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Artículo de método

Cromogénico In Situ Hybridization ss una herramienta para el diagnóstico de cáncer de cabeza y cuello relacionado con el VPH

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DOI:

10.3791/59422

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14 de junio de 2019

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1Department of Pathology, Georges Pompidou European Hospital, Assistance publique - Hôpitaux de Paris (APHP), Paris Descartes University, 2Paris Cardiovascular Research Center (PARCC), Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) U970, 3Laboratory of Immunology, Georges Pompidou European Hospital, APHP, Paris Descartes University

En este artículo

Resumen

La hibridación in situ del ARN cromogénico del virus del papiloma humano (VPH) se considera una de las normas de oro para la detección activa de la infección por el virus del papiloma humano dentro de los tumores. Permite la visualización de la expresión de ARNm del VPH E6-E7 con localización y evaluación semicuantitativa de su señal.

Resumen

La infección por el virus del papiloma humano (VPH) es un factor de riesgo importante para un subtipo de carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC), que tiende a estar asociado con un mejor resultado que el OPSCC relacionado con el alcohol y el tabaco. La hibridación in situ (CISH) cromogénica del ARN viral del VPH podría permitir la evaluación semicuantitativa de las transcripciones virales de las proteínas oncogénicas E6 y E7 y una visualización in situ con una buena resolución espacial. Esta técnica permite el diagnóstico de una infección activa con la visualización de la transcripción del VPH en las células infectadas por el VPH tumoral. Una ventaja de esta técnica es la evitación de la contaminación de las células no neoplásicas infectadas por el VPH adyacentes al tumor. En general, sus buenos rendimientos de diagnóstico han considerado que es el estándar de oro para la identificación activa de la infección por VPH. Dado que la interacción de proteínas virales E6 y E7 con las proteínas celulares pRb y p53 es obligatoria para la transformación celular, el ARN CISH del VPH es funcionalmente relevante y refleja agudamente la infección activa por VPH oncogénico. Esta técnica también es clínicamente relevante, ya que los niveles de transcripción "bajos" o "altos" del VPH ayudaron a identificar dos grupos de pronóstico entre los pacientes con cáncer de cabeza y cuello p16 relacionados con el VPH. Aquí presentamos el protocolo para el ARN HPV cISH manual realizado en diapositivas de parafina incorporada sin forcina fija (FFPE) con un kit obtenido del fabricante. En lugar de la revelación cromogénica, la hibridación in situ del ARN también se puede realizar con revelación fluorescente (RNA FISH). También se puede combinar con inmunomanchas convencionales.

Introducción

El ARN CISH del VPH es una poderosa herramienta para la detección de la infección activa por VPH, que puede resultar crucial en lesiones benignas o malignas en diversos lugares, como la orofaringe o el cuello uterino. La detección de una infección activa por VPH puede apoyar el diagnóstico de una lesión inducida por el VPH y, por lo tanto, influir en su tratamiento y pronóstico.

El VPH es la infección de transmisión sexual más frecuente, y se han descrito más de 100 genotipos virales1. Esquemáticamente, genotipos de bajo riesgo como los genotipos 6 y 11 son conocidos por inducir verrugas genitales, papilomatosis respiratoria recurrente y otras lesiones benignas, mientras que los genotipos de alto riesgo como los genotipos 16 y también 18 son responsables de la mayoría de los cánceres cervicales y los cánceres anales y desempeñan un papel en la oncogénesis delHNSCC en proporciones variables, como se explica en los datos epidemiológicos regionales 2.

