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Artículo de método

HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

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DOI:

10.3791/59382

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31 de marzo de 2019

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1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

En este artículo

Resumen

Una biblioteca CRISPR/sgRNA ha sido aplicada a interrogar a genes de la proteína-codificación. Sin embargo, la factibilidad de una biblioteca sgRNA para descubrir la función de un límite CTCF en Regulación génica sigue siendo inexplorada. Aquí, describimos una biblioteca de sgRNA específicos HOX loci para aclarar la función de los límites CTCF en loci HOX .

Resumen

Factor de Unión CCCTC (CTCF)-mediado estable topológicamente asociar dominios (TADs) juegan un papel crítico en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en la vecina TADs. CTCF juega un papel importante en la regulación de la expresión espacial y temporal de los genes HOX que controlan el desarrollo embrionario, modelar cuerpo, hematopoyesis y leukemogenesis. Sin embargo, sigue siendo en gran parte desconocido si y cómo HOX loci asociados CTCF límites regulan la organización de la cromatina y expresión de genes HOX . En el protocolo actual, se ha generado una biblioteca los sgRNA específicos dirigidos a los sitios de unión de CTCF en los loci HOXA/B/C/D para examinar los efectos de alterar límites de cromatina asociada de CTCF en formación TAD y gene HOX expresión. A través de CRISPR Cas9 screening genético, el sitio de unión de CTCF entre los genes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) ha sido identificado como un regulador crítico de dominio de cromatina oncogénicos, como importante para el mantenimiento de genes HOX ectópico patrones de expresión en leucemia mieloide aguda (AML) reordenado MLL. Así, esta biblioteca sgRNA proyección enfoque proporciona nuevas penetraciones en CTCF mediada por genoma organización en loci gen específico y también proporciona una base para la caracterización funcional de los elementos reguladoras genéticos anotados, tanto de codificación y cubierta, durante los procesos biológicos normales en la época del proyecto genoma humano posterior.

Introducción

Estudios recientes de interacción genoma revelaron que las formas del genoma nuclear humano estable dominios topológicamente asociaba (TADs) que se conservan a través de especies y tipos celulares. La organización del genoma en dominios separados facilita y restringe las interacciones entre elementos reguladores (por ejemplo, promotores y potenciadores). El factor de Unión CCCTC (CTCF) se une a límites TAD y juega un papel fundamental en las interacciones vinculantes de elementos de ADN que se encuentran en el vecino TADs1. Sin embargo, los datos de Unión CTCF amplia del genoma revelaron que aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos sitios de ADN en diferentes tipos celulares, a menudo funciona como una barrera de la cromatina en un sitio específico en una celda tipo pero no en el otro, lo que sugiere que las funciones CTCF junto con otras actividades en la formación de cromatina límites2. Lo que se desconoce es si los elementos de frontera (sitios de unión a CTCF) están directamente relacionados con la función biológica de CTCF y cómo se producen estos enlaces. Por lo tanto, presumimos que sitios específicos de unión de CTCF en el genoma directamente regulan la formación de TADs y controlan las interacciones promotor/enhancer dentro de estos dominios o entre los dominios vecinos. La terminación de los humanos y proyectos de secuenciación de genoma de ratón y posterior análisis epigenéticos han descubierto nuevas firmas moleculares y genéticas del genoma. Sin embargo, el papel de las firmas/modificaciones específicas en la regulación de genes y función celular, así como sus mecanismos moleculares, han de entenderse completamente.

Múltiples líneas de evidencia apoyan que el TADs CTCF-mediada representa cromatina funcional de dominios3,4,5. Aunque CTCF interactúa principalmente con los mismos sitios de ADN en diferentes tipos celulares, datos del CTCF ChIP-seq amplia genoma revelaron que CTCF a menudo funciona como una barrera de cromatina en tipo de una célula pero no en los otros2. CTCF juega un papel esencial durante el desarrollo por mediación de genoma organización4,6,7. Alteración de límites CTCF deteriorado interacciones reforzador/promotor y expresión génica, llevando a la obstrucción del desarrollo. Esto sugiere que el CTCF mediado TADs no sólo son componentes estructurales, sino también unidades regulatorias necesarias para reforzador adecuado acción y gene transcripción5,8,9.

