Artículo de método

Biosíntesis de un Flavonol de un Flavanone estableciendo una cascada bienimática de un solo pozo

DOI:

10.3791/59336

⸱

14 de agosto de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, 2Key Laboratory of Prevention and Control of Biological Hazard Factors (Animal Origin) for Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture of China, Yangzhou University, 3Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety, Yangzhou University, 4Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 5The Testing Center, Yangzhou University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La derivación de un flavonol es crucial para su aplicación en la salud y la industria alimentaria. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la biosíntesis de un flavonol de una flavanona y discutimos los pasos cruciales y sus ventajas sobre otros enfoques.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los flavonols son una subclase importante de flavonoides con una variedad de actividades biológicas y farmacológicas. Aquí, proporcionamos un método para la síntesis enzimática in vitro de un flavonol. En este método, Atf3h y Atfls1, dos genes clave en la vía biosintética de los flavonols, se clonan y se sobreexpresan en Escherichiacoli. Las enzimas recombinantes se purifican a través de una columna de afinidad y luego se establece una cascada bienimática en un tampón sintético específico. Dos flavonols se sintetizan en este sistema como ejemplos y se determinan mediante análisis TLC y HPLC/LC/MS. El método muestra ventajas obvias en la derivación de flavonols sobre otros enfoques. Es ahorro de tiempo y mano de obra y altamente rentable. La reacción es fácil de controlar con precisión y, por lo tanto, se amplía para la producción en masa. El producto objetivo se puede purificar fácilmente debido a los componentes simples en el sistema. Sin embargo, este sistema se limita generalmente a la producción de un flavonol a partir de una flavanona.

Introducción

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Los flavonols son una subclase importante de flavonoides vegetales y participan en el desarrollo de plantas y pigmentación1,2,3. Más importante aún, estos compuestos poseen una amplia gama de actividades beneficiosas para la salud, tales como contraelcancero4,5, antioxidante6, antiinflamatorio7, antiobesidad8, antihipertensivo9 , y las propiedades de memoria10,lo que conduce a un gran número de estudios sobre estos metabolitos secundarios derivados de plantas. Tradicionalmente, estos compuestos se derivan principalmente de la extracción de plantas utilizando disolventes orgánicos. Sin embargo, debido a su muy bajo contenido en plantas11,12,13, el costo de producción para la mayoría de los flavonols sigue siendo alto, lo que impone grandes restricciones a su aplicación en la salud y los alimentos Industria.

Durante las últimas décadas, los científicos han desarrollado un buen número de métodos para derivar flavonoides14,15. Sin embargo, la síntesis química de estas moléculas complicadas posee una variedad de desventajas intrínsecas16. Requiere no sólo reactivos tóxicos y condiciones de reacción extremas, sino también muchos pasos para producir un compuesto flavonoides objetivo14,17. Además, otro desafío importante en esta estrategia es la síntesis quiral de moléculas flavonoides activas. Por lo tanto, no es una estrategia ideal para producir flavonoides a escala comercial a través de la síntesis química16,17.

Recientemente, los científicos han desarrollado una estrategia alternativa prometedora para producir estos complicados compuestos naturales mediante la ingeniería de microbios con una vía para la biosíntesis de flavonoides18,19,20, 21 , 22, que ha sido descifrado con éxito en las plantas23. Por ejemplo, Duan y otros introdujeron una vía biosintética en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae para producir kaempferol (KMF)24. Malla et al. produjeron astracpuedeína, un flavonol glucosilado, mediante la introducción deflavanona 3-hidroxilasa (f3h), flavonol sintasa (fls1), y UDP-glucosa:flavonoide 3-O-glucosidasa UGT78K1 genes en Escherichia coliBL21(DE3)17. A pesar de que hay bastantes paradigmas, no todos los microbios genéticamente modificados producen los productos de interés debido a la complejidad de una plataforma celular, la incompatibilidad entre los elementos genéticos sintetizados artificialmente y los anfitriones, el efecto de los productos objetivo contra las células huésped, y la inestabilidad de un sistema celular de ingeniería en sí16.

