Investigación de alteraciones en Caecum Microbiota después de una lesión cerebral traumática en ratones

La lesión cerebral traumática (TBI) es un problema de salud pública mundial y la principal causa de muerte y discapacidad en adultos jóvenes^1,2. El TBI causa muchas muertes cada año, y los sobrevivientes experimentan una variedad de discapacidades físicas, psiquiátricas, emocionales y cognitivas. Por lo tanto, el TBI es una pesada carga para la familia del paciente y los recursos sociales. TBI implica tanto la lesión cerebral primaria que ocurre en el momento del trauma y cualquier lesión cerebral secundaria que desarrolla horas a meses después de la lesión inicial. Lesión cerebral secundaria está mediada por varias cascadas bioquímicas, que no sólo son perjudiciales para el cerebro, sino que también tienen efectos negativos significativos en varios sistemas de órganos, incluyendo el sistema gastrointestinal³.

Actualmente, existen tres modelos para inducir TBI en experimentos con animales: lesión de percusión fluida, impacto cortical de control (CCI) y aceleración de caída de peso. La lesión de percusión de fluido lateral (LFPI) es el modelo más utilizado para establecer lesiones cerebrales difusas (DAI)⁴. El dispositivo produce lesión cerebral a través de una craniectomía mediante la aplicación de un breve pulso de presión de fluido a la dura intacta. Este pulso es creado por el golpe del péndulo. LFPI es un método de modelado reproducible y controlable para la investigación TBI.

El microbioma se define como los genomas colectivos de todos los microorganismos que residen en el cuerpo humano. Los microbios intestinales en particular no sólo juegan un papel importante en la homeostasis intestinal y la función, sino que también regulan muchos aspectos de la fisiología del huésped y el funcionamiento de otros órganos⁵. En los últimos años, hay cada vez más evidencia que indica que la microbiota intestinal regula el desarrollo cerebral y la función a través de los ejes cerebro-gut⁶. Interrupción de la microbiota intestinal se ha relacionado con varios trastornos de la función cerebral incluyendo la enfermedad de Parkinson, trastornos del estado de ánimo, y autismo⁷. Recientemente, estudios preclínicos también han reportado que la lesión cerebral aguda puede inducir cambios en la microbiota intestinal^8,9.

10 encontró disminuciones significativas en tres especies microbianas y aumentos en dos especies microbianas después de la TBI inducida por CCI. Esta evidencia indica que la modulación de la microbiota intestinal puede ser un método terapéutico en el manejo de TBI. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a los cambios en la microbiota intestinal inducidas por lesiones cerebrales siguen siendo desconocidos. Por esta razón, se requiere un modelo relativamente simple y eficiente de estudiar los cambios en la microbiota intestinal después de que se requiera TBI. Por lo tanto, el presente estudio presenta un protocolo para examinar alteraciones en la microbiota intestinal después de TBI en ratones.

Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Experimental de Etica Animal de la Universidad de Zhejiang. Todos los instrumentos y materiales utilizados en la cirugía son estériles. El proceudre TBI tarda unos 20 minutos.

1. Cuidado de animales

1. Utilice ratones C57BL/6J machos de 5 a 6 semanas (20-25 g de peso) en este experimento.
2. Mantenga a los ratones en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h y asegúrese de que reciban alimentos y agua ad libitum. Proporcione las mismas cantidades de alimentos y agua a los grupos de la farsa y la TBI a lo largo del estudio.
3. Haga todos los esfuerzos para minimizar el dolor y la incomodidad de los animales.

2. Inducción de una lesión cerebral traumática

1. Inyectar ketamina (80-100 mg/kg)/Xylazine (10 mg/kg) IP para la anestesia. Pruebe la profundidad de la anestesia con un reflejo ocular o un reflejo del dolor. Use lágrimas artificiales o un pomada lubricante para los ojos para evitar que los ojos se sequen.
2. Después de la anestesia, poner el ratón en posición propensa. Utilice una almohadilla de calentamiento con temperatura controlada para mantener la temperatura a 37 oC durante la cirugía y durante 30 minutos después de TBI.
3. Afeitar el cabello del área de la incisión.
4. Desinfectar el cuero cabelludo con 70% de etanol utilizando tres exfoliantes alternos, luego inciso el cuero cabelludo en un plano sagital.
5. Utilice fórceps para retirar la incisión en ambos lados y separar ligeramente el periosteum.
6. Utilice un marcador para dibujar un círculo (3 mm de diámetro) en el área parietal derecha del cráneo, a 2 mm de distancia de la línea media.
7. Taladre el cráneo con un taladro eléctrico. Asegúrese de que este paso se opera cuidadosamente para proteger la dura de ser dañado.
8. Retire la solapa ósea y exponga una pequeña ventana ósea (3 mm de diámetro).
9. Coloque una cánula de lesión de plástico (diámetro interno de 2,5 mm, longitud a 8 mm) sobre la craneotomía y encozó la cánula al cráneo utilizando un acrílico dental.
10. Llene la cánula con 0,9% de NaCl estéril (salina normal) utilizando una jeringa (5 ml) para asegurarse de que no haya burbujas en la cánula.
11. Encienda el osciloscopio y el amplificador y asegúrese de que el tubo de alta presión del dispositivo de lesión de percusión de fluido lateral (LFPI) esté libre de burbujas de aire. Pruebe el dispositivo entregando unos 10 pulsos hasta que dé una señal constante. Ajuste el ángulo de la posición inicial del péndulo para alcanzar una intensidad de pulso de aproximadamente 2,0 atm.
12. Conecte la cánula de lesión al dispositivo LFPI. Inducir la lesión cerebral tirando del gatillo y liberando el péndulo. Luego, obtenga un pulso y transmítelo a la dura a través de todo el sistema de tubos cerrados llenos de fluidos.
13. Operar a los ratones en el grupo falso con el mismo procedimiento quirúrgico. No realice el LFPI.

