Una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular y la supervivencia en células de mamíferos cultivadas a un rendimiento bajo a moderado

Resumen

A menudo es necesario evaluar la citotoxicidad potencial de un conjunto de compuestos en las células cultivadas. Aquí, describimos una estrategia para detectar compuestos tóxicos de forma fiable en un formato de 96 pozos.

Resumen

La citotoxicidad es un parámetro crítico que debe cuantificarse al estudiar fármacos que pueden tener beneficios terapéuticos. Debido a esto, muchos ensayos de detección de drogas utilizan citotoxicidad como una de las características críticas a perfilar para compuestos individuales. Las células en cultivo son un modelo útil para evaluar la citotoxicidad antes de proceder a dar seguimiento a compuestos de plomo prometedores en modelos animales más costosos e intensivos en mano de obra. Describimos una estrategia para identificar compuestos que afectan el crecimiento celular en una línea de células madre neuronales humanas (NSC) que expresan tdTomato. La estrategia utiliza dos ensayos complementarios para evaluar el número de celdas. Un ensayo funciona a través de la reducción de 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-dphenyltetrazolium bromide (MTT) al formazan como apoderado del número de celda y el otro cuenta directamente el tdTomato que expresa NSC. Los dos ensayos se pueden realizar simultáneamente en un solo experimento y no son intensivos en mano de obra, rápidos y baratos. La estrategia descrita en esta demostración probó 57 compuestos en una pantalla primaria exploratoria para la toxicidad en un formato de placa de 96 pocillos. Tres de los éxitos se caracterizaron aún más en una respuesta de dosis de seis puntos utilizando la misma configuración de ensayo que la pantalla principal. Además de proporcionar una excelente corroboración de la toxicidad, la comparación de los resultados de los dos ensayos puede ser eficaz en la identificación de compuestos que afectan a otros aspectos del crecimiento celular.

Introducción

Una de las características más importantes que debe determinarse para un compuesto químico que tiene potencial terapéutico es su toxicidad para las células animales. Esta característica determinará si un medicamento es un buen candidato para un estudio más extenso. En la mayoría de los casos, se buscan compuestos con toxicidad mínima, pero hay situaciones en las que un compuesto con capacidad para matar tipos de células específicas es de interés, por ejemplo, fármacos antitumoraligénicos. Aunque los animales enteros son los mejores sistemas modelo para determinar la toxicidad sistémica, el costo y la mano de obra implicadas es prohibitivo cuando es necesario probar má....

Protocolo

1. Cultura del NSC

NOTA: La manipulación de una línea NSC humana se describirá a continuación, pero cualquier línea celular se puede utilizar para este protocolo. Todo el trabajo de cultivo celular se realiza en un gabinete de seguridad biológica.

1. Recubrir una placa de 96 pocillos con membrana de sótano/matriz extracelular (ECM).
   1. Descongelar la alícuota de ECM(Tabla de Materiales),lo que facilitará la fijación de NSC, sobre hielo. Diluir ECM a la concentración adecuada (generalmente 1:100) en un medio base de 10 ml(Tabla de materiales)y añadir 50 ml por pocto a cada uno de los 60 pozos int....

Resultados

Los datos automatizados del recuento de células identificaron once compuestos con menos del 25% de viabilidad cuando se normalizan al control DMSO, mientras que los datos MTT identificaron estos mismos compuestos más dos adicionales(Tabla 1 y Tabla 2,rojo sombreado). Los dos compuestos encontrados tóxicos sólo en el ensayo MTT (pozos F3 y G10) tenían 31% y 39%, respectivamente, el número de células tdTomato-positivas como el control y por orden de rango fueron los dos compuestos más tóxi.......

Discusión

El objetivo principal de este artículo era describir una estrategia que pudiera identificar de manera eficiente y económica compuestos que afectan el crecimiento celular en un cribado de bajo a moderado rendimiento. Se utilizaron dos técnicas ortogonales para evaluar el número de células para aumentar la confianza en las conclusiones y ofrecer información adicional que no estaría disponible si solo se utilizara un solo ensayo. Uno de los ensayos utilizó un imager de células fluorescentes para contar directamente las célu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Componente del medio de células madre neurales.
Pipeta de sobremesa	Sorenson Bioscience	73990	Proporciona la capacidad de pipetear la biblioteca de compuestos en una placa de 96 pocillos de una sola vez.
BioLite multiplato de 96 pocillos	Thermo Scientific 130188		Cualquier placa de cultivo celular de 96 pocillos funcionará.  Los usamos en nuestro trabajo.
Microscopio de cultivo celular	Nikon	Eclipse TS100	Inspección visual de las células para garantizar la densidad adecuada.
Cytation 5/ Lector de imágenes	BioTek	CYT3MFV	Se utiliza para la obtención de imágenes celulares y lecturas de absorbancia.
DMSO	Fisher Scientific		610420010 Disolvente para compuestos utilizados en cribado. Disuelve los precipitados MTT para facilitar las mediciones de absorbancia.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Componente del medio de células madre neurales.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Matriz de membrana basal de células madre neurales. Permite que las células se adhieran a las placas de cultivo celular.
Gen5 3.04	Software de análisis BioTek		para determinar el recuento de células para las células que expresan tdTomato.
Glutamina	ThermoFisher Scientific	25030081	componente del medio de células madre neurales.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Almacenamiento de bibliotecas de compuestos.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Reactivo de ensayo activo para determinar la viabilidad celular.
Pipeta multicanal	Rainin	E8-1200	Adición columna por columna de medio de cultivo celular, MTT o DMSO.
Medio neurobasal	ThermoFisher Scientific	21103049	Medio base de células madre neurales.
Filtro RFP de cubo	BioTek	1225103	en Cytation 5 utilizado para obtener imágenes de células que expresan tdTomato.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Reactivo de disociación celular.