Genes HOX desempeñan papeles importantes durante el desarrollo embrionario y se limitan temporal y espacial en sus patrones de expresión. El locus HOXA forma dos TADs estables separación de genes anteriores y posteriores, por un elemento límite asociado de CTCF en hESCs y IMR90 las células1. Informes recientes demuestran que HoxBlinc, un HoxB locus asociado lncRNA, interviene en la formación de CTCF dirigido TADs e interacciones reforzador/promotor en el locus HOXB . Esto conduce a la activación de gen HOXB anterior durante el compromiso y la diferenciación de ESC10. Además, en lugares geométricos del gene específicos incluyendo el lugar geométrico HOXA , alteración de CTCF mediada por perfiles de expresión de gen específico de linaje TAD dominios cambiados y se asoció con el desarrollo de la enfermedad los Estados11,12. La evidencia apoya una función primaria de CTCF en coordinación de transcripción genética y determinar la identidad de la célula mediante la organización del genoma en dominios funcionales.

A pesar de su papel en el desarrollo embrionario, durante la hematopoyesis, genes HOX regulan función hematopoyética de la célula (capítulo/PC) del vástago y del progenitor. Esto se hace controlando el equilibrio entre la proliferación y diferenciación10,13,14,15. La expresión de genes HOX se regula firmemente a lo largo de la especificación y diferenciación de células hematopoyéticas, con la más alta expresión en HS / Uds. HOX genes disminuyen gradualmente durante la maduración, con sus niveles más bajos que ocurre en había distinguido células hematopoyéticas16. Dysregulation del gene HOX es un mecanismo dominante de la transformación leucémica por propiedades de auto renovación y diferenciación de dysregulating de HS/PCs a transformación leucémica17,18. Sin embargo, el mecanismo de establecer y mantener normal frente a patrones de la expresión oncogénica de genes HOX como redes de regulación asociadas sigue siendo confuso.

Proyección de biblioteca CRISPR Cas9 sgRNA ha sido ampliamente utilizado para interrogar la proteína-codificación genes19 como bien como no codificantes de genes, como lncRNA20 y miRNA21 en diferentes especies. Sin embargo, el costo de usar la biblioteca de sgRNA CRISPR Cas9 para identificar nuevas dianas genómicas sigue siendo alto, porque la secuencia del genoma de alto rendimiento se aplica a menudo para comprobar la proyección de la biblioteca de sgRNA. Nuestro sgRNA sistema se centra en los loci del genoma específicas y evalúa los objetivos sgRNAs a través de RT-PCR de un paso según la expresión del gen marcador, como HOXA9. Además, puede detectarse Sanger secuenciación confirmó que los sgRNA fue integrado en el genoma y las mutaciones Indel identificar lo sgRNA a sitio. A través de la investigación genética de CRISPR Cas9 loci específicos, el límite de la cromatina CBS7/9 ha sido identificado como un regulador crítico para establecer dominio de cromatina oncogénico y mantener patrones de expresión de gene HOX ectópicos en patogenesia AML 12. el método puede ser ampliamente aplicado para identificar no sólo la función específica de límite de CTCF en desarrollo embrionario, la hematopoyesis, leukemogenesis, pero también límite CTCF como potenciales dianas terapéuticas para la futura terapia epigenética.

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Protocolo

1. CTCF sgRNALibrary diseño de una herramienta en línea

  1. Diseño de lo sgRNA dirigidos a sitios de unión de CTCF en los loci HOX humanos usando la herramienta diseñador de la plataforma (GPP) de la perturbación genética (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Sintetizar un total de 1.070 sgRNAs de sgRNAs a 303 al azar genes de segmentación, 60 controles positivos, controles objetivos de humanos no 500 y 207 CTCF elementos o lncRNA dirigidos a genes (figura 1, tabla 1). Cada elemento de ADN targeting es dirigida por la sgRNAs diferentes de 5-10.

