Uso de óxido de deuterio como herramienta no invasiva y no letal para evaluar la composición corporal y el consumo de agua en mamíferos

Resumen

Este artículo describe la técnica de dilución de óxido de deuterio en dos mamíferos, un insectívoro y carnívoro, para determinar el agua corporal total, la masa corporal magra, la masa grasa corporal y el consumo de agua.

Resumen

Los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal son técnicas comunes utilizadas para evaluar el estado de salud o la aptitud de una especie. Los sistemas de puntuación de condición del cuerpo dependen del evaluador y tienen el potencial de ser altamente subjetivos. Los índices de condición corporal pueden confundirse por forrajeo, los efectos del peso corporal, así como problemas estadísticos e inferenciales. Una alternativa a los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal es el uso de un isótopo estable como el óxido de deuterio para determinar la composición corporal. El método de dilución de óxido de deuterio es una técnica cuantitativa repetible que se utiliza para estimar la composición corporal en humanos, vida silvestre y especies domésticas. Además, la técnica de dilución de óxido de deuterio se puede utilizar para determinar el consumo de agua de un animal individual. Aquí, describimos la adaptación de la técnica de dilución de óxido de deuterio para evaluar la composición corporal en grandes murciélagos marrones (Eptesicus fuscus) y para evaluar el consumo de agua en gatos (Felis catis).

Introducción

Los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal son técnicas comunes utilizadas para evaluar el estado de salud o la aptitud de una especie^1,2. Muchas especies domésticas y zoológicas tienen sistemas únicos de puntuación de condición corporal (BCS) que se utilizan para evaluar el músculo de un animal y el tejido graso superficial³. Sin embargo, la evaluación de BCS se basa en el evaluador, lo que significa que el BCS es una medida objetiva o semicuantitativa cuando es evaluada por un evaluador capacitado. En las especies de vida silvestre, los índices de condición corporal se utilizan comúnmente en lugar de BCS y se basan en una proporción de masa corporal al tamaño del cuerpo o masa corporal al antebrazo^2. Condición del cuerpo indicis son a menudo confundidos por los efectos de la forrajeo y pueden ser confundidos por el tamaño del cuerpo, así como los problemas estadísticos e inferenciales⁴.

Una alternativa a los sistemas de puntuación de condición corporal y los índices de condición corporal es utilizar un isótopo estable para determinar la composición corporal. Un isótopo estable comúnmente utilizado es el óxido de deuterio (D₂O), una forma no radiactiva de agua en la que los átomos de hidrógeno son isótopos de deuterio. El método de dilución de óxido de deuterio descrito en este estudio puede ser una técnica no subjetiva, cuantitativa y repetible utilizada para estimar la composición corporal en humanos⁵ y una amplia gama de especies^4,6,7. Esta técnica puede ser ventajosa para estudiar la composición corporal en la vida silvestre. Por ejemplo, se puede utilizar para evaluar los cambios longitudinales en la composición corporal, como antes y después de una acción de gestión. Sin embargo, en algunas especies de vida silvestre el óxido de deuterio puede sobreestimar el contenido real de agua⁸. Por lo tanto, al adaptar la técnica para una especie, es importante validar el método comparando el método de óxido de deuterio con el análisis de canales para especies no amenazadas. En el caso de las especies amenazadas y en peligro de extinción, un método no destructivo como la absortiometría de rayos X dual (DXA) debe considerarse como un método de comparación alternativo al método destructivo estándar del oro para el análisis completo de la canal.

Además de la composición corporal, la técnica de dilución D₂O se puede utilizar para determinar el consumo de agua de un animal individual^9. Esta aplicación única de D₂O se puede utilizar para responder no sólo preguntas de investigación, pero puede ser útil para evaluar el consumo de agua de animales individuales alojados en grandes entornos sociales.

Aquí, describimos la adaptación de la técnica de dilución D₂O para evaluar la composición corporal en un insectívoro, grandes murciélagos marrones (Eptesicus fuscus), y para evaluar el consumo de agua en un carnívoro, gatos (Felis catis).

Protocolo

Todos los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri y llevados a cabo bajo el #17649 #16409 permiso de Colección Científica de Vida Silvestre del Departamento de Conservación de Missouri (MDC, por sus).