Otra estrategia alternativa prometedora para la producción de flavonoides es establecer una cascada multienzimática in vitro. Cheng y otros. han informado de que los policítlos de enterocina se pueden sintetizar con éxito mediante el montaje de una vía enzimática completa en una olla25. Esta estrategia sintética sin células elude las restricciones de una fábrica de producción microbiana y por lo tanto es factible para producir algunos flavonoides en gran cantidad16.

Recientemente, hemos desarrollado con éxito un sistema sintético de bienzima para convertir la naringenina (NRN) en KMF en una olla16. Aquí, describimos este sistema con grandes detalles y los métodos involucrados en el análisis de los productos. También presentamos dos ejemplos que utilizan este sistema para producir KMF a partir de NRN y quercetina (QRC) de eriodictyol (ERD). Además, discutimos los pasos cruciales de este método y las futuras direcciones de investigación en la biosíntesis de flavonoides.

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Protocolo

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1. Aislar el ARN total de los tejidos vegetales26,27

  1. Homogeneizar los tejidos vegetales.
    1. Recoger 100 mg de un tejido vegetal fresco (por ejemplo, plántulas de 4 semanas de Arabidopsis thaliana). Congele el tejido y un mortero con nitrógeno líquido, seguido de moler el tejido en polvo.
    2. Añadir 1 ml de reactivo de aislamiento de ARN (ver Tabla de Materiales)en el mortero. El reactivo se congelará inmediatamente. Homogeneizar la muestra de tejido con el pestillo cuando el reactivo congelado se derrite.
    3. Transfiera el homogeneizado a un tubo de 1,5 ml, centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 oC y, a continuación, transferir la solución homogeneizada despejada a otro tubo fresco de 1,5 ml.
    4. Incubar la muestra homogeneizada a temperatura ambiente durante 5 min.
  2. Aísle el ARN total.
    1. Añadir 0,2 ml de cloroformo al homogeneato, tapar el tubo de forma segura, agitar el tubo vigorosamente a mano durante 15 s e incubar la muestra a temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 15 min a 4 oC y transferir la fase acuosa superior incolora a un tubo fresco de 1,5 ml. La muestra se separa en tres fases después de la centrifugación.
    3. Añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico a la fase acuosa, agitar el tubo a mano de forma vigorosa e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 min.
    4. Centrifugar la mezcla a 12.000 x g durante 10 min a 4oC y retirar el sobrenadante.
    5. Lavar el pellet de ARN una vez con 1 ml de etanol al 75% por vórtice, seguido de centrifugación a 7.500 x g durante 5 min a 4 oC.
    6. Repita el paso 1.2.5.
    7. Seque al aire el pellet durante 5-10 minutos y vuelva a disolver el ARN en agua tratada con dietilopirato (DEPC) pipeteando hacia arriba y hacia abajo, seguido de medir la concentración total de ARN con un microespectrofotómetro (ver Tabla de Materiales).

2. Sintetizar ADN complementario (ADN)28

  1. Sintetizar la primera hebra de ADNc utilizando un kit (ver Tabla de Materiales). Configurar un sistema de reacción de 20 l, tal y como se muestra en la Tabla 1, e incubar el tubo de reacción en un instrumento de PCR durante 50 min a 42 oC, seguido de terminar la reacción a 85 oC durante 5 min. Almacene el producto de reacción a -20 oC para la amplificación futura de genes.
ReactivosVolumen
mezcla dNTP, 2,5 mM cada una4,0 l
Primer Mix2,0 l
Plantilla de ARN1.0 g
Zona de influencia de transcriptasa inversa, 5o4,0 l
Transcriptasa inversa, 200 U/L1.0 L
Libre de RNase H2Ohasta 20,0 l