Hay varias herramientas disponibles para la detección de la infección por el VPH. Como una infección por VPH de alto riesgo conduce a la expresión de proteínas oncogénicas virales E6 y E73, la detección de transcripciones E6 y E7 es ampliamente vista como el estándar de oro para la identificación activa de la infección por VPH4. El ARN CISH del VPH se puede realizar en muestras de FFPE que se obtienen con bastante facilidad de pacientes que sufren de diversas enfermedades relacionadas con el VPH. Su rendimiento ha sido evaluado en neoplasia intraepitelial escamosa en el cuello uterino, el ano y la vagina, y en elcarcinoma de células escamosas invasivas en el cuello uterino, el ano y el tracto aerodigestivo superior 5: logra una sensibilidad de más del 98% entre los casos de reacción en cadena de la polimerasa del ADN del VPH (PCR) positivos. Esto es ligeramente mejor que la inmunomancha p16 (93%) y hibridación in situ del ADN del VPH (ADN ISH: 97%), que se utilizan más comúnmente. En otra cohorte de 57 pacientes con carcinoma de células escamosas (CCS) derivados de la región de la cabeza y el cuello, la región genital, la piel y las vías urinarias, en comparación con el ADN del VPH, el ARN CISH del VPH logró una mejor sensibilidad (100% frente a 88%) y especificidad (87% frente a 74%)6.

La inmunomancha P16 es un marcador indirecto que refleja la interrupción del ciclo celular que puede ser causada (pero no exclusivamente) por la infección por VPH4,7. Esta prueba rentable posee una buena sensibilidad y un valor predictivo negativo y se recomienda como un marcador suplente de la infección por VPH de alto riesgo en el cáncer de orofaringe (OPC) por el Colegio de Patólogos Americanos (CAP) y por la Unión para la Internacional Control del Cáncer (UICC)8.

Aunque este artículo se centra únicamente en la detección del VPH en HNSCC, el ARN CISH del VPH es clínicamente relevante en otras condiciones que implican la infección por el VPH. Por ejemplo, esta técnica puede mejorar la precisión del diagnóstico de lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado del cuello uterino (LSIL, anteriormente conocida como neoplasia intraepitelial cervical, grado 1 [CIN1]) para casos morfológicamente ambiguos9. En cuanto a las CEC orofaríngeas, el ARN CISH del VPH permite la identificación de sCC relacionados con el VPH, etiquetados como distintos de las CCCc orofaríngeas no relacionadas con el VPH en la reciente octava edición de la Clasificación TNM de Cáncer de Cabeza y Cuello (de la Unión para el Cáncer Internacional Control [UICC])10. Dado que el SCC relacionado con el VPH presenta un mejor pronóstico con mayor supervivencia y mayor sensibilidad a la radioterapia y quimioterapia que el SCC11,12,13,sin vPH, la detección de la infección por VPH puede afectar gestión del paciente14,15. Además, el ARN CISH del VPH se puede utilizar para el diagnóstico de carcinoma sinonasal multifenotípico relacionado con el VPH con una señal más alta que el ADN del VPH CISH16. Varios análisis multivariados sugieren que la detección de transcripciones E6 y E7 está correlacionada con un mejor pronóstico en sCC orofaríngeo en general7,15,17,18 y en el subgrupo de p16-positivo orofaríngeo SCC19,20.

Aquí presentamos el protocolo para el ARN HPV manual CISH realizado en diapositivas FFPE con un kit obtenido del fabricante.

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Protocolo

El protocolo sigue las directrices éticas y fue aprobado por el Comité ético (Comité-de-Protection-des-Personnes Ile-de-France-II, #2015-09-04).