1. Preparación de solución estéril, isotónica y salinizada D₂O

1. Haga una solución de stock de 50 ml de 9,0 g/L salinizado D₂O.
   1. Pesar 450 mg de NaCl de grado farmacéutico y transferir todo el NaCl a un vaso esterilizado de 100 ml. Registre la cantidad exacta de NaCl a 4 decimales en el cuaderno de laboratorio.
   2. Usando un cilindro graduado estéril, mida 50 g de óxido de deuterio del 99,8% y transfiera al vaso de precipitados estéril que contiene el NaCl. Registre la cantidad exacta de óxido de deuterio en 4 decimales en el cuaderno de laboratorio u hoja de cálculo.
   3. Filtrar 10 ml de resistencia isosmótica NaCl (9,0 g/L) a través de un filtro de disco estéril no pirogénico con poros submicrométricos (0,2 m).
   4. Fije una aguja de 20 G al filtro de disco estéril no pirogénico con poros submicranos (0,2 m) equipados con un barril de jeringa de 10 ml. Inserte en el tabique de un vial vacío estéril de 100 ml.
   5. Coloque un tubo de vacío en una aguja de 22 G e inserte la aguja en el tabique del vial vacío estéril de 100 ml.
   6. Vierta 10 ml de la solución en el barril de la jeringa. Encienda lentamente el vacío hasta que la solución de stock D₂O comience a filtrarse lentamente en el vial estéril. Continúe vertiendo la solución de stock D₂O en el barril de la jeringa hasta que se filtren todos los 50 ml.
      NOTA: Es posible que sea necesario diluir o concentrar la solución en stock en función de la dosis requerida. La dosis de D₂O variará en función de la especie y la sensibilidad del método analítico. En el caso de los gatos, se utilizó la solución de trabajo para administrar una dosis de 0,7 g/kg D₂O. La solución de stock descrita anteriormente minimiza la cantidad de solución de NaCl introducida por vía subcutánea en el animal, al tiempo que permite una medición precisa de la dosis. Para mamíferos pequeños como murciélagos, esta concentración debe diluirse en una solución de trabajo como 0,1600 g/ml. Esta concentración permite medir y administrar con precisión la dosis de 0,75 g/kg D₂O en aproximadamente 100 ml o menos de solución de NaCl.

2. Preparación de solución de trabajo estéril, isotónica y salinizada D₂O para murciélagos

1. Pesar un vial estéril vacío de 10 ml y registrar el peso a 4 decimales más cercanos. Escala de tare.
2. Utilice una jeringa de 1,0 ml para transferir 0,65 ml de la solución de stock D₂O al vial estéril vacío de 10 ml al frasco estéril vacío de 10 ml. Peso récord de D₂O a 4 decimales. Escala de tare.
3. Calcule el volumen de D₂O en el vial vacío de 10 ml. Utilice la siguiente ecuación.
   
   donde W se registra peso y D es la densidad de 99,8% D₂O (1.107 g/mL).
4. Utilice el volumen calculado y el peso conocido de la D₂O para determinar el volumen de solución salina isotónica necesaria para crear una solución de trabajo de 0,1600 g/ml.
5. Inserte en el tabique del vial estéril de 10 ml, la aguja de 22 G (adjunta al tubo de vacío). Inserte en el tabique del vial estéril de 10 ml, la aguja de 20 G (adjunta a un filtro de jeringa de 0,22 m equipado con un barril de jeringa de 10 ml).
6. Vierta la masa/volumen calculado de NaCl isotónico en el barril de la jeringa y encienda el vacío para permitir un goteo lento en el vial estéril de 10 ml.
7. Registre el peso del vial y asegúrese de que se crea una solución de trabajo de 0,1600 g/ml.

3. Determinación de la composición corporal de grandes murciélagos marrones (Eptesicus fucsus) con D₂O

NOTA: La solución en stock de D₂O utilizada en el protocolo es de 0,1598 g/ml. Antes de recolectar sangre, asegúrese de que la eliminación de hasta 200 l de sangre será del 10% del volumen total de sangre del murciélago y está dentro de las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC, por sus seno) para la extracción de sangre. Todos los animales deben ser ayunados o el abdomen palpado para asegurar un estómago vacío. Una comida reciente podría alterar el peso del animal resultando en resultados confusos ya que los cálculos para determinar la grasa corporal dependen de la masa corporal del animal.