Tabla 1: Invertir la transcripción del ARN total en ADNc

3. Construir plásmidos recombinantes29

  1. Imprima imprimaciones PCR de diseño.
    1. Diseñar las imprimaciones PCR utilizando un software (ver Tabla de Materiales)basado en las secuencias de genes enzimáticos clave obtenidos de la base de datos GenBank y sintetizar las imprimaciones por una empresa (ver Tabla de Materiales). En el extremo 5' de la imprimación, agregue un sitio de enzimas de restricción (por ejemplo, BamHI o EcoRI en este protocolo).
      NOTA: Las imprimaciones utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla2.
Secuencia, 5' a 3'Propósito
AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACTImprimación delantera para amplificación de PCR del gen Atf3h de Arabidopsis thaliana. Bam El sitio HI está en cursiva y se adjunta para clonar en pET32a(+).
AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGAImprimación inversa para amplificación pcR del gen Atf3h de A. thaliana. Eco El sitio de RI está en cursiva y se adjunta para clonar en pET32a(+).
AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCAImprimación delantera para amplificación de PCR del gen Atfls1 de A. thaliana. Bam El sitio HI está en cursiva y se adjunta para clonar en pET32a(+).
AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTATImprimación inversa para amplificación pcR del gen Atfls1 de A. thaliana. Eco El sitio de RI está en cursiva y se adjunta para clonar en pET32a(+).

Tabla 2: Imprimaciones de oligonucleótidos utilizadas en el estudio actual

  1. Clonar los genes en un vector de expresión procasinotica.
    1. Amplificar los genes de la primera hebra del ADNC sintetizado utilizando una polimerasa de ADN de alta fidelidad (ver Tabla de Materiales). Configurar un sistema de reacción de PCR de 100-L como se muestra en la Tabla 3 y ejecutar el siguiente ciclo de PCR: 94 oC durante 2 min para la desnaturalización inicial; a continuación, 35 ciclos de 94 oC para 30 s para la desnaturalización, 55 oC para 2 min para recocido, y 72 oC durante 1 min para la extensión; seguido de un alargamiento final a 72 oC durante 10 min. Enfriar la mezcla de reacción a 12 oC.
      NOTA: El tiempo de extensión es variable y determinado por la longitud del gen con polimerización de aproximadamente 1000 bases por minuto para la mayoría de las polimerasas de ADN.
    2. Visualizar los productos de PCR (más comúnmente 5 L) en un gel de agarosa del 1% y purificar el fragmento de ADN específico de los productos restantes utilizando un kit de limpieza de ADN (ver Tabla de Materiales).
    3. Digerir el fragmento de ADN purificado y el vector (por ejemplo, pET-32a(+)) con enzimas de restricción (por ejemplo, BamHI o EcoRI en este protocolo). Configurar un sistema de reacción de 50 l en un tubo de PCR de 0,2 ml, como se muestra en la Tabla 4 e incubar la mezcla a 37 oC durante 3 h. Separar el ADN digerido en un gel de agarosa del 1%.
    4. Recuperar la banda de ADN utilizando un kit de extracción de gel (ver Tabla de Materiales). Purificar aún más el ADN utilizando un kit de limpieza de ADN (ver Tabla de Materiales), seguido de la medición de la concentración de ADN con un microespectrofotómetro (ver Tabla de Materiales).
    5. Ligar el fragmento de gen en el ADN vectorial linealizado utilizando una ligasa de ADN T4 (ver Tabla de Materiales). Configure una reacción de ligadura en un tubo de 1,5 ml como se muestra en la Tabla 5 e incubar el tubo a temperatura ambiente durante 2 - 3 h.
      NOTA: La relación molar de una plaquita a un vector es variable y oscila entre 3:1 y 10:1.
    6. Añadir 2,5 ml de la mezcla de ligadura en 50 ml de células de Escherichia coli químicamente competentes (p. ej., TOP10 o DH5o), mezclar suavemente y mantener el tubo en hielo durante 30 minutos. Choque térmico de las células a 42 oC durante 90 s e inmediatamente coloque el tubo en hielo durante 2 minutos.
    7. Añadir 200 ml de medio líquido LB sin antibióticos en el tubo e incubar el tubo en una coctelera de 37 oC a 220 rpm durante 1 h. Esparcir 50 - 100 ml de las células en una placa LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar a 37 oC durante la noche.
ReactivosVolumen
Pfu Master Mix, 2o50,0 l
Primer delantero, 10 m4,0 l
Imprimación inversa, 10 m4,0 l
Cdna2,0 l
H2O40,0 l

