HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

Huacheng Luo; Amin Sobh; Christopher  D. Vulpe; Edmond Brewer; Sinisa Dovat; Yi Qiu; Suming Huang

doi:10.3791/59382

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HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

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DOI:

10.3791/59382

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31 de marzo de 2019

Huacheng Luo¹ , Amin Sobh² , Christopher D. Vulpe² , Edmond Brewer¹ , Sinisa Dovat¹ , Yi Qiu³ , Suming Huang¹

¹Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, ²Department of Physiological Sciences, University of Florida, ³Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

En este artículo

Resumen

Una biblioteca CRISPR/sgRNA ha sido aplicada a interrogar a genes de la proteína-codificación. Sin embargo, la factibilidad de una biblioteca sgRNA para descubrir la función de un límite CTCF en Regulación génica sigue siendo inexplorada. Aquí, describimos una biblioteca de sgRNA específicos HOX loci para aclarar la función de los límites CTCF en loci HOX .

Resumen

Factor de Unión CCCTC (CTCF)-mediado estable topológicamente asociar dominios (TADs) juegan un papel crítico en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en la vecina TADs. CTCF juega un papel importante en la regulación de la expresión espacial y temporal de los genes HOX que controlan el desarrollo embrionario, modelar cuerpo, hematopoyesis y leukemogenesis. Sin embargo, sigue siendo en gran parte desconocido si y cómo HOX loci asociados CTCF límites regulan la organización de la cromatina y expresión de genes HOX . En el protocolo actual, se ha generado una biblioteca los sgRNA específicos dirigidos a los sitios de unión de CTCF en los loci HOXA/B/C/D para examinar los efectos de alterar límites de cromatina asociada de CTCF en formación TAD y gene HOX expresión. A través de CRISPR Cas9 screening genético, el sitio de unión de CTCF entre los genes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) ha sido identificado como un regulador crítico de dominio de cromatina oncogénicos, como importante para el mantenimiento de genes HOX ectópico patrones de expresión en leucemia mieloide aguda (AML) reordenado MLL. Así, esta biblioteca sgRNA proyección enfoque proporciona nuevas penetraciones en CTCF mediada por genoma organización en loci gen específico y también proporciona una base para la caracterización funcional de los elementos reguladoras genéticos anotados, tanto de codificación y cubierta, durante los procesos biológicos normales en la época del proyecto genoma humano posterior.

Introducción

Estudios recientes de interacción genoma revelaron que las formas del genoma nuclear humano estable dominios topológicamente asociaba (TADs) que se conservan a través de especies y tipos celulares. La organización del genoma en dominios separados facilita y restringe las interacciones entre elementos reguladores (por ejemplo, promotores y potenciadores). El factor de Unión CCCTC (CTCF) se une a límites TAD y juega un papel fundamental en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en el vecino TADs¹. Sin embargo, los datos de Unión CTCF amplia del genoma revelaron que aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos ....