Evaluación de la proliferación del Keratinocyte en dos y tres dimensiones substratos de colágeno de tipo I

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación de dos formas diferentes de sustratos de cultivo utilizando colágeno de tipo I. Dependiendo de cómo se maneja el colágeno, moléculas de colágeno mantienen forma bidimensional, no fibrosos o volver a montar en forma fibrilar tridimensional. Proliferación de células de tipo I colágeno es afectado drásticamente por la formación de fibrilas.

Resumen

Tipo I colágeno, útil como un sustrato para el cultivo celular, existe en dos formas: la forma bidimensional, no fibrosos y tridimensional, forma de fibrilla. Ambas formas se pueden preparar con el mismo colágeno tipo I. En general, la forma no fibrosos promueve la proliferación y adhesión celular. La forma de fibrilla (geles) ofrece más condiciones fisiológicas en muchos tipos de células; por lo tanto, cultura de gel es útil para examinar los comportamientos fisiológicos de células, como la eficacia de la droga.

Los investigadores pueden seleccionar la forma apropiada según el propósito de su uso. Por ejemplo, en el caso de los queratinocitos, cultura en gel se ha utilizado como un modelo de cicatrización. FEPE1L-8, una línea de celular de queratinocitos cultivados en el formulario no fibrosas de tipo I colágeno, promueve la adhesión celular. En particular, la proliferación del keratinocyte es más lenta en la forma de fibrilla que la forma no fibrosos. Protocolos para la elaboración de colágeno tipo I para cultivo celular son simples y tienen amplias aplicaciones dependiendo de las necesidades experimentales.

Introducción

Intersticial de los tejidos conectivos forman un tridimensional red de proteínas de composición heterogénea, principalmente compuestas de tipo I colágeno fibrillas¹. Las fibrillas del colágeno juegan un papel clave como un andamiaje para las células^1,2,3 e interactúan con otras proteínas de matriz extracelular (ECM)³. In vitro, diferentes formas de tipo I colágeno puede utilizarse como sustratos para el cultivo celular dependiendo el manejo método^1,2,3,4. Bajo condiciones ácidas, tipo I colágeno mantiene la forma no fibrosos⁵. Capa de la superficie de los platos de la cultura con la forma no fibrosos promueve célula adherencia y proliferación^6,7. En temperatura y pH fisiológico, las moléculas de colágeno de tipo I volver a montar en las fibrillas que forman geles que poseen una estructura tridimensional^{1,2,3,4, 5,6,7,8}. Hay varias importantes diferencias entre la fibrilla y formas no fibrosas de tipo I colágeno, incluyendo matriz rigidez y eficiencia de la reconstrucción de los componentes de la ECM por las células durante la cultura¹. Matriz de rigidez es uno de los factores reguladores más estudiados de la célula cultura^{1, 9}. Sin embargo, las complejas interacciones entre células y sustratos quedan por aclararse. Para examinar las interacciones complejas entre las células y factores ambientales, un sistema simple es útil. Comparación del comportamiento celular en los dos tipos diferentes de colágeno puede ayudar a simplificar el efecto de factores ambientales. Dependiendo de la finalidad de su utilización, formas diferentes de tipo I colágeno puede ser selectivamente utilizado. Normalmente, queratinocitos están en contacto con la membrana basal pero no con colágeno de tipo I. Sin embargo, durante la cicatrización de heridas, queratinocitos hacia el tejido conectivo dérmico, proliferan y sanan la herida¹⁰.