2. sgRNA biblioteca clonación

  1. Clonar los oligonucleótidos sintetizados en el vector de la columna vertebral lentivirales de CRISPR (lentiCRISPRv2).
    1. Digerir el vector LentiCRISPRv2 con la enzima de restricción BsmBI a 37 ° C por 2 h.
    2. Buscar la presencia de la banda más grande (alrededor de 12.873 bp) sobre el gel después de la digestión de la BsmBI y luego la purifican con el kit de extracción de gel.
      Nota: Una pieza de relleno pequeños kb 2 también está presente en el gel después de la digestión, pero esto debe ser ignorado.
    3. Ligar los oligonucleótidos sintetizados y digerido LentiCRISPR vector con 150 ng de digerido LentiCRISPR ADN, 1 μl de 10 μm oligos, 2 μl de tampón de ligasa de 10 x T4, 1 μl de T4 ligasa y entonces les incube a 16 ° C durante la noche.
  2. Transformar la biblioteca CRISPR/sgRNA lentivirales en células electro-competentes para la amplificación.
    1. Preparar el electroporator en 1,8 kV, Ω 200 y 25 μF. A continuación, precaliente la recuperación media SOC en un baño de agua de 37 ° C y caliente previamente las placas antibióticas de LB ampicilina a 37 ° C.
    2. Descongelar las células competentes en hielo durante 10 minutos.
    3. Preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y 1 mm cubetas de electroporación en hielo.
    4. 1 μl de un plásmido de la biblioteca de 10 ng/μl ADN en 25 μl de células competentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL de la mezcla y mezclar suavemente por sacudiendo la parte inferior del tubo varias veces manualmente.
    5. Una vez que la cubeta está lo suficientemente fría, transferir la mezcla de células ADN competente a él. Pulse dos veces sobre la cubierta y limpie cualquier gotas de agua desde el exterior de la cubeta con un papel de tejido. Luego colocar la cubeta en el módulo de electroporación y pulse pulso.
    6. Inmediatamente añadir 975 μl de 37 ° C con media SOC. Mezclar por pipeteo arriba y abajo y transfiéralo a un tubo de 15 mL.
    7. Gire e incubar a 37 ° C durante 1 h.
    8. Diluir 100 células μl en 900 μl de medio SOC y coloque 100 μL en una placa de agar antibiótico de ampicilina LB. Incubar durante una noche a 37 ° C.
  3. Extraer el ADN del plásmido de las colonias combinadas usando una columna de maxi-prep como se detalla en el protocolo del fabricante.
    1. Raspe todas las colonias de la placa de agar LB y sembrar una cultura de arrancador de 2 mL de medio antibiótico de LB ampicilina e incubar durante una noche a 37 ° C con agitación vigorosa (~ 200 x g).
    2. Diluir la cultura de arrancador 1: 500 en 100 mL de medio LB ampicilina e incubar a 37 ° C durante 12-16 h con agitación vigorosa (~ 200 x g).
    3. Recoger el precipitado de células bacterianas por centrifugación a 6.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
    4. Resuspenda el sedimento bacteriano en 10 mL de buffer de suspensión.
    5. Lyse el sedimento suspendido con 10 mL de la solución de lisis e invierta vigorosamente 4 - 6 veces. Incubar el lisado por 5 min a temperatura ambiente.
    6. Neutralizar el lisado con 10 mL de tampón de neutralización refrigerados. Mezcle suavemente invirtiendo los tubos 4 - 6 veces e incubar durante 20 min sobre hielo.
    7. Desactivación a 13.500 x g durante 30 min a 4 ° C. Inmediatamente transferir el sobrenadante que contiene el plásmido de ADN a un tubo nuevo.
    8. Repita el paso 2.3.7 y rápidamente transferir el sobrenadante que contiene el plásmido de ADN a un tubo nuevo.
    9. Equilibrar la columna aplicando 10 mL de tampón de equilibrado y permitir que la columna a vacío por flujo de gravedad.
    10. Añadir el sobrenadante a la columna y deje que se introduzca la resina de flujo por gravedad.
    11. Lavar la columna con 2 x 30 mL de tampón de lavado.
    12. Eluir el ADN con 15 mL de tampón de elución.
    13. Precipitar el ADN con 10,5 mL de isopropanol temperatura del ADN eluídas. Mezcla spin hacia abajo inmediatamente a 15.000 x g durante 30 min a 4 ° C y decantar cuidadosamente el sobrenadante.
    14. Lavar el pellet de DNA con 5 mL de etanol al 70%, pellet de ADN centrífuga a 15.000 x g por 10 min y descartar el sobrenadante.
    15. Repita el paso dos veces más 2.5.14.
    16. Centrifugue el pellet de ADN a 15.000 x g por 10 min y decante suavemente el sobrenadante sin perturbar el pellet de DNA.
    17. Secar el pellet para 5-10 min y disolver el ADN en un volumen requerido del búfer (buffer TE, pH 8.0).

