Artículo de método

Estrategias no invasivas para la manipulación crónica de la actividad neuronal controlada por DREADD

DOI:

10.3791/59439

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25 de agosto de 2019

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1Section on Light and Circadian Rhythms (SLCR), National Institute of Mental Health, 2Howard Hughes Medical Institute, Department of Neuroscience, Scripps Research Institute

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos dos métodos no invasivos para controlar crónicamente la actividad neuronal utilizando quimiogenética en ratones. Se utilizaron gotas para los ojos para administrar clozapina-N-óxido (CNO) diariamente. También describimos dos métodos para la administración prolongada de CNO en agua potable. Estas estrategias para el control neuronal crónico requieren una intervención mínima reduciendo el estrés de los animales.

Resumen

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Las estrategias quimiogenéticas han surgido como herramientas fiables para el control remoto de la actividad neuronal. Entre ellos, los receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) se han convertido en el enfoque quimiogenético más popular utilizado en la neurociencia moderna. La mayoría de los estudios suministran el ligando clozapina-N-óxido (CNO) utilizando una única inyección intraperitoneal, que es adecuada para la activación/inhibición aguda de la población neuronal objetivo. Sin embargo, sólo hay algunos ejemplos de estrategias para la modulación crónica de las neuronas controladas por DREADD, la mayoría de las cuales se basan en el uso de sistemas de administración que requieren intervención quirúrgica. Aquí, ampliamos dos estrategias no invasivas para entregar el ligando CNO para manipular crónicamente la población neuronal en ratones. CNO se administró mediante el uso de gotas para los ojos repetitivas (diarias) o crónicamente a través del agua potable del animal. Estos paradigmas no invasivos dan como resultado una activación robusta de los receptores de diseño que persistieron a lo largo de los tratamientos de CNO. Los métodos descritos aquí ofrecen alternativas para el control crónico mediado por DREADD de la actividad neuronal y pueden ser útiles para experimentos diseñados para evaluar el comportamiento en animales en movimiento libre, centrándose en métodos de entrega de CNO menos invasivos.

Introducción

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Los avances técnicos en el campo de la neurociencia han permitido a los científicos identificar y controlar con precisión la actividad de determinadas poblaciones neuronales1. Esto ha contribuido a entender mejor la base de los circuitos neuronales ysu impacto en el comportamiento animal, así como, la revisión de dogmas establecidos 2,3. Entre estas nuevas herramientas, las estrategias optogenéticas y quimiogenéticas han tenido un profundo impacto no sólo en la calidad de los descubrimientos, sino también en la forma en que se conciben y diseñanlosexperimentos 4.....

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Protocolo

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Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las directrices de los Comités de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y el número de animales utilizados.

1. Inyecciones de virus asociados a los adenos en el hipocampo

NOTA: Los ratones machos de tipo salvaje de fondo mixto (híbrido B6/129 F1, de 3 meses de edad) fueron inyectados estereotaxically con un AAV que codifica el receptor muscarínico M3 (hM3Dq) en el hipocampo. Durante todo el experimento, los ratones fueron de una sola casa, bajo una luz regula....

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Resultados

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Observamos que la administración repetitiva de CNO utilizando gotas para los ojos provocó una inducción robusta de la expresión c-Fos en la mayoría de las neuronas infectadas (Figura1C),lo que muestra que la eficacia de la administración de CNO se mantiene durante la exposición repetitiva. Además, se observó una inducción significativa de c-Fos en muestras recogidas 2 h después del tratamiento con CNO, en comparación con las muestras obtenidas 6 h después de la exposición a CNO (Figuras

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Discusión

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Los DREADD han surgido como un enfoque popular y eficaz para manipular remotamente la actividad neuronal17. El diseño de estrategias alternativas para la entrega de CNO aumentará ampliamente el espectro de opciones disponibles para configuraciones experimentales específicas. Además, las estrategias no invasivas para la entrega de CNO minimizan cualquier posible interpretación errónea de los resultados mediante la reducción de los efectos secundarios adversos que pueden afectar directamente la salu.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros del Instituto Nacional de Salud Mental (ZIA MH002964-02). Nos gustaría agradecer el apoyo del NIMH IRP Rodent Behavioral Core (ZIC MH002952).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BSASigma ciencias de la vida#A2153-100GPolvo liofilizado ≥ 96% (electroforesis en gel de agarosa)
Ratones C57BL/6JEl laboratorio Jackson#000664ratones machos, 3 meses de edad
Capilares DrummondScientific Company#3-000-203-G/XDiámetro exterior: 1,14 pulgadas
Clozapina-N-óxidoSigma#C08325 mg
ForanoBaxter#NDC 10019-360-60Isoflurano, USP
Microinyector IIIDrummond Scientific Company#3-000-207Nanoject III - Inyector de nanolitros programable
Medios de montajeInvitrogen#P36930Reactivo antidecoloración Prolong Gold
ParaformaldehídoCiencias de la Microscopía Electrónica#15710Solución acuosa al 16% (sin metanol), 10 mL
de señalización celularde anticuerpos primarios c-Fos#2250Sc-Fos (9F6) AcM de conejo ( 100µ L)
rAAV5/hSyn-hm3D-mCherryUNC Vector Core Titulador: ~3 x 1012 vg/mL
rAAV5/hSyn-mCherryUNC Vector Core Titro: ~3x10e12 vg/mL
Anticuerpo secundarioInvitrogen#A21206Alexa Fluor TM 488 Burro anti-conejo IgG(H+L), 2mg/ml
Triton X-100americanbio.com#AB02025-00100
Tecnología

Referencias

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  1. Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
  2. Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of dep....

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Etiquetas

Control de DREADDsuministro de CNOadministraci n mediante gotas ocularesadministraci n en agua potablemodulaci n neuronal cr nicaan lisis de la expresi n de cFosmicroscop a confocal de fluorescenciacirug a estereot xicainyecci n hipocampal de AAV

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