro. Si no se puede detectar ninguna diferencia significativa entre las expresiones proteicas de los genes marcadores de tipo salvaje y sus derivados, aumentar el número de codones raros o usar un medio limitado por nutrientes puede amplificar las diferencias. Sin embargo, si el efecto de inhibición es demasiado fuerte, las expresiones prot.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetonitrilo	Thermo	51101
EasyPure HiPure Plásmido MiniPrep Kit	Transgen	EM111-01
EasyPure Kit de Extracción Rápida de Gel Transgen		EG101-01
Gibson Mezcla maestra de ensamblaje	NEB	E2611S
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido	Solarbio	I8070
L-leucina	Sigma	L8000
Lector de microplacas	Biotek	Synergy 2
n-hexano	Thermo	H3061
Isotiocianato de fenilo	Sigma	P1034
PrancerPurple CPB-37-441	ATUM	CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly ADN polimerasa	Transgen	AP231-01
Trietilamina	Sigma	T0886
Cromatografía líquida de ultra alta resolución	Agilent	1290 Infinity II
Tipo salvaje C. glutamicum	ATCC	13032
XL10-Gold E. coli célula competente	Agilent	200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 columna	Agilent	959759-902K