3. el alto título sgRNA biblioteca Lentivirus generación

  1. Preparación de la célula: las células HEK293T cultura en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 10% (vol/vol) y antibiótico de penicilina-estreptomicina de 1% (vol/vol) (PS) en frascos de T-25. Colocarlos en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
  2. Paquete de lentivirus: Co transfectar las células HEK293T con 20 μg de vectores biblioteca purificada del paso 2, 15 μg de plásmido de paquete (psPAX2) y 10 μg de plásmido envolvente (pMD2.G) 48 h antes de la cosecha de los virus.
  3. Colección de virus: después de 48 h, collectthe virus sobrenadante y filtrar el sobrenadante a través de una membrana PVDF 0.45 μm baja proteína vinculante de virus.
  4. Concentración de virus: concentrar el sobrenadante lentivirales 50-fold utilizando el concentrador y prueba el virus MOI en el paso 5.
  5. Almacenamiento de información de virus: alícuota del concentrado virus y almacenar en un congelador de-80 ° C.

4. optimizado puromicina concentración

  1. Cultivo de células de leucemia: las células de AML de MOLM13 cultura en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 10% (vol/vol) y 1 x antibióticos de penicilina-estreptomicina (PS) en un matraz de T-125. Colocarlos en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
    Nota: Las células típicamente pasan cada 4-5 d en una relación de split de 1:4 o 1:6, nunca permitiendo que las células llegar a más de confluencia de 70%.
  2. Configurar MOLM13 células en una placa de 12 pozos con una densidad de 1.0 x 104 células/mL, en un volumen total de 2 mL por pozo (2.0 x 104 células).
  3. Análisis del curso del tiempo: las células de MOLM13 tratar con puromicina durante 7 días en el aumento de las concentraciones (0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1,0 μg/mL y 2,0 μg/mL)
    1. Configurar MOLM13 células sin tratamiento de puromicina en el día 0 y fijar 3 pozos replicadas sin tratamiento puromicina como control de día 0 a día 7.
    2. Tratar células MOLM13 con 0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1,0 μg/mL y 2,0 μg/mL, por separado, con cada condición experimental con 3 pozos de replicar.
    3. Cuenta la proporción de células vivas y hacer una curva de supervivencia desde el día 0 al día 7 que contiene todas las condiciones.
  4. Curva de supervivencia: tiñen las células con Trypan azul cuenta viabilidad y todos los días para obtener las curvas de supervivencia para cada concentración de puromicina.
  5. Optimización de la concentración mínima de puromicina: determinar la concentración mínima de puromicina mediante tinción Trypan azul, en que MOLM13 todas las células mueren entre 5-7 días.

