La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.
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Artículo de método
Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en varias vías de señalización y participa notablemente en la coordinación de la función de la cromatina y los procesos asociados al ADN. Esta modificación implica una acción secuencial de varias enzimas, incluyendo E1 ubiquitina activa, E2 ubiquitina-conjugating y E3 ubiquitina-ligasa y es revertida por deubiquitinasas (DUBs). La ubiquitinación induce la degradación de las proteínas o la alteración de la función proteica incluyendo la modulación de la actividad enzimática, la interacción proteína-proteína y la localización subcelular. Un paso crítico para demostrar la ubiquitinación o desubiquitinación de proteínas es realizar reacciones in vitro con componentes purificados. Las reacciones efectivas de ubiquitinación y desubiquitinación podrían verse muy afectadas por los diferentes componentes utilizados, los cofactores enzimáticos, las condiciones de amortiguación y la naturaleza del sustrato. Aquí, proporcionamos protocolos paso a paso para llevar a cabo reacciones de ubiquitinación y desubiquitinación. Ilustramos estas reacciones utilizando componentes mínimos del ratón Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1 y RING1B, una ligasa de ubiquitina E3 que monoubiquitina histone H2A en lisina 119. La desubiquitinación de H2A nucleosomal se realiza utilizando un complejo mínimo de desubiquitinación represiva de policomb (PR-DUB) formado por la deubiquitinasa humana BAP1 y el dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) de su cofactor ASXL2. Estos ensayos de ubiquitinación/desubiquitinación se pueden llevar a cabo en el contexto de nucleosomas recombinantes reconstituidos con proteínas purificadas por bacterias o nucleosomas nativos purificados a partir de células de mamíferos. Destacamos las complejidades que pueden tener un impacto significativo en estas reacciones y proponemos que los principios generales de estos protocolos puedan adaptarse rápidamente a otras ligasas y deubiquitinasas de la ubiquitina E3.
Introducción
La ubiquitinación es una de las modificaciones post-traduccionales más conservadas y es crítica para una amplia variedad de organismos, incluyendo levaduras, plantas y vertebrados. La ubiquitinación consiste en la unión covalente de ubiquitina, un polipéptido de 76 aminoácidos altamente conservado, a proteínas diana y se produce en tres pasos secuenciales que implican tres enzimas, es decir, E1-activación, E2-conjugating y E3 ligeas1, 2,3. Esta modificación post-traduccional desempeña un papel central en un amplio espectro de procesos biológicos. De hecho, las ligasas E3, qu....
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Protocolo
1. GSH-agarose Purificación de afinidad del complejo GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase
- Utilice la construcción de expresión de bacterias pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) para transformar la bacteria BL21 (DE3) (ver Tabla de Materiales)23. Esta construcción permite la expresión del dominio RING1B murino 1-159 fusionado al dominio 1-109 BMI1 con la etiqueta GST en la estructura básica pGEX-6P-2.
- Realizar un cultivo de arranque durante la noche mediante la inoculación de ril-bacterias que expresan GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1 -109 aa) en 20 mL de medio de caldo LB en presenci....
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Resultados
Las proteínas GST-BMI1 y RING1B están bien producidas en bacterias y se pueden extraer fácilmente en la fracción soluble. La Figura 1A muestra una tinción azul de Coomassie para una purificación típica del complejo GST-BMI1-RING1B. Las bandas GST-BMI1 y RING1B migran al peso molecular esperado, 45 kDa y 13 kDa respectivamente. En particular, el complejo de ligasa E3 es altamente homogéneo con niveles muy bajos de contaminantes de proteínas bacterianas y/o pro.......
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Discusión
Hay varias ventajas de establecer ensayos robustos de ubiquitinación in vitro y desubiquitinación para proteínas de interés. Estos ensayos se pueden utilizar para: (i) establecer condiciones óptimas y definir requisitos mínimos para estas reacciones, (ii) determinar constantes cinéticas y bioquímicas enzimáticas, (iii) definir las funciones de los cofactores o inhibidores que pueden afectar a estas reacciones, (iv) identificar interfaces de interacción, (v) probar el impacto de mutaciones artificiales o asociadas a la en.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a Diana Adjaoud por la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) y Genome Canada (2016-2019) a E.B.A. E.B.A. es un estudiante senior de los Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.M y N.S.K. tienen una beca de doctorado del FRQ-S. H.B tenía una beca de doctorado del Ministerio de Educación Superior y de Investigación Científica de Túnez y la Fundación Cole.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Perlas de amilosa | agarosa New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0,5 mL filtros centrífugos 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Tecnología de señalización celular | #8240 | |
| Perlas anti-Flag-agarose | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Cóctel antiproteasa | Sigma-Aldrich | ||
| BL21 (DE3) Bacterias CodonPlus-RIL | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Columna de cromatografía vacía | Biorad | #731-1550 | |
| Péptido bandera Sigma-Aldrich | #F3290 | ||
| GSH-perlas de agarosa | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Nucleasa microcócica (MNasa) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Perlas de agarosa Ni-NTA | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-metilmaleimida (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Filtro de jeringa de poro 0,45 μ m | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polietilenimina (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Enzima activadora (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
Referencias
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews ....
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Reimpresiones y permisos