1. Preparación de los materiales

  1. Preparación de 1x tampón de lavado
    1. Preparar 3 L de 1x tampón de lavado añadiendo 2.94 L de agua destilada y una botella (60 ml) de tampón de lavado (50x) (ver la Tabla de Materiales)a un carboy grande. Mezcla bien.
      NOTA: El tampón de lavado 1x puede prepararse con antelación y almacenarse a temperatura ambiente durante un máximo de 1 mes.
  2. Preparación de reactivos de contramancha
    1. Prepara un 50% de hematoxilina.
      1. En una campana de humos, agregue 100 ml de hematoxilina I de Gill (ver la Tabla de Materiales)a 100 ml de agua destilada en un plato de tinción.
        NOTA: La solución de tinción de hematoxilina al 50% se puede reutilizar durante un máximo de 1 semana.
    2. Preparar 0.02% (p/v) agua de amoníaco (reactivo azulado).
    3. En la campana de humos, agregue 1,43 ml de 1 N de hidróxido de amonio a 250 ml de agua destilada en un cilindro graduado u otro recipiente. Selle el cilindro con película de parafina. Mezclar bien su contenido para 3x–5x.
      NOTA: Para la cuantificación del ensayo, es fundamental utilizar hidróxido de amonio. Los reactivos pueden prepararse con antelación. Asegúrese de que todos los contenedores permanezcan cubiertos.
  3. Preparación de 1 reactivo de recuperación de destino
    1. En un vaso de precipitados grande, agregue 70 ml de reactivo de recuperación de destino 10x (consulte la Tabla de materiales)a 630 ml de agua destilada.
    2. Coloque el vaso de precipitados en una placa de calentamiento con un agitador magnético. Cúbralo con papel de aluminio.
    3. Hervir su contenido a 100 oC durante 10-15 min.
      NOTA: No deje hervir durante más de 30 minutos.
  4. Equilibrio de reactivos
    1. Asegúrese de que el horno de hibridación esté encendido y a 40 oC. Coloque el papel humidificador húmedo en la parte inferior de la bandeja.
      NOTA: Se necesita un horno de hibridación (ver la Tabla de Materiales)para los pasos 3.4 a 4.2.
    2. Retire los reactivos de amplificación (AMP1–AMP6, consulte la Tabla de Materiales)del refrigerador y manténgalos a temperatura ambiente, al menos 30 minutos antes del paso de incubación correspondiente.
    3. Antes de cada uso, caliente las sondas de objetivo y/o control durante al menos 10 minutos a 40 oC en el horno o en un baño de agua o incubadora.

2. Mejora de la adhesión y desparafinación en la campana de humos

NOTA: Inicie el protocolo con muestras histológicas de 3 a 5 m de espesor montadas en diapositivas no retenidas.

  1. Con el fin de mejorar la adherencia, hornee los portaobjetos a 60oC durante 1 h o a 40oC durante la noche en un horno.
  2. Cargue el portaobjetos con diapositivas histológicas no retenidas. Sumerja la rejilla de deslizamiento durante 5 minutos en xileno fresco contenido en un plato de tinción, con agitación ocasional. repetir con xileno fresco.
  3. Sumerja la rejilla de deslizamiento durante 3 minutos en etanol 100% fresco contenido en un plato de tinción, con agitación constante. Repita con etanol 100% fresco.
  4. Deje que los portaobjetos se sequen durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: No reutilice los reactivos de desparafinación para la deshidratación de las diapositivas después del ensayo.

3. Pretratamiento de tejidos

NOTA: Estos pasos siguen la recomendación de pretratamiento "estándar" de acuerdo con las instrucciones del fabricante para muestras de cabeza y cuello. Es posible que sea necesario ajustar el tiempo de las secciones 3.1 y 3.2 dependiendo del tejido manipulado.