5. valoración de biblioteca lentivirales en células de la leucemia MOLM13

  1. Preparación de las células de la AML: recoger las células de AML de MOLM13 con el medio de la transducción de señales (RPMI 1640, 10% FBS, PS de 1% y medio de capa de 8.0 μg/mL) a una densidad de 1.5 x 106 células/ml.
  2. Células de MOLM13 lugar en la placa de la pozo 12 con 1.5 x 106 células en cada pozo.
  3. Descongelar los lentivirus: Retire los lentivirus concentrado del congelador de-80 ° C y descongelar el hielo.
  4. Las células MOLM13 de mezcla con una dosis diferente de los lentivirus concentrado en pocillos distintos, incluyendo el 0, 1, 2.5, 5, 7.5 y 10 μl (total 6 grupos).
  5. Inmediatamente centrifugar estas mezclas a 1.000 x g durante 2 h a 33 ° C y transferir las placas 12-bien a la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante 4 horas.
  6. Después de 4 h, desactivación de las células infectadas a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  7. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, Resuspenda las células transduced con medio fresco (RPMI 1640, 10% FBS y 1% PS) y transferirlos a frascos T-25 e incubar a 37 ° C por 48 h sin puromicina.
  8. Después de 48 h, dividir estas células en 2 frascos (2 grupos): un grupo experimental tratado con 1 puromicina μg/mL durante 5 días y un grupo control sin tratamiento de puromicina durante 5 días.
  9. Realizar selección de puromicina durante 5 días con 1 puromicina μg/mL según el paso 4 hasta que todas las células control no-transduced están muertas. Cambio de medio fresco cada 2 días.
  10. Medir el valor MOI optimizado para la transducción dividiendo el número de células vivas con puromicina con el número de células sin tratamiento de puromicina.

6. transducción de la biblioteca de KO agrupado CRISPR-Cas9

  1. Transducción con lentivirus: infectar a 1.5 x 106 MOLM13 células con 0,3 MOI de lentivirus sgRNA agrupado en medio (RPMI 1640, 10% FBS, PS 1% y medio de capa de 8 μg/mL) en placa de 6 pozos y utilice las células sin la infección por lentivirus como control.
  2. Inmediatamente centrifugar la placa de 6 pozos a 1.000 x g durante 2 h a 33 ° C a spinfect las células y transferir las placas a la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante 4 horas.
  3. Desactivación de las células infectadas a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Suavemente aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet celular, Resuspenda las células transduced con medio fresco (RPMI 1640, 10% FBS y 1% PS) y luego transferirlos a frascos T-25 e incubar a 37 ° C por 48 h sin puromicina.
  5. Después de 48 h, tratar las células con 1 puromicina μg/mL durante 5 días. Intercambio de medios frescos después de 2 días y mantener una densidad óptima de la célula.
  6. La única copia en placas de 96 pocillos con limitación de los métodos de dilución de la semilla e incubar estos clones solo a 37 ° C y 5% CO2. La cultura les durante 3-4 semanas.
  7. Después de una sola célula crece para arriba en una población, transferir la mitad de las células en placas de 24 pocillos para más cultura selección de puromicina y verificar estos clones en el paso siguiente. Mantenga el resto de las células.

7. proyección de la biblioteca de KO CRISPR-Cas9 combinado con un solo paso RT-qPCR

  1. Determinar la efectividad del sgRNA clon integrado por evaluación de la expresión del gen marcador HOXA9 con un paso de la transcriptasa reversa reacción en cadena polimerasa (RT-qPCR de un solo paso).
    Nota: HOXA9 son altamente expresada en las células de la AML MOLM13 en leukemogenesis22,23.
  2. Cuenta lo sgRNA había integrado MOLM13 de la célula y transferencia 1 x 104 células por pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos.
  3. Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 5 min, bien retirar y desechar el sobrenadante con una pipeta sin perturbar el sedimento celulares.
  4. Lavar las células con 125 μl de tampón PBS y centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 5 minutos. Luego retire 120 μl del sobrenadante con una pipeta y aproximadamente 5 μl de PBS en cada pocillo.
  5. Añadir 50 μl de la mezcla principal de lisis celular que contiene 48 μl de tampón de lisis celular, 1 μl de solución de proteinasa K (10 mg/mL) y 1 μl de DNasa solución (1 mg/mL) a cada pocillo. Luego pipetear arriba y abajo 5 veces para volver a suspender el sedimento celular.
  6. Incubar la mezcla por 10 min a temperatura ambiente, seguido de 5 min a 37 ° C y luego de 75 ° C durante 5 minutos.
  7. Almacenar el lisado de célula en congelador de-80 ° C.
  8. La preparación de la reacción de RT-qPCR de un solo paso: descongelar la mezcla de reacción de un solo paso y otros componentes de la reacción a 4 ° C. Luego girar por brevemente para recoger las soluciones en la parte inferior de los tubos y coloque en hielo sin luz. Mezclar y centrifugar suavemente.
  9. Añadir 1 μl de lisado de célula a los pozos de la PCR con la mezcla de reacción RT-qPCR, incluyendo 1 μl del primer avance del gen marcador (300 nM) y la cartilla (300 nM), 0.125 μl de transcriptasa reversa (10 U/μL) y 5 μl de la mezcla de reacción de un solo paso (2 x).
  10. Sellar pozos con película ópticamente transparente y suavemente agitar y mezclar los componentes de la reacción.
  11. Coloque la placa PCR de 96 pocillos en un instrumento PCR en tiempo real.
  12. Ejecutar la reacción reversa de la transcripción por 10 min a 50 ° C, seguida por la polimerasa inactivación y desnaturalización de la DNA durante 1 min a 95 ° C.
  13. Realizar RT-PCR con 40 ciclos de reacción de PCR: desnaturalización durante 15 s a 95 ° C, recocido/extensión y placa de fluorescencia de 20 s a 60 ° C y luego análisis de curva de fusión a 65-95 ° C mediante incrementos de 0,5 ° C en 2-5 s/paso.
  14. Configurar alza, reguladas y no cambio los grupos según los niveles de expresión del gene HOXA9 en comparación al control, por separado. Uso de gen β-actina como control gen housekeeping.