1. Anestesia un gran murciélago marrón.
   1. Utilice 5.0% isoflurano para la inducción. Mantener un plano estable de la anestesia usando 0.5% -3.0% isoflurano.
   2. Determinar la profundidad de la anestesia adecuada mediante la prueba del reflejo de retirada del pedal (pinchando los dedos de los murciélagos). El murciélago no debe responder a la sensación y la frecuencia respiratoria debe permanecer lenta y estable. Ajuste el isoflurano según sea necesario para mantener un plano estable de la anestesia.
   3. Registre el nivel de isoflurano, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y otra información según lo requiera la IACUC.
2. Pesar el bate marrón grande y registrar el peso en 4 decimales.
3. Limpie el uropatagium (membrana de la cola) sobre la vena interfemoral con una almohadilla de preparación de alcohol y deje secar. Aplique una fina capa de vaselina sobre la vena interfemoral.
4. Utilice una aguja de 29 G para perforar la porción dorsal de la vena interfemoral y recoger 100 ml de sangre utilizando tubos capilares de heparina sódica de plástico. Asegurar una mezcla adecuada de toda la sangre con la heparina sódica enrollando suavemente cada tubo después de la recolección y etiquetando el tubo.
5. Usando una máquina DXA calibrada para mamíferos pequeños, obtenga tres escaneos DXA del murciélago^10.
6. Determinar la masa (en g) de D₂O para inyectar multiplicando el peso del murciélago en kg por la dosis de D₂O de 0,75 g/kg. Determinar el volumen de la dosis de D₂O (V) calculada dividiendo el peso de la dosis de D₂O por la concentración de la solución de trabajo.
   
   
7. Utilice una jeringa de insulina con una aguja de 29 G unida para extraer el volumen de D₂O calculado. Pese el D₂O, la jeringa de insulina y la aguja. Grabar en 4 decimales.
8. Inyecte el D₂O por vía subcutánea sobre la región dorsal de la cadera del murciélago anestesiado.
9. Permita que el murciélago se recupere de la anestesia y registre el tiempo de la inyección.
10. Inmediatamente después de la inyección, pese la jeringa de insulina ahora vacía con la aguja de 29 G conectada. Registre el peso en 4 decimales.
11. Determinar la dosis de D₂O inyectada restando el peso posterior a la inyección de la jeringa de insulina de la jeringa de insulina preinyección D₂O llena. Grabar en 4 decimales.
12. Dentro de los 30 minutos después de la recolección de sangre, utilice una centrífuga hematocrito para girar cada tubo capilar durante 5 min. Si la centrífuga hematocrito permite múltiples velocidades, ajuste a 10.000 x g.
13. Utilice unas tijeras afiladas para cortar el tubo capilar de plástico entre toda la sangre y el plasma. Utilice una pipeta de 200 ml para expulsar el plasma directamente en un tubo de almacenamiento etiquetado de 500 ml.
14. Después del período de equilibrio, recoja otros 100 l de sangre de la vena interfemoral.
    NOTA: El período de equilibrio variará según la especie y si los murciélagos entran en torpor. Para los murciélagos marrones grandes, por lo general 2 h es suficiente para el período de equilibrio.
15. Separe el plasma en un segundo tubo superior de tornillo de microcentrífuga etiquetado de 500 l repitiendo el paso 3.13. Almacene las muestras a -20 oC o más frío hasta su análisis.

4. Análisis de espectrofotometría infrarroja de transformación de Fourier

1. Ajuste la temperatura de un baño de arena a 60 oC para facilitar la destilación (permitir la separación del agua y D₂O de otros componentes sanguíneos).
2. Pipetear 50 l de cada muestra de plasma y estándar en el interior de una tapa de tubo de microcentrífuga cónica de 1,5 ml. Incluyendo normas que contienen concentraciones conocidas de D₂