Recientemente, hemos demostrado que la concentración de calcio extracelular es importante para la proliferación del keratinocyte células de la línea utilizando el sistema de cultivo en la forma de fibrilla de colágeno imitando el tejido conectivo dérmico¹¹del tipo I. Cuando la línea de celular de queratinocitos FEPE1L-8 fue cultivado en la forma de fibrilla de colágeno tipo I, la forma de las células era redonda y sus proliferaciones fueron detenidas en una concentración de calcio extracelular de 30 μM¹¹. Cuando la concentración de calcio aumentó a 1,8 mM, crecimiento de la célula fue recuperado¹¹. Las células crecieron en ambas concentraciones de calcio (30 μM y 1,8 mM) cuando se cultiva la forma no fibrosos¹¹, mientras que los eran más sensibles a la concentración de calcio exógeno cuando cultiva la forma de fibrilla. FEPE1L-8 fue generada a través de la transfección con el virus del papiloma tipo 16 transformación de genes E6 y E7 de carcinoma cervical humano, no tumorigenic, inhiben la proliferación ilimitada con la diferenciación limitada potencial como keratinocytes normales ^12,13. FEPE1L-8 células se pueden mantener mediante el uso de algún tipo de medio específico del keratinocyte, incluyendo K110 tipo II con suplemento aditivo K-1 (K110)⁶. Aquí, describimos el protocolo de la cultura de la línea celular de queratinocitos humanos sobre la no-fibrosos y formas de la fibrilla de colágeno de tipo I.

Protocolo

1. preparación de medio de cultivo de queratinocitos

Nota: Realice todos los procedimientos en condiciones de asepsia.

1. Añadir 5 mL de penicilina-estreptomicina y 10 mL de aditivo suplemento K-1 a 500 mL de medio de K110 tipo II (K110) utilizando una pipeta.

2. preparación de la forma de fibrilla de colágeno tipo

Nota: Realice los procedimientos hasta el paso 2.6 bajo condiciones asépticas.

1. Mantener 10 x tampón fosfato salino (PBS (-)), agua desionizada, colágeno, una placa de cultivo de 96 pocillos y un tubo vacío de 2 mL en hielo.
   Nota: No utilice el mismo plato para preparar la fibrilla y formas no fibrosos.
2. Añadir 1,12 mL de agua desionizada a un tubo de vacío de 2 mL con una pipeta. Añadir 200 μL de PBS x 10 (-) en el tubo de 2 mL con una pipeta agua desionizada. Agitar suavemente el tubo varias veces.
3. Añadir 0,66 mL de colágeno en el tubo de 2 mL con una pipeta. Rápida y suavemente agite el tubo varias veces.
   Nota: Evite la formación de burbujas en la solución tanto como sea posible. Preparar la solución de colágeno inmediatamente antes del uso.
4. Vierta 100 μl de la solución de colágeno en el paso 2.3 en cada pocillo de la placa de cultivo de 96 pozos. Agitar suavemente la placa de cultivo en una izquierda a la derecha movimiento.
   Nota: Cubre toda la superficie de los pozos con la solución de colágeno. Si la solución no cubre toda la superficie, distribuir la solución utilizando una pipeta. Evitar formación de burbujas en la solución tanto como sea posible.
5. Coloque la placa de cultivo en un incubador de CO₂ e incubar a 37 ° C por 1 h. comprobar la gelificación del colágeno y mover la placa de cultivo a una mesa de trabajo limpia.
   Nota: Confirmar gelificación inclinando la placa de cultivo.
6. Suavemente vierta 150 μL de K110 en los geles con una pipeta a lo largo de la pared del pozo, lugar de la cultura de la placa en un incubador de CO₂ y de incubar a 37 ° C por 1 h. Mueva la placa de cultivo a una mesa de trabajo limpia. Antes de la cultura de célula, suavemente tire el K110 con una pipeta.
   Nota: Para proteger a los geles, la punta de la pipeta debe tocar la pared del pozo.

3. preparación de la forma no-fibroso de colágeno tipo

Nota: Realice todos los procedimientos en condiciones de asepsia.