  1. Bloqueo de la actividad de la peroxidasa
    1. Añadir de 4 a 6 gotas de peróxido de hidrógeno (ver la Tabla de Materiales)a cada diapositiva e incubarlas durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    2. Lave los portaobjetos 2x durante 2 minutos en agua destilada a temperatura ambiente.
  2. Rotura de los límites de ARN/tejido
    1. Con una garra, retire la lámina de aluminio del reactivo de recuperación de objetivos 1x hirviendo (TTR1x) de la sección 1.3 y deje de agitar. Sumerja el portaobjetos lentamente y con mucho cuidado durante 15 minutos.
      NOTA: La inmersión a fuego lento debe persistir durante este paso.
      ADVERTENCIA: Utilice la garra para manipular la lámina de aluminio y la rejilla de deslizamiento para evitar lesiones por quemaduras. Asegúrese de usar el equipo de protección personal adecuado, como guantes y una capa de laboratorio.
    2. Con la garra, transfiera inmediatamente la rejilla de deslizamiento caliente a un baño de agua destilada y lávela durante 2 minutos.
      NOTA: Asegúrese de que las muestras no se enfríen en el TTR1x.
    3. Lave los portaobjetos en etanol fresco 100% durante 2 min.
    4. Deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante 2 min.
  3. Creación de barreras
    1. Con una pluma de barrera hidrófoba (ver la Tabla de Materiales),dibuje una barrera alrededor de la muestra. Dejar secar por lo menos 5 min.
      NOTA: Deje que la barrera se seque realmente. Si se desgasta durante el procedimiento, no dude en dibujarlo de nuevo. Evite tocar el tejido con la pluma. El protocolo se puede pausar durante la noche aquí.
  4. Digestión de la proteasa
    1. Coloque las diapositivas en el portaobjetos y agregue 4 gotas de Protease Plus por muestra (consulte la Tabla de materiales).
    2. Cubrir la bandeja de control de humedad con una tapa e insertarla en el horno de hibridación durante 30 min a 40 oC.
      NOTA: Para evitar la evaporación, asegúrese de que la perilla de giro esté completamente girada a la posición de bloqueo.
    3. Retire la bandeja del horno y retire la portaobjetos.
    4. Una diapositiva a la vez, retire rápidamente cualquier exceso de líquido y coloque el portaobjetos en un portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de agua destilada.
    5. Lave los portaobjetos 2x durante 2 minutos en agua destilada a temperatura ambiente. Agitar constantemente.

4. Ejecutar el ensayo

NOTA: No deje que las secciones se sequen entre los pasos de incubación.

  1. Hibridación de la sonda de VPH
    NOTA: Asegúrese de que las sondas estén precalentadas para disolver cualquier precipitación antes de su uso. Para este paso, en lugar de la sonda de VPH,también se puede utilizar la isorasa de peptidil-prolislasa B (PPIB) para el control positivo o la dihidrodipicolinato reductasa (DAPB) para el control negativo (véase la Tabla de Materiales).
    1. Toque y/o deslice las diapositivas para eliminar cualquier exceso de líquido y colóquelos en el portaobjetos. Agregue 4 gotas de sonda de VPH para cubrir por completo cada sección.
    2. Cubra la bandeja con una tapa e insértela en el horno durante 2 h a 40 oC.
      NOTA: Para evitar la evaporación, asegúrese de que el tono de giro esté completamente girado a la posición de bloqueo.
    3. Retire la bandeja del horno y retire la portaobjetos.
    4. Una diapositiva a la vez, retire rápidamente cualquier exceso de líquido y coloque el portaobjetos en un portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de 1 x tampón de lavado.
    5. Lave los portaobjetos en 1ta de lavado durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Repita esto con el tampón de lavado 1x fresco.
  2. Hibridación de AMP1, AMP2, AMP3 y AMP4
    NOTA: Estos pasos incluyen la hibridación en el horno de hibridación y AMP1–AMP4 del kit comprado (ver la Tabla de Materiales).
    1. Toque y/o deslice para eliminar cualquier exceso de líquido de las diapositivas y colóquelos en el portaobjetos. Agregue 4 gotas de AMP1 para cubrir por completo cada sección.
    2. Cubra la bandeja con una tapa e insértela en el horno durante 30 min a 40 oC.
    3. Retire la bandeja del horno y retire la portaobjetos.
    4. Una diapositiva a la vez, retire rápidamente cualquier exceso de líquido y coloque el portaobjetos en un portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de 1 x tampón de lavado.
    5. Lave los portaobjetos en 1ta de lavado durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Repita esto con el tampón de lavado 1x fresco.
    6. Repita los pasos 4.2.1–4.2.5, pero utilice 4 gotas de AMP2 en lugar de AMP1 e incubar durante 15 min a 40 oC. Lave los portaobjetos 2x durante 2 min, ambas veces en tampón de lavado fresco.
    7. Repita los pasos 4.2.1–4.2.5, pero utilice 4 gotas de AMP3 en lugar de AMP1 e incubar durante 30 min a 40 oC. Lave los portaobjetos 2x durante 2 min, ambas veces en tampón de lavado fresco.
    8. Repita los pasos 4.2.1–4.2.5, pero utilice 4 gotas de AMP4 en lugar de AMP1 e incubar durante 15 min a 40 oC. Lave los portaobjetos 2x durante 2 min, ambas veces en tampón de lavado fresco.
  3. Hibridación de AMP5 y AMP6
    NOTA: Estos pasos no incluyen la hibridación en el horno, sino la hibridación a temperatura ambiente. AMP5 y AMP6 provienen del kit comprado (ver la Tabla de Materiales).
    1. Toque y/o deslice las diapositivas para eliminar cualquier exceso de líquido y colóquelos en el portaobjetos. Agregue 4 gotas de AMP5 para cubrir por completo cada sección.
    2. Cubra la bandeja con una tapa e incubar durante 30 minutos a temperaturaambiente.
    3. Una diapositiva a la vez, retire rápidamente cualquier exceso de líquido y colóquelo en un portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de 1 x tampón de lavado.
    4. Lave los portaobjetos en 1ta de lavado durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitación constante. Repita esto con el tampón de lavado 1x fresco.
    5. Repita los pasos 4.3.1–4.3.4, pero utilice 4 gotas de AMP6 en lugar de AMP5 e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos 2x durante 2 min, ambas veces en tampón de lavado fresco.