8. verificación del integrado sgRNAs Clones positivos mediante genotipificación y secuencia de Sanger

  1. Verificar los clones de expresión HOXA9 disminuyó a través de Sanger secuenciación y realizar la PCR con el genoma de 50-100 ng MOLM13 ADN, tampón de reacción polimerasa de 5 μl (10 x), primer avance de 1 μl (10 μm) (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) y 1 μl de reversa cartilla (10 μm) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 μl dNTP (10mM), polimerasa (5 U /µL) de la 1 unidad. Realizar la reacción de PCR con la desnaturalización inicial a 94 ° C por 30 s y luego más desnaturalización a 94 ° C por 20 s, recocido a 56 ° C por 20 s, extensión a 68 ° C por 20 s (total 30 ciclos), extensión final a 68 ° C por 10 min. y a 4 ° C.
  2. Extraer y purificar los productos PCR (tamaño 285 bp) con un PCR Purification Kit.
  3. Ligan los productos PCR purificados en el vector de T con 2 μl T4 ligadura de tampón (10 x), 50 ng T vector ADN (50 ng/μL), 25 ng purificada PCR DNA (285 bp), ligasa de T4 1 μl (3 unidades/μL) y el lugar de la ligadura de la mezcla en una incubadora a 16 ° C durante la noche.
  4. Transferir la mezcla de ligadura en células competentes DH5α, crecen en una placa de agar antibiótico LB ampicilina e incubar durante una noche a 37 ° C.
  5. Selección de los clones individuales de la placa LB y verificar por genotipificación y Sanger secuenciación.

9. detección de sgRNAs inducida Indel mutación digestión por nucleasa

  1. Detectar que lo sgRNA integrado solo clon inducida tarifas Indel por un ensayo de prueba de la nucleasa.
  2. Por separado preparar amplicones de PCR con 50-100 ng Indel mutante (prueba) y DNA de tipo salvaje (WT, referencia) como plantilla de PCR, 5 μl de tampón de reacción polimerasa (x 10), 1 μl dNTP (10mM), polimerasa (5 U/μL) de la 1 unidad, primer avance de 1 μl (10 μm) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') y 1 μ L invertir primer (10 μm) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). La reacción de PCR fue realizada con una desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s y luego desnaturalización a 98 ° C por 20 s, recocido a 56 ° C por 20 s, extensión a 72 ° C por 30 s (total 30 ciclos) y extensión final a 72 ° C por 10 min. y el mantenimiento a 4 ° C.
  3. Configurar el grupo de mezcla del heterodúplex con 200 ng de la "referencia" (20 ng/μL) y 200 ng de amplicones de PCR "test" (20 ng/μL) en tubo PCR de 0,2 mL y el grupo de mezcla homoduplex con sólo 400 ng de «referencia» amplicones de PCR como un control.
  4. Por separado incubar la mezcla del heterodúplex y homoduplex a 95 ° C por 5 min en un vaso de precipitados de 1 L llena con 800 mL de agua y luego enfriar gradualmente a temperatura ambiente para templar y formar heteroduplex o homoduplexes.
  5. Por separado digest 400 ng de la mezcla del heterodúplex y homoduplex recocida 1 μl indel mutación detección nucleasa (2.5 U/μL) y 2 μl nucleasa reacción tampón (10 x a 42 ° C durante 60 min).
  6. Analizar las muestras digeridas con electroforesis en gel de agarosa, el ADN de mezcla del heterodúplex debe cortarse en pequeños fragmentos (70-250 PA) y el homoduplex ADN (320 bp) no debe cortarse.