1. Añadir 4 μL del colágeno a 1,2 mL de 1 mM el ácido clorhídrico (HCl) en un tubo de 1,5 mL y mezclar suavemente con una pipeta.
   Nota: Preparar inmediatamente antes del uso del colágeno. Mantener el colágeno y el ácido clorhídrico frío hasta el momento de uso.
2. Vierta 100 μl de colágeno en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pozos utilizando una pipeta. Agitar suavemente la placa de cultivo en una izquierda a derecha movimiento e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
   Nota: Asegúrese de que toda la superficie de los pozos está cubierta con la solución.
3. Después de la incubación, deseche la solución de colágeno y lavar los pocillos con PBS (-) dos veces con una pipeta.
4. Verter 150 μL de 1% bovinos albúmina sérica/PBS (-) (1% de BSA) a un pozo de la placa de cultivo de 96 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. antes de la cultura de célula, deseche el 1% de BSA.
   Nota: Asegúrese de que toda la superficie de los pozos está cubierta con la solución.

4. cultivo de células FEPE1L-8

Nota: Realice todos los procedimientos en condiciones de asepsia.

1. Mantener las células FEPE1L-8 K110 en 100 mm plato en un incubador de CO₂ de la cultura y se incubaron a 37 ° C y 5% CO₂, semi-confluency.
2. Preparar K110, tripsina y el inhibidor de tripsina en un baño de agua a 37 ° C.
3. Con cuidado retire el medio de la placa de cultivo, añadir 3 mL de tripsina 0,05% con una pipeta, coloque el plato en un incubador de CO₂ e incubar a 37 ° C durante 5 minutos. Después de la incubación, comprobar el desprendimiento de células de la superficie de la placa de cultivo con microscopía de contraste de fase con aumentos de 10.
   Nota: La morfología de las células separadas se convierte en redonda. Si la extensión de las células, se incuban por un período adicional de 5 minutos.
4. Añadir 3 mL de inhibidor de tripsina y recoger las células separadas en un tubo de centrífuga de 15 mL con una pipeta. Centrifugar las células en un tubo de centrífuga de 15 mL a 200 x g durante 5 minutos.
5. Deseche el sobrenadante y Resuspenda el sedimento en 10 mL de K110 con una pipeta. Contar las células mediante microscopía de contraste de fase con 10 aumentos y preparar la concentración de células en 5.0 x 10⁴ células/mL por dilución con K110.
6. Suavemente la semilla 0,1 mL de K110 con células en cada pocillo de la placa de cultivo con una pipeta a lo largo de la pared del pozo. Coloque la placa de cultivo en un incubador de CO₂ e incubar a 37 ° C durante el tiempo indicado (2 h, 1 día, 3 días).
   Nota: Para proteger a los geles, la punta de la pipeta debe tocar la pared del pozo.

5. estimación del número de células viables

1. K110 de incubar en un baño de agua a 37 ° C. Mezcla 130 μl de sal de tetrazolio, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolio, sal monosódica (WST-8) y 1,3 mL de K110 en un tubo de 2 mL con una pipeta.
2. Mover la placa de cultivo a un banco limpio y tire suavemente la K110 con una pipeta. Lavar suavemente las células no adherentes con K110 usando una pipeta
3. Agregar 110 μl de K110 mezclado con WST-8 en cada pocillo con una pipeta, coloque la placa de cultivo en un incubador de CO₂ e incubar a 37 ° C durante 2 h.
4. Mover la placa de cultivo a una mesa de trabajo limpia, recoger 100 μl de medio condicionado de cada pozo y moverlo a un pozo de otra placa de cultivo de 96 pozos. Medir la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm (OD₄₅₀) utilizando un lector de microplacas y estimación del número de células viables.

Resultados

Una representación esquemática del tratamiento de las superficies de los platos de la cultura con el tipo I colágeno es representado en la figura 1. Morfología celular observada en las formas no-fibrosos y fibrilla se presenta en los paneles izquierdo y derecho de la figura 2, respectivamente. FEPE1L-8 las células fueron cultivadas durante 2 h (paneles superiores) y 3 días (paneles inferiores). En el inicial 2 h de cultivo, las células se adhirieron y difunda en ambas formas de colágeno (figura 2, paneles superiores). Tres días después de la siembra, las células en el formulario no fibrosos continuaron y números aumentados (figura 2, panel inferior izquierdo) de la célula. En contraste, las células en la forma de fibrilla demostraron limitada difusión (figura 2, panel inferior derecho). FEPE1L-8 células continuaron proliferando en el formulario no fibrosas de tipo I colágeno (figura 3, línea negra sólida, cerrado círculos negros) y en el plato sin tratar superficies (figura 3, línea gris, círculos gris cerrados de puntos). En cambio, células no proliferan en forma fibrilar (figura 3, línea de puntos, círculos abiertos). Figura 2 y figura 3 se han modificado de Fujisaki et al¹¹.

Figura 1 : Representaciones esquemáticas de las superficies del plato de cultivo tratados con tipo colágeno. Bajo condiciones ácidas, colágeno tipo I las moléculas se adsorben en la superficie de un plato en forma no-fibrosos (panel izquierdo). Bajo condiciones neutras a 37 ° C, colágeno tipo I moléculas son reensambladas en fibrillas y adsorbidas en la superficie de los platos en forma de gel (panel derecho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Morfología de las células FEPE1L-8. FEPE1L-8 células en K110 fueron cultivadas utilizando el formulario no fibrosos (10 μg/mL; paneles izquierdos) o forma de fibrilla (1 mg/mL; paneles derecho) de tipo I colágeno durante 2 h (paneles superiores) o 3 días (paneles inferiores). Las barras blancas indican 100 μm. figura 2 ha sido modificado de Fujisaki et al. en la figura 1E – H¹¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Proliferación de células FEPE1L-8. El número de células viables se estimaron en la forma no-fibrosos (línea sólida negra, negro círculos rellenos) o en la fibrilla forma (línea punteada, círculo abierto) de tipo I colágeno o las superficies del plato sin tratar (línea de puntos gris, gris círculos rellenos) de 2 h, 1 día y 3 días. Experimentos se realizaron en triplicado y los valores se muestran como medios + SD Esta cifra ha sido modificada de Fujisaki et al. en la figura 1J¹¹. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Algunos componentes de la ECM, incluyendo colágeno tipo I, forma tridimensional estructuras en vivo¹. Cultivo en un tridimensional, sustrato de gel proporciona condiciones más fisiológicas en vitro que sobre una superficie bidimensional, plástica^1,2,3,4. Se han reportado numerosos protocolos sobre el método de cultivo de gel, como el uso de tipo I colágeno^{1,2,3,4,6,7, 11}, tipo IV colágeno^14,15y¹⁶de Matrigel. Tipo I colágeno es un material bien definido y ampliamente utilizado debido a su abundancia y facilidad de manejo. Las características del purificada tipo I colágeno depende del animal especie, la edad y la purificación los métodos^5,17. Tipo I colágeno puede ser purificado con ácido acético o proteasas como la pepsina, papaína y proctase^5,17. Colágeno soluble en ácido mantiene telopéptido amino y colágeno soluble en proteasa son exfoliados de telopéptido amino^5,17. La longitud reservada del telopéptido amino depende del tipo de las proteasas, y la presencia de telopéptido afecta la morfología fibrilar y gel de fuerza^5,17. La viscosidad de las fibrillas de colágeno soluble en ácido es mayor que la de colágenos tratados con proteasa¹⁷. En este estudio, se utilizó ácido soluble bovino tipo I colágeno. Colágeno solubilizado pepsina puede utilizarse también en el presente Protocolo de cultura gel; sin embargo, la fuerza de gel es más débil¹⁷. Estas diferencias en los materiales pueden causar diferencias de comportamiento de la célula, pero actualmente no son bien entendidos.