5. Detección de señal con 3,3'-diaminobenzidina

ADVERTENCIA: La diaminobenzidina (DAB) es tóxica. Siga las precauciones y pautas de seguridad adecuadas al desechar y manipular este producto químico.

  1. Mezclar volúmenes iguales de DAB-A y DAB-B (consulte la Tabla de Materiales)en un tubo de tamaño adecuado dosificador el mismo número de gotas de cada solución. Hacer 120 s de sustrato de DAB por sección (2 gotas de cada reactivo/total de 4). Mezclar bien para 3x–5x.
  2. Tome cada diapositiva, una a la vez, de la rejilla de diapositivas y toque y/o deslice para eliminar el exceso de líquido antes de colocarlo en el portaobjetos.
  3. Pipeta de 120 ol de DAB en cada sección de tejido. Asegúrese de que las secciones estén cubiertas e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  4. Deseche el DAB restante de acuerdo con la normativa local e inserte la corredera en un portaobjetos sumergido en un plato de tinción lleno de agua del grifo.

6. Contramanchación

  1. Mueva la rejilla deslizante a un plato de tinción que contenga un 50% de solución de tinción de hematoxilina, déjela reposar durante 30 s a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que las diapositivas se convertirán en púrpura.
  2. Transfiera inmediatamente el portaobjetos a un plato de tinción que contenga agua del grifo y lave los portaobjetos de 3x a 5veces moviendo el bastidor hacia arriba y hacia abajo.
  3. Sigue repitiendo el paso de lavado con agua fresca del grifo hasta que los toboganes estén limpios, mientras que las secciones permanecen moradas.
  4. Sustituya el agua del grifo en la placa de tinción por un 0,02% de agua de amoníaco. Mueva el rack hacia arriba y hacia abajo 2x–3x. Tenga en cuenta que la sección de tejido debe volverse azul.
  5. Sustituya el agua de amoníaco por agua del grifo. Lave los portaobjetos de 3x a 5x.