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Resultados

CRISPR Cas9 tecnología es una herramienta potente para los estudios de genómica funcional. Está rápidamente reemplazando genes convencionales técnicas de edición y tiene gran utilidad para aplicaciones gene-centrado de genoma e individuales. Aquí, la primera individual clonados loci específicos CRISPR Cas9 de v. sgRNA biblioteca contiene 1.070 sgRNAs de sgRNAs a 303 al azar genes de segmentación, 60 controles positivos, controles objetivos de humanos no 500 y 207 CTCF elementos o lncRNA d...

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Discusión

Gen codificante de proteínas relacionadas con bibliotecas sgRNA se han aplicado en un sistema de evaluación funcional para identificar genes y redes de regulación de funciones celulares específicas sgRNA enriquecimiento24,25,26 ,27,28. Región no codificante varias relacionadas con sgRNA bibliotecas también fueron demostradas en pantallas funcionales específic...

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Divulgaciones

No tenemos conflictos de interés relacionados con este informe.

Agradecimientos

Los autores también agradecen a Nicholas Cesari para editar el manuscrito. El trabajo fue financiado por becas del Instituto Nacional de salud (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinasa KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycinThermo Fisher ScientificA1113802
Stbl3 cells Tecnologías de la Vida 
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems PromegaA137A
T4 ligasa Biolabs de Nueva Inglaterra  M0202S
QIAquick Kit de extracción de gelQIAGEN28706
QIAuick kit de purificación PCRQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR®   Kit verde de un solo pasoBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco' s Águila Modificada Medium Thermo Fisher Scientific 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Suero fetal bovino (FBS) Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicilina/estreptomicina/L-glutamina Tecnologías de la Vida 
Concentrador Lenti-X Clontech631232
Solución de azul de tripanoThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) Genessee Scientific  25-507
Tampón TAE Thermo Fisher Scientific FERB49
Topógrafo® Kits de detección de mutacionesTecnologías de ADN integradas706020
Biorad Campana universal II Sistema de gel DocBio-Rad170-8126
5424R Eppendorf5404000138
Baños secos digitales/calentadores de bloqueThermo Fisher Scientific88870002
serie TSX Congeladores ultrabajosThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma&comercio; Steri-Cult&comercio; CO2  IncubadorasThermo Fisher Scientific3308
Herasafe™ KS, Cabina de seguridad biológica de clase IIThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall™ Leyenda y oficio; Serie de centrífugas XT/XFThermo Fisher Scientific 75004506
Fisherbrand™   Isotemp&comercio; Baños de aguaThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific™   Localizador y comercio; Sistemas de estanterías y cajas PlusThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Sistema de detección PCR en tiempo realBio-Rad1855195
MiniAmp™ TermocicladorTecnología aplicada a los biosistemasA37834
Thermo Scientific™   Búho y comercio; EC300XL2 Fuente de alimentación compactaThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific™   Búho y comercio; EasyCast&comercio; B1 Mini Sistemas de electroforesis en gelThermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® Rotor de tubos y asadoresVWR International10136-084
VWR® Miniagitador de incubaciónVWR International12620-942
Balanza analítica MS104TS/00
DS-11 FX y DS-11 FX+DeNovix Inc.DS-11 FX
C7373031196508410378016 Espectrofotómetro 30133522 de METTLER TOLEDO

Referencias

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