El protocolo de cultura gel descrito en este estudio es muy sencillo. Se han reportado muchas modificaciones de este método. Una posible modificación de la cultura de los queratinocitos es imitar la membrana del sótano. Geles de colágeno de tipo IV pueden ser mejores mantener una estructura de membrana del sótano-como sustrato en vitro^15,18. Sin embargo, un período de incubación es necesario para la preparación de tipo IV colágeno geles^14,15,18. En cambio, mezcla de colágeno de tipo IV con tipo I geles de colágeno puede producir sustratos de cultura novela (tipo I / tipo IV colágeno híbrido geles)¹⁹. Estos geles de híbrido son fáciles de manejar, requieren poco tiempo de gelificación y rendimiento más condiciones similares a la membrana basal de queratinocitos. En tipo I y tipo IV colágeno híbrido geles, queratinocitos sobrevivirán, forman colonias, inducen diferenciación terminal¹⁹. Este método híbrido tiene usos versátiles.

Cultura en gel utilizando tipo I colágeno afecta a las células cancerosas. La forma de fibrilla de colágeno tipo I, activación de Akt y el crecimiento de las células Caco-2 (una línea de células de cáncer de colon) son suprimidos⁷. Además, el crecimiento de células de melanoma humano (M24met) en el formulario de la fibrilla es arrestado en el punto de control G1/S del²⁰. Por otra parte, marcado aumento de los niveles de especies reactivas de oxígeno se observa en preadipocytes 3T3-L1 de ratón cultivadas en la forma de fibrilla. Además, migración y proliferación de células son estimuladas en direcciones opuestas por la no-fibrosos y formas de la fibrilla de colágeno²¹de tipo I.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina, de suero bovino (BSA)	Merck KGaA	A4503
1 % BSA	Merck KGaA	A4503	Disolver 1 g de polvo de BSA en 100 mL de PBS (-) y filtrar
Kit de recuento de células-8	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	347-07621	sal de tetrazolio, 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H  tetrazolio, sal monosódica (WST-8)
Colágeno tipo I (colágeno soluble en ácido)	Nippi Inc.	ASC-1-100-20	de bovino (cualquier otra especie disponible, la concentración es de 3.0 mg / mL
unidad de filtro de membrana desechable DISMIC acetato de celulosa	ADVANTEC Co., LTD.	25CS020AS	0.2 y micro; m tamaño de poro
de la célula de la línea de queratinocitos humanos  FEPE1L-8			Donado por el Dr. W.G. Carter (Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson, Seattle, WA)
K-1	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	complemento aditivo con 500 mg de BSA, 500 mg de hipófisis bovinaextractos corporales, 2,5 mg de insulina, 0,05 y micro; g de h-EGF y 5 mg de heparina
K110 Tipo II medio	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	medio de cultivo basal de queratinocitos
K110 Medio tipo II con K-1 y penicilina-estreptomicina (K110)	Kyokuto Seiyaku Inc.	28204	Añadir 5 mL de Penicilina-Estreptomicina y 10 mL de suplemento aditivo (K-1) en 500 mL de medio de cultivo basal de queratinocitos tipo II K110
PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Disuelva 1 bolsa de polvo de PBS (-) en 1000 mL de agua desionizada y filtrado
10x PBS (-)	Merck KGaA	P-5368	Disuelva 1 bolsa de polvo de PBS (-) en 100 mL de agua desionizada y filtrado
Penicilina-estreptomicina	MP Biomedicals, LLC	1670049	10000 unidades/mL de penisilina G y 10,000μ g/mL de sulfato de estreptmicina en solución salina fisiológica
Tampón de fosfatosolución salina roja BioPerformance CertiCertified, pH 7,4	Merck KGaA	P-5368-10
paquete de tripsina de páncreas porcino	Merck KGaA	T4799
0,05 % tripsina	Merck KGaA	T4799	Disuelva 0,25 g de tripsina y 0,186 g de EDTA.2Na en 500 mL de PBS (-)  y filtrado;
Inhibidor de tripsina de soja	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123
Inhibidor de tripsina	FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation	202-20123	Disuelva 50 mg de inhibidor de tripsina y 500 mg de BSA en 500 mL de PBS (-) y filtrado