Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Yu-Ting Huang; Dinja van der Hoorn; Leire M. Ledahawsky; Anna A. L. Motyl; Crispin  Y. Jordan; Thomas  H. Gillingwater; Ewout  J. N. Groen

doi:10.3791/59438

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Artículo de método

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

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DOI:

10.3791/59438

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9 de abril de 2019

Yu-Ting Huang¹^,² , Dinja van der Hoorn^*¹^,² , Leire M. Ledahawsky^*¹^,² , Anna A. L. Motyl^*¹^,² , Crispin Y. Jordan¹ , Thomas H. Gillingwater¹^,² , Ewout J. N. Groen¹^,²

¹Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh, ²Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este método describe un enfoque robusto y reproducible para la comparación de los niveles de proteína en distintos tejidos y en diferentes puntos de tiempo del desarrollo usando un enfoque Blot western cuantitativo estandarizado.

Resumen

Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en investigación básica y clínica. Sin embargo, como con muchas técnicas experimentales similares, los resultados de los análisis de Western blot es fácilmente influenciado por decisiones en el diseño y ejecución del experimento. Proteínas específicas de limpieza se han utilizado tradicionalmente para normalizar los niveles de proteína para la cuantificación, sin embargo, éstos tienen una serie de limitaciones y por lo tanto han sido cada vez más criticados en los últimos años. Aquí, describimos un protocolo detallado que hemos desarrollado para que podamos llevar a cabo complejas comparaciones de la variación de expresión de proteínas en diferentes tejidos, modelos de ratón (incluyendo modelos de la enfermedad) y los puntos de tiempo del desarrollo. Mediante una tinción fluorescente proteína total e introduciendo el uso de un estándar interno de la carga, es posible superar las limitaciones existentes en el número de muestras que pueden compararse en experimentos y comparar sistemáticamente los niveles de la proteína a través de un rango de condiciones experimentales. Este enfoque amplía el uso de técnicas de inmunoblot tradicional, lo que permite a los investigadores explorar mejor expresión de la proteína a través de muestras y diferentes tejidos.

Introducción

Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína, incluyendo en homogenados de tejido o extractos. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en la investigación básica y clínica, donde puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para identificar la presencia de enfermedad¹^,². Primero borrar occidental fue descrito en 1979 como un método para transferir proteínas de geles de poliacrilamida a hojas de nitrocelulosa y posteriormente visualizar las proteínas usando los anticuerpos secundarios que fueron radiactivo etiquetados o....