Tabla 3: Configuración de un sistema de reacción PCR

ReactivosVolumen
Fragmento de ADN/Vector3.0 g
Bam Hola1.0 L
Eco Ri1.0 L
Búfer Cutsmart, 10o5.0 L
H2Ohasta 50,0 l

Tabla 4: Doble digestión de un fragmento/vector de ADN

ReactivosVolumen
insertarX L (0,09 pmol)
VectorY-L (0,03 pmol)
Zona de influencia de la ligadura, 10o1.0 L
T4 DNA Ligase, 400 U/L1.0 L
H2Ohasta 10,0 l

Tabla 5: Ligadura de un fragmento genético en un vector linealizado

  1. Pantalla de colonias positivas.
    1. Inocular una sola colonia desde la placa LB en 200 ml de medio líquido LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar a 37 oC, 250 rpm durante 2 - 3 h.
      NOTA: En general, escoja 4 - 8 colonias para la detección de colonias positivas.
    2. Configure una reacción pcR de la colonia de 10-L similar a la del paso 3.2.1.
      NOTA: Utilice 1 l de cultivo lb en lugar de 1 l de plantilla de ADNr.
    3. Visualice los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Inocular el cultivo restante con un resultado positivo en 3 ml de medio líquido LB que contiene 100 g/ml de ampicilina e incubar en una coctelera de 37 oC a 250 rpm durante 14 - 16 h.
    4. Aísle el ADN plásmido de cultivos recombinantes de E. coli utilizando un kit de minipreparación plásmido (ver Tabla de Materiales).
    5. Identifique los plásmidos recombinantes purificados mediante un análisis enzimático de doble restricción (por ejemplo, BamHI y EcoRI en este protocolo). Configurar un sistema de reacción de 10-L similar al del paso 3.2.3, seguido de la incubación a 37 oC durante 3 h. Visualizar la banda específica liberada del plásmido recombinante en un gel de agarosa del 1%.
  2. Verifique las secuencias de plásmidos recombinantes positivos.
    1. Envía los plásmidos a una compañía para la secuenciación. Analizar los resultados utilizando un software de análisis de secuencia de ADN (ver Tabla de Materiales)comparando la secuencia obtenida de la empresa de secuenciación con la secuencia de referencia obtenida de la base de datos GenBank.

4. Proteínas enzimáticas recombinantes express30

  1. Transforme el plásmido recombinante correcto en E. coli BL21(DE3) competente.
    1. Añadir 0,1 ml del plásmido a 10 ml de E. coli BL21(DE3) competente en un tubo de 1,5 ml sobre hielo y mantener el tubo en hielo durante 5 minutos.
    2. Choque por calor las células en un baño de agua de 42 oC durante 90 s y colóquelo en hielo de nuevo durante 2 minutos.
    3. Añadir 200 ml de medio líquido LB sin antibióticos e incubar en una coctelera de 37 oC a 220 rpm durante 5 min.
    4. Esparza 50 ml de transformación en una placa de agar LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar la placa durante la noche en una incubadora de 37oC.
  2. Inducir la expresión de genes.
    1. Inocular 3 - 5 colonias de la placa en un tubo que contenga 3 ml de medio líquido LB con 100 g/ml de ampicilina e incubar a 250 rpm en una coctelera de 37 oC durante la noche.
    2. Transfiera todo el cultivo nocturno a 300 ml de medio líquido LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar a 250 rpm en un agitador de 37 oC hasta que la densidad óptica del cultivo a 600 nm esté entre 0,4 y 0,6.
    3. Añadir isopropilo-D-tiogalactoside (IPTG) en el cultivo con una concentración final de 0,2 mM e inducir la expresión de los genes a 250 rpm, 20 - 22 oC durante 3 h.

5. Purificar las proteínas enzimáticas recombinantes31

  1. Cosechar las bacterias por centrifugación del cultivo a 4 oC, 12.000 x g durante 10 min.
  2. Resuspender el pellet en 15 ml de tampón de lisis bacteriana que contiene 0,1% De tritón X-100, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 150 mM NaCl, 0,5 mM de TDT, 0,1 mM de PMSF, 1 g/mL de aprotinaína, 1 g/ml de leupeptina y pepstatina de 1 g/ml en Tris-Cl de 50 mM (pH 8,0).
  3. Sonicar la suspensión bacteriana para liberar las proteínas enzimáticas recombinantes, seguida de centrifugación a 13.000 x g, 4 oC durante 10 min.
  4. Cosecha y alícuota el sobrenadante en tubos de 1,5 ml a 1 ml/tubo y guárdalos a -70oC para su uso futuro.
  5. Aplicar 500 l de resina de purificación de su etiqueta (ver Tabla de Materiales)a una columna de afinidad vacía reutilizable. Lave la resina con 5 volúmenes de agua desionizada para desechar el etanol en la solución en stock. Equilibre la resina con 10 volúmenes de lecho del tampón de unión que comprende Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), imidazol (10 mM) y NaCl (0,5 M).
  6. Aplicar 4 ml del sobrenadante del paso 5.4 a una suspensión de la resina anterior y bloquear dos extremos de la columna con tapónes.
  7. Incubar la mezcla a 4oC sobre un rotador a baja velocidad durante 2 h.
  8. Lave la resina ligada a proteínas de fusión con 15 volúmenes de lecho del tampón de unión a 4 oC a un caudal de 1 ml/min antes de la elución.
  9. Añadir 500 ml de tampón de elución (que contiene 20 mM Tris-Cl (pH 7.9), 500 mM de imidazol, 0,5 M de NaCl) a la columna e incubar la suspensión a 4 oC en un rotador a baja velocidad durante 10 minutos.
  10. Repita el paso 5.5 cuatro veces más.
  11. Lave la resina secuencialmente con 10 volúmenes de cama de agua desionizada y 3 volúmenes de lecho de 20% de etanol. Remoje la resina en un 20% de etanol. Bloquear la columna con tapónes y almacenarla a 4 oC.
  12. Mida la concentración de las proteínas purificadas por el ensayo de proteínas Bradford. Determinar la pureza de las proteínas en un gel 10% SDS-PAGE y visualizar las bandas por el ensayo de tinción azul Coomassie.
  13. Añadir glicerol a la solución proteica purificada a una concentración final del 10% para estabilizar la actividad enzimática. Aliquot y guárdalo a -80oC.