7. Deshidratación

  1. Mueva la rejilla deslizante a un plato de tinción que contenga 70% de etanol en la campana extractora de humos y déjela reposar durante 2 minutos con agitación ocasional.
  2. Mueva la rejilla deslizante a un primer plato de tinción que contenga 100% etanol y déjelo reposar durante 2 minutos con agitación ocasional.
  3. Mueva la rejilla deslizante a un segundo plato de tinción que contenga 100% etanol y déjelo reposar durante 2 minutos con agitación ocasional.
  4. Mueva el portaobjetos a un plato de tinción que contenga xileno y déjelo reposar durante 5 minutos con agitación ocasional.

8. Montaje deslizante

  1. Retire las diapositivas de la corredera y atérelas planas con las secciones hacia arriba en la campana de humos.
  2. Monte una corredera a la vez añadiendo 1 gota de un medio de montaje basado en xileno a cada diapositiva y colocando cuidadosamente un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm sobre la sección. Evite atrapar burbujas de aire.
  3. Seque al aire los portaobjetos durante 5 min.

9. Evaluación de muestras

  1. Examine las secciones de tejido bajo un microscopio de campo brillante estándar con un aumento de 20x-40x.

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Resultados

Como se describe aquí, en el cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, un caso puede considerarse positivo en presencia de tinción punctiforme marrón en el citoplasma o en los núcleos de las células tumorales. En la mayoría de los estudios, la señal se considera como "positiva" o "no detectada"14. Se han notificado métodos de semicuantificación de la señal, pero carecen de estandarización entre los equipos. Por ejemplo, en algunos estudios, las señales se puntuaron como 1+ con 1-3 puntos por...

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Discusión

El ARN CISH del VPH realizado con un kit adquirido es una poderosa herramienta para la detección de transcripciones virales e indica una infección activa por VPH. Realizado manualmente, los pasos del protocolo son en general fáciles de seguir, y el kit comprado es conveniente. Esta técnica permite la tinción de 19 muestras histológicas más una diapositiva de control a la vez, y el ensayo dura alrededor de 8 h. Es fundamental no dejar que las muestras se sequen entre pasos a menos que se mencione lo contrario. La condició...

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Divulgaciones

CB: juntas, seminarios: MSD, BMS, Astrazeneca, Roche

Agradecimientos

Los autores agradecen el departamento de Patología de Hopital Européen Georges Pompidou y Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel y Giséle Legall); la plataforma histológica de PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre); Virginia Clark para la edición de idiomas; Alexandra Elbakyan por su contribución.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de hematoxilina, branquia n.º 1MerckGHS132
HybEZ Oven (110v)Advanced Cell Diagnostics Inc.321710
Bastidor deslizante HybEZCell Diagnostics Inc.
Pluma de barrera hidrofóbica ImmEdgeAdvanced Cell Diagnostics Inc.
Reactivos de detección RNAscope 2.5 HD-BROWNAdvanced Cell Diagnostics Inc.322310Este kit incluye los reactivos de amplificación AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 y AMP6, y los reactivos de detección DAB-A y DAB-B
RNAscope 3-Plex Negative Control ProbeAdvanced Cell Diagnostics Inc.320871Sonda de control positivo DAPB
RNAscope 3-Plex AdvancedCell Diagnostics Inc.320861PPIB
RNAscope H202 & Reactivo de proteasa másDiagnóstico celular avanzado Inc.322330Peróxido de hidrógeno x2 y proteasa Plus x 1
Sonda de ARN- HPV16/18Advanced Cell Diagnostics Inc.
Reactivos de recuperación de dianas de ARNscopeAdvanced Cell Diagnostics Inc.322000
Reactivos tampón de lavado RNAscopeAdvanced Cell Diagnostics Inc.310091Tampón de lavado 50X x4
Advanced 300104310018311121

Referencias

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Reimpresiones y permisos

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Detección de ARN del VPHportaobjetos con tejido fijado en formalina e incluido en parafinareactivo de recuperación de dianasdigestión con proteasahorno de hibridaciónsustrato DABevaluación mediante microscopía ópticapuntuación de CISH de ARN
Cromogénico In Situ Hybridization ss una herramienta para el diagnóstico de cáncer de cabeza y cuello relacionado con el VPH
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