Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar tiazol naranja para la detección de ADN en experimentos de electroforesis de gel. El uso de naranja de tiazol permite eliminación de bromuro de etidio, y se logra la detección de la fluorescencia con luz azul o UV.

Resumen

Electroforesis en gel de DNA utilizando agarosa es una herramienta común en laboratorios de biología molecular, permitiendo la separación de fragmentos de ADN por tamaño. Después de la separación, ADN es visualizado por la coloración. Este artículo muestra cómo utilizar tiazol naranja para teñir ADN. Naranja de tiazol compara favorablemente a los métodos de tinción común, que es sensible, barato, excitable con UV o luz azul (para evitar el daño de la muestra) y más seguro que el bromuro de etidio. Laboratorios equipados ya para ejecutar experimentos de electroforesis de ADN con bromuro de etidio pueden cambiar generalmente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes, utilizando luz ultravioleta para la detección. Además, detección de luz azul para evitar el daño de la muestra se logra con un filtro de la fuente y emisión de luz azul. Laboratorios ya equipados para la detección de luz azul pueden cambiar simplemente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes.

Introducción

El propósito de este método es identificar ADN en geles de agarosa utilizando tiazol naranja (a) para la detección de fluorescencia. Debido a su perfil de seguridad favorable y bajo costo, naranja de tiazol puede ver beneficio particular en los laboratorios de docencia de pregrado y laboratorios de investigación realizar biología molecular, especialmente trompas y clonación.

Bromuro de etidio queda el tinte más común para la detección de ADN en geles de agarosa. Esto es principalmente porque se puede obtener muy poco costosa y sólo requiere excitación con luz UV para la detección. Ambos etidio bromuro y tiazol naranja son baratos, con baja ....

Protocolo

1. preparar el gel

Nota: Para los protocolos de la electroforesis del gel general, ver también P.Y. Lee, et al. ¹⁴.

1. Mezcla de agarosa (~ 1% w/v, porcentaje puede ser variado para separaciones de tamaño) en tampón (aproximadamente 70 mL para un gel mini (8 x 7 cm)). Tampones son comúnmente TAE (pH de tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA, aproximadamente 8.6) o TBE (pH de tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato de 90 mM, EDTA 2 mM, aproximadamente 8.3)).
2. Añadir naranja de tiazol a una concentración final de 1.3 μg/mL.
   1. Disolver el tiazol naranja en DMSO para hacer ....

Resultados

Naranja de tiazol permite la detección de ADN, sin utilizar bromuro de etidio y sin necesidad de utilizar luz UV dañan el ADN. Bromuro de etidio es bien sabido ser mutagénico, para eliminar del laboratorio puede ser ventajoso. La luz UV daña el ADN y disminuye la eficiencia de transformación, mientras que la luz azul no daña el ADN. Límites de detección son similares entre el bromuro de etidio, naranja de tiazol y un tinte de ADN comercial común, azul-luz – detectable (figura 1, véase

Discusión

Bromuro de etidio durante mucho tiempo ha sido una herramienta estándar en el laboratorio de biología molecular, a pesar de toxicidad conocido. Padece también requieren luz ultravioleta, que daña el ADN que se está detectando. Thiazole orange ofrece una alternativa económica a bromuro de etidio, así como tintes comerciales útiles pero costosos.

Los beneficios de la naranja de tiazol son así dos veces. En primer lugar, naranja de tiazol simplemente puede utilizarse como sustitución de bromuro d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Escalera de ADN de 2 troncos	New England Biolabs	N0469S
Agarosa (grado de análisis genético)	Fisher	BP1356-100
Linterna de luz azul	WAYLLSHINE (Amazon)	WAYLLSHINE LED
ChemiDoc MP	Biorad	1708280
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
etidio bromuro Fisher		BP1302-10	A modo de comparación, no es necesario para el protocolo
Aparato de gel (Owl Easy Cast)	Thermo Scientific	B1A
Qiagen Qiaquick Kit de extracción de gel	Qiagen	28704
Safe Imager Viewing Glasses	Invitrogen	S37103	Necesario para usar la linterna de luz azul.*
SafeImager 2.0 (Transiluminador de luz azul)	Invitrogen	G6600	Linterna de luz azul se puede utilizar como alternativa
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	A modo de comparación, no es necesario para el protocolo
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Corning	46-010-CM
Thiazol orange	Sigma-Aldrich	390062
*Las gafas también se incluyen con Invitrogen G6600