6. Producir un flavonol a partir de una flavanona en un sistema sintético de bienzimain vitro16

  1. Prepare los buffers.
    1. Hacer 2tampón sintético sin sulfato ferroso compuesto por 200 mM Tris-HCl (pH 7.2), 16,4 mM de ácido cetoglutárico, 0,8% de ascorbato sódico y 20% de glicerol. Disolver 1,938 g de base Tris, 0,640 g de ascorbato sódico, 0,250 g de ácido cetoglutárico y 16 ml de glicerol a 64 ml de agua desionizada. Ajuste el pH a 7,2 por ácido clorhídrico (HCl) y añada agua desionizada hasta 80 ml. Almacene el tampón a 4 oC para su uso futuro.
    2. Haga una solución de stock 100x de sulfato ferroso de 2 mM. Disolver 55,6 mg de sulfato ferroso heptahidrato en 50 ml de agua desionizada, remover y añadir agua hasta 100 ml.
    3. Haga una solución de stock de flavonoide de 25 mM. Disolver un flavonoide en metanol a fondo y almacenarlo a -20oC.
  2. Configure un sistema sintético para producir un flavonol a partir de una flavanona.
    1. Prepare el sistema sintético como se muestra en la Tabla6.
    2. Incubar la reacción a 40 oC en un tubo abierto de 2,0 ml a 600 rpm (en un bloque de calor de agitación) durante 40 min.
    3. Terminar la reacción añadiendo 10 s de ácido acético y 100 l de acetato de etilo.
    4. Dos horas más tarde, transfiera las fases orgánicas a tubos de 1,5 ml para el secado al aire en una campana a temperatura ambiente.
ReactivosVolumen
2o Tampón sintético sin sulfato ferroso50,0 l
25 mM flavonol2,0 l
Sulfato ferroso de 2 mM0,5 l
1 mg/ml AtF3H2,5 l
1 mg/ml AtFLS12,5 l
Flavanona de 25 mM2,0 l
H2Ohasta 100,0 l

Tabla 6: El sistema sintético utilizado en este protocolo.

