La derivación de un flavonol es crucial para su aplicación en la salud y la industria alimentaria. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la biosíntesis de un flavonol de una flavanona y discutimos los pasos cruciales y sus ventajas sobre otros enfoques.
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Artículo de método
Biosíntesis de un Flavonol de un Flavanone estableciendo una cascada bienimática de un solo pozo
En este artículo
Resumen
Resumen
Los flavonols son una subclase importante de flavonoides con una variedad de actividades biológicas y farmacológicas. Aquí, proporcionamos un método para la síntesis enzimática in vitro de un flavonol. En este método, Atf3h y Atfls1, dos genes clave en la vía biosintética de los flavonols, se clonan y se sobreexpresan en Escherichiacoli. Las enzimas recombinantes se purifican a través de una columna de afinidad y luego se establece una cascada bienimática en un tampón sintético específico. Dos flavonols se sintetizan en este sistema como ejemplos y se determinan mediante análisis TLC y HPLC/LC/MS. El método muestra ventajas obvias en la derivación de flavonols sobre otros enfoques. Es ahorro de tiempo y mano de obra y altamente rentable. La reacción es fácil de controlar con precisión y, por lo tanto, se amplía para la producción en masa. El producto objetivo se puede purificar fácilmente debido a los componentes simples en el sistema. Sin embargo, este sistema se limita generalmente a la producción de un flavonol a partir de una flavanona.
Introducción
Los flavonols son una subclase importante de flavonoides vegetales y participan en el desarrollo de plantas y pigmentación1,2,3. Más importante aún, estos compuestos poseen una amplia gama de actividades beneficiosas para la salud, tales como contraelcancero4,5, antioxidante6, antiinflamatorio7, antiobesidad8, antihipertensivo9 , y las propiedades de memoria10,lo que conduce a un gran número de estud....
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Protocolo
1. Aislar el ARN total de los tejidos vegetales26,27
- Homogeneizar los tejidos vegetales.
- Recoger 100 mg de un tejido vegetal fresco (por ejemplo, plántulas de 4 semanas de Arabidopsis thaliana). Congele el tejido y un mortero con nitrógeno líquido, seguido de moler el tejido en polvo.
- Añadir 1 ml de reactivo de aislamiento de ARN (ver Tabla de Materiales)en el mortero. El reactivo se congelará inmediatamente. Homogeneizar la muestra de tejido con el pestillo cuando el reactivo congelado se derrite.
- Transfiera el homogeneizado a un tubo de 1,5 ml....
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Resultados
F3H y FLS1 son dos enzimas clave importantes en la conversión de una flavanona en un flavonol en plantas como se muestra en la Figura1. Para desarrollar un sistema biosintético in vitro para producir un flavonol a partir de una flavanona, Atf3h (No de adhesión a GenBank. NM_114983.3) y Atfls1 (no de adhesión de GenBank. NM_120951.3) los genes fueron clonados de las plántulas de A. thaliana de 4 semanas de edad en una expresión proca.......
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Discusión
Un buen número de estudios se centran en la derivación de flavonols debido a su posible aplicación en la atención de la salud y la industria alimentaria. Sin embargo, la extracción tradicional de plantas utilizando disolventes orgánicos y síntesis química poseen desventajas intrínsecas, que restringen su uso en la producción de flavonols. Aquí, informamos de un método detallado para producir un flavonol a partir de una flavanona en una olla estableciendo una cascada bienimática in vitro. Los pasos críticos de este protoc.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Fondos de Start-up de Profesores Especialmente Nombrados de la Universidad de Yangzhou, los Fondos de Start-up del Profesor Especialmente Nombrado de Jiangsu, el Proyecto Six Talent Peaks en la Provincia de Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016) y un Proyecto financiado por el Programa Académico Prioritario Desarrollo de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (Medicina Veterinaria). Agradecemos al Centro de Pruebas de la Universidad de Yangzhou para los análisis HPLC y MS de flavonoides.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2&veces; Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | amplificación de genes por PCR con alta fidelidad |
| Agilent 1200 Series RRLC system con un sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS | Agilent Technologies, Inc | N/A | un equipo para el análisis de flavonoides por HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (versión B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | un software para la recopilación de datos del sistema RRLC de la serie Agilent 1200 con un sistema Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS |
| dihidrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | producto intermedio para producir kaempferol a partir de naringenina |
| dihidroquercetina | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | producto intermedio para producir quercetina a partir de eriodictyol |
| Kit de limpieza de ADN | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purificación de ADN eriodictyol amplificado por PCR o purificado en gel |
| Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | sustrato para la producción de quercetina | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | cepa de bacterias para expresar genes diana |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | cepa de bacterias para la proliferación de plásmidos |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Sheetze-dry | Labconco Corporation 7740020 | un equipo para la liofilización de flavonoides disueltos en solvente orgánico | |
| Kit de extracción de gel | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purificación de una banda de ADN de un sistema |
| de imágenes en gel de agarosaShanghái Tanon Ciencia & Tecnología Co. Ltd. | Tanon- 2500 | un equipo para la visualización de la banda de ADN en un gel de agarosa o una mancha de flavonoide en una placa TLC de poliamida | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparación de plásmidos |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | producto de reacción final y sustancia estándar |
| Análisis cuantitativo, MassHunter (versión B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | un software para el análisis de datos de HPLC/LC/MS |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | un equipo para la determinación de la concentración de ADN/ |
| ARN naringenina | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | sustrato para la producción de kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purificación de proteínas de fusión marcadas con His |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plásmido para clonación y expresión de genes diana |
| secuenciación de plásmidos | GENEWIZ Suzhou | N/A | secuenciación de plásmidos recombinantes |
| síntesis de cebadores | GENEWIZ Suzhou | N/A | síntesis de cebadores de PCR |
| quercetina | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | Q111273 | producto final de la reacción y sustancia estándar |
| Kit de síntesis de ADNc | SuperRT Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | síntesis de la primera hebra de ADNc a partir de ARN |
| total ADN T4 Ligasa | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligadura de un inserto en un vector linealizado ADN |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | aislamiento de ARN total |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | un software para el diseño de cebadores de PCR y el análisis de secuencias de ADN |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | un software para el análisis de datos de HPLC |
Referencias
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Cha....
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Reimpresiones y permisos