3. Tratamiento post-cirugía

1. Después de inducir la lesión cerebral, retire la cánula de plástico y sutura la incisión. Durante la cirugía administrar buprenorfina (2mg/kg) SQ o IP y posteriormente cada 6-12 h durante tres días.
2. Poner el ratón sobre una almohadilla de calentamiento hasta que esté ambulatorio. Ajuste la temperatura de la almohadilla de calentamiento a 37 oC para acelerar la reanimación anestésica.
3. Vuelva a colocar el ratón en la jaula y administre alimentos y agua ad libitum.

4. Laparotomía y recolección de muestras del caecum

1. Eutanasia a los ratones por_CO2 seguido de dislocación cervical en los momentos correspondientes.
   NOTA: En este experimento, los puntos de tiempo elegidos fueron 1 h, 6 h, 1 d, 3 d, y 7 d lesión cerebral postraumática para analizar la evolución dinámica de la microbiota intestinal.
2. Retire el cabello de la superficie del abdomen. Desinfectar el abdomen con 70% de etanol.
3. Coloque una cortina estéril sobre el ratón. Haga una incisión desde la línea media inferior del abdomen, justo por encima del prepucio en los ratones machos.
4. Después de que los intestinos estén expuestos, localice el cecum y separándolo suavemente de otros tracto intestinales. Evite agarrar el cecum con fórceps dentados o afilados. Usa fórceps atraumáticos, como fórceps de Adson con serraciones.
5. Corta el caecum con tijeras afiladas.
6. Extraiga el contenido de caecum manualmente en un apósito estéril y guárdelo en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
7. Almacene el contenido de caecum a -80 oC hasta el análisis del microbioma.

5. Extracción de ADN y secuenciación y análisis de datos 16S-rDNA

1. Aislamiento del ADN de las heces
   NOTA: Para este experimento se utilizó un kit de aislamiento de ADN disponible comercialmente(Tabla de materiales).
   1. Use un bisturí para raspar 300 mg de heces en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y colocar el tubo en hielo.
   2. Agregue 1 ml de búfer de inhibición a cada muestra. Vórtice continuamente durante 1 min o hasta que la muestra de heces se homogeneice a fondo.
   3. Centrifugar la muestra a la velocidad máxima durante 1 min para peletizar las partículas de heces.
   4. Pipetear 2 ml de proteinasa K en un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml. Pipet 600 l del sobrenadante del paso 5.1.3 en el tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene proteinasa K. A continuación, agregue 600 s de Tampón 1 y vórtice para 15 s.
   5. Incubar la muestra a 70oC durante 10 min.
   6. Añadir 600 ml de etanol al 100% al lisado (1:1 relación) y mezclar por vórtice. Centrifugar brevemente a la velocidad máxima para eliminar las gotas del interior de la tapa del tubo.
   7. Aplicar 600 s de la lisado a la columna de centrifugado. Centrífuga a la velocidad máxima durante 1 min. Deseche el flujo. Repita este paso una vez más. A continuación, transfiera la columna a un nuevo tubo de recogida de 2 ml.
   8. Abra la columna de giro y agregue 500 sl de buffer 2. Centrifugar a la velocidad máxima durante 1 min. Retire la columna y colóquela en un nuevo tubo de recogida de 2 ml.
   9. Agregue 500 sl de búfer 3 en la columna. Centrífuga a la velocidad máxima durante 3 min. Deseche el flujo. Repita el proceso de centrifugación una vez para asegurarse de que el buffer 3 está completamente eludado.
   10. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de recogida de 2 ml y pipeta de 200 ml de Tampón 4 directamente sobre la membrana. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente (RT), luego centrifugar a la velocidad máxima durante 1 min para eluir el ADN.
2. Secuenciación 16S-rDNA y análisis de datos
   1. Utilice 20-30 ng de ADN para generar amplicons.
   2. Utilice imprimaciones disponibles comercialmente diseñadas para las regiones relativamente conservadas que bordean las regiones hipervariables V3 y V4 de bacterias 16S rDNA. En el presente estudio se utilizaron las imprimaciones directas que contienen la secuencia "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" y las imprimaciones inversas que contienen la secuencia "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
   3. Haga la mezcla de reacciones de PCR añadiendo 2,5 ml de tampón 1, 2 l de dNTP, 1 l de cada imprimación, 0,5 ml de ADN polimerasa y 20 ng de ADN de plantilla en un tubo. Utilice ddH₂O para ajustar el sistema de reacción a 25 sL.
   4. Establezca los parámetros de reacción de PCR de la siguiente manera: realice la predesnaturalización a 94 oC durante 3 min una vez. Realizar la desnaturalización a 94 oC durante 5 s, anular a 57 oC durante 90 s, extender a 72 oC durante 10 s, y repetir este 24x.
   5. Realice la secuenciación de extremo emparejado PE250/300 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilice el paquete de análisis de datos QIIME para el análisis de datos rRNA 16S.
      NOTA: En este experimento, la secuenciación del ADN y el análisis de datos fueron realizados principalmente por una empresa de secuenciación profesional.

El establecimiento de TBI se muestra en la Figura 1. Después de la anestesia y la desinfección, el cuero cabelludo fue incisivo sagitalmente(Figura 1A). Una craneotomía (3 mm de diámetro) fue trephinada en el cráneo sobre la corteza parietal derecha con un taladro eléctrico, la dura se mantuvo intacta(Figura 1B,C). Se colocó una cánula de lesión plástica sobre la ventana ósea y se cementó en el cráneo mediante acrílico dental(Figura 1D).

El procedimiento de percusión de fluido lateral se muestra en la Figura 2. Antes de iniciar el dispositivo se probó mediante la entrega de unos 10 pulsos hasta que da una señal constante. El ángulo del péndulo se ajustó a la posición inicial para alcanzar una intensidad de pulso de aproximadamente 2,0 atm(Figura 2A). La cánula se llenó con la solución salina normal estéril. Entonces la cánula se conectó al dispositivo LFPI(Figura 2B). La lesión cerebral fue inducida por la creación de un impulso en la cavidad craneal cerrada (Figura 2C).

La laparotomía y la colección de muestras fecales de caecum se muestran en la Figura 3. La laparotomía se realizó en la parte inferior del abdomen y a lo largo de la línea media(Figura 3A). El caecum fue identificado y separado suavemente(Figura3B,C). El caecum se encuentra generalmente en la parte inferior derecha del abdomen. Luego fue incisado con tijeras afiladas(Figura 3D). El contenido de caecum(Figura 3E)se extrajo y almacenó en tubos de 1,5 ml (Figura 3F). Las muestras fecales se almacenaron inmediatamente a -80 oC antes de su uso posterior.

La secuenciación 16S-rDNA demostró una reducción de la diversidad de la microbiota de caecum en ratones 3 días después de TBI, los taxones más abundantes en el contenido de caecum de los grupos falsos y TBI se mostraron en la Figura 4. La prueba de suma de rango wilcoxon se realizó para evaluar las diferencias de microbiota entre los grupos DeBI y falsos en el análisis de secuenciación 16S, y el valor p fue inferior a 0,05. La escala multidimensional no métrica (NMDS) también mostró una composición cambiada de cecú microbiota después de TBI(Figura 5).

Figura 1 : Establecimiento de TBI. (A) Después de la anestesia y la desinfección, el cuero cabelludo se incisió. (B) Operar una craneotomía circinate en el cráneo sobre la corteza parietal derecha. (C) Mantenga la dura intacta. (D) Cementar la cánula de lesión plástica en el cráneo usando acrílico dental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : El procedimiento de percusión de fluido lateral. (A) Ajuste del ángulo de posición inicial del péndulo. (B) Relleno de la cánula con solución salina normal estéril, luego conexión de la cánula al dispositivo LFPI. (C) Inducción de lesión cerebral por liberación del péndulo y creación de un impulso en la cavidad craneal cerrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Laparotomía y recolección de muestras fecales de caecum. (A) Inicio de la laparotomía desde la parte inferior del abdomen y a lo largo de la línea media. (B,C) Identificación del caecum y posterior eliminación (suave). (D) Corte del caecum con tijeras afiladas. (E) Extracción del contenido de caecum. (F) Almacenamiento de las muestras de contenido de caecum en tubos Eppendorf de 1,5 ml. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : La comparación de la diversidad de la microbiota de caecum. La mayoría de los taxones abundantes en contenido de caecum de grupos falsos y TBI demostraron una menor diversidad de microbiota de caecum en ratones 3 días después de TBI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : El análisis NMDS. La escala multidimensional no métrica (NMDS) mostró una composición cambiada de la microbiota de caecum después de TBI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores agradecen sinceramente a Baohong Wang por su orientación técnica.