7. Analizar los productos de reacción

  1. Análisis de cromatografía de capa fina (TLC).
    1. Piscina 5 tubos de las muestras de flavonoides del paso 6.2.4 y sacar 300 s para el secado al aire. Vuelva a disolver el polvo de flavonoide en 160 ml de metanol. Preparar muestras auténticas de flavonoide con concentraciones en serie de 12,5, 25, 50, 100 y 200 ng/L en metanol. Cargar 1 l de las muestras de reacción y las muestras de flavonoides auténticos en placas de poliamida 6.
    2. Ejecute las placas cargadas de muestras en un sistema de disolvente que comprenda cloroformo/metanol/acetato de etilo/ácido fórmico a una proporción de 5.0:1.5:1.0:0.5.
    3. Seque al aire las placas a temperatura ambiente. Rocíe las placas con una soluciónetanólica al 1% de cloruro de aluminio (AlCl 3), seguida de un secado al aire de nuevo a temperatura ambiente.
    4. Treinta minutos más tarde, visualice las manchas en las placas bajo una luz UV a 254 nm y tome imágenes.
    5. Analice el valor gris de cada punto de las imágenes utilizando un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ v1.51j8 en este protocolo).
      1. Abra el software ImageJ. Haga clic en Archivo > Abrir para abrir la imagen que se va a analizar.
      2. Haga clic en la herramientade selección de Rectangular más a la izquierda en la interfaz de usuario de ImageJ. Delinee la región de interés (ROI) figure-protocol-1 en la imagen con el ratón y pulse para etiquetar el primer ROI.
      3. Mueva la selección rectangular con el ratón figure-protocol-2 a la derecha al siguiente ROI y pulse para etiquetar el segundo ROI.
      4. Repita el paso anterior para etiquetar todos los demás ROI.
      5. Pulse figure-protocol-3 para generar trazados de perfil para todos los ROI en una ventana emergente.
        NOTA: En este momento, la herramienta selección de línea recta en la interfaz de usuario de ImageJ se activará automáticamente.
      6. Usa la Herramienta Selección de Línea Recta para dibujar líneas base con el fin de definir un área cerrada para cada pico de interés.
      7. Active la herramienta Wand haciendo clic en el icono correspondiente en la interfaz de usuario de ImageJ. Haga clic dentro del pico para mostrar los resultados de todos los picos en una ventana emergente.
    6. Haga una curva estándar basada en TLC del flavonoide auténtico trazando los valores grises del paso 7.1.5.7 contra las concentraciones de flavonoides correspondientes del paso 7.1.1. A continuación, calcule el rendimiento del flavonoide de interés producido en este protocolo de acuerdo con la fórmula resultante.
  2. Análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS)
    1. Procesar las muestras desde el paso 7.1.1 secuencialmente a través de filtros de 0,45 y 0,22 m.
    2. Cargue las muestras en un sistema HPLC/LC/MS (ver Tabla de materiales)y separe las muestras a 30 oC utilizando una columna C18 (4,6 x 150 mm; i.d., 5 m). Eluir la columna a 1,0 ml/min por un gradiente de 10 - 85% (v/v) acetonitrilo (ACN) en agua (0 - 10 min, 10 - 25% ACN; 10 - 35 min, 25 - 50% ACN; 35 - 45 min, 50 - 85% ACN; 45 - 50 min, 85 - 10% ACN; 50 - 60 min , 10% ACN) y monitorizar la absorción del eluido de 200 a 800 nm. Realizar el análisis DE LC/MS en un modo iónico negativo con un flujo de nitrógeno de secado de 10 L/min a 300 oC y un flujo de gas de vaina de 7 L/min a 250 oC y recopilar datos utilizando un software incorporado (ver Tabla de materiales).
    3. Extraiga cromatógrafos de longitud de onda única para calcular las áreas pico de muestras de reacción y compuestos flavonoides auténticos utilizando un software (ver Tabla de Materiales).
      1. Abra el programa Análisis cualitativo y haga clic en Archivo > Abrir archivo de datos. Seleccione los archivos que desea analizar en la ventana Abrir archivo de datos y haga clic en Abrir para abrir los archivos.
      2. Haga clic con el botón derecho del ratón en la ventana Chromatogram Results y, a continuación, en loshromatogramas Extract Cen un menú emergente.
      3. Abra el cuadro de diálogo Extract Chromatogramas. En la lista Tipo, haga clic en Otros cromatogramas. En el cuadro combinado Detector, seleccione DAD1. A continuación, haga clic en Aceptar para mostrar los resultados de HPLC en la ventana Resultados delhromatograma C.
      4. Haga clic en el icono Manual Integration acoplado en la parte superior de la ventana Resultados delhromatograma C. Dibuje una línea base para el pico necesario para el análisis de integración manual con el ratón.
      5. Haga clic en Ver > Lista de picos de integración para mostrar los resultados.
    4. Haga una curva estándar basada en HPLC del flavonoide auténtico trazando las áreas pico del paso 7.2.3.5 contra las concentraciones de flavonoides correspondientes del paso 7.2.1. A continuación, calcule el rendimiento del flavonoide de interés producido en este protocolo de acuerdo con la fórmula resultante.
    5. Analice los datos de EM para la masa exacta de compuestos flavonoides utilizando un software (ver Tabla de Materiales).
      1. Repita los pasos 7.2.3.1 - 7.2.3.3.
      2. Haga clic en el icono Selección de rango de la barra de herramientas Resultados del hromatograma C.
      3. Seleccione el pico de interés. Haga clic con el botón derecho del ratón en el rango seleccionado y haga clic en Extraer MS Spectrum en el menú emergente para mostrar los resultados en la ventana Resultados de MS Spectrum.

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Resultados

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F3H y FLS1 son dos enzimas clave importantes en la conversión de una flavanona en un flavonol en plantas como se muestra en la Figura1. Para desarrollar un sistema biosintético in vitro para producir un flavonol a partir de una flavanona, Atf3h (No de adhesión a GenBank. NM_114983.3) y Atfls1 (no de adhesión de GenBank. NM_120951.3) los genes fueron clonados de las plántulas de A. thaliana de 4 semanas de edad en una expresión proca...

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Discusión

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Un buen número de estudios se centran en la derivación de flavonols debido a su posible aplicación en la atención de la salud y la industria alimentaria. Sin embargo, la extracción tradicional de plantas utilizando disolventes orgánicos y síntesis química poseen desventajas intrínsecas, que restringen su uso en la producción de flavonols. Aquí, informamos de un método detallado para producir un flavonol a partir de una flavanona en una olla estableciendo una cascada bienimática in vitro. Los pasos críticos de este protoc...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por los Fondos de Start-up de Profesores Especialmente Nombrados de la Universidad de Yangzhou, los Fondos de Start-up del Profesor Especialmente Nombrado de Jiangsu, el Proyecto Six Talent Peaks en la Provincia de Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016) y un Proyecto financiado por el Programa Académico Prioritario Desarrollo de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (Medicina Veterinaria). Agradecemos al Centro de Pruebas de la Universidad de Yangzhou para los análisis HPLC y MS de flavonoides.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2&veces; Pfu MasterMixBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0717Aamplificación de genes por PCR con alta fidelidad
Agilent 1200 Series RRLC system con un sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MSAgilent Technologies, IncN/Aun equipo para el análisis de flavonoides por HPLC/MS
Agilent MassHunter Workstation (versión B.03.01)Agilent Technologies, IncN/Aun software para la recopilación de datos del sistema RRLC de la serie Agilent 1200 con un sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS
dihidrokaempferolSigma-Aldrich Co. LLC91216producto intermedio para producir kaempferol a partir de naringenina
dihidroquercetinaSichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal MedicinePCS0371producto intermedio para producir quercetina a partir de eriodictyol
Kit de limpieza de ADNBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2301purificación de ADN eriodictyol amplificado por PCR o purificado en gel
Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.B21160sustrato para la producción de quercetina
Escherichia coli BL21(DE3)Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0809cepa de bacterias para expresar genes diana
Escherichia coli DH5αBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0808cepa de bacterias para la proliferación de plásmidos
FreeZone 1 Liter Benchtop Sheetze-dryLabconco Corporation 7740020un equipo para la liofilización de flavonoides disueltos en solvente orgánico
Kit de extracción de gelBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW2302purificación de una banda de ADN de un sistema
de imágenes en gel de agarosaShanghái Tanon Ciencia & Tecnología Co. Ltd.Tanon-
2500		un equipo para la visualización de la banda de ADN en un gel de agarosa o una mancha de flavonoide en una placa TLC de poliamida
GenElute Plasmid Miniprep KitSigma-Aldrich Co. LLCPLN350-1KTminipreparación de plásmidos
kaempferolSigma-Aldrich Co. LLC60010producto de reacción final y sustancia estándar
Análisis cuantitativo, MassHunter (versión B.01.04)Agilent Technologies, IncN/Aun software para el análisis de datos de HPLC/LC/MS
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-8000-GLun equipo para la determinación de la concentración de ADN/
ARN naringeninaSigma-Aldrich Co. LLCN5893sustrato para la producción de kaempferol
Ni-IDA Agarose ResinBeijing CoWin Biotech Co., LtdCW0010purificación de proteínas de fusión marcadas con His
pET-32a(+)Novagen69015-3plásmido para clonación y expresión de genes diana
secuenciación de plásmidosGENEWIZ SuzhouN/Asecuenciación de plásmidos recombinantes
síntesis de cebadoresGENEWIZ SuzhouN/Asíntesis de cebadores de PCR
quercetinaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.Q111273producto final de la reacción y sustancia estándar
Kit de síntesis de ADNcSuperRT Beijing CoWin Biotech Co., LtdCW0741síntesis de la primera hebra de ADNc a partir de ARN
total ADN T4 LigasaThermo Fisher ScientificEL0016ligadura de un inserto en un vector linealizado ADN
TrizolThermo Fisher Scientific15596018aislamiento de ARN total
Vector NTI AdvanceThermo Fisher Scientific12605099un software para el diseño de cebadores de PCR y el análisis de secuencias de ADN
Xcalibur v2.0.7Thermo Fisher ScientificN/Aun software para el análisis de datos de HPLC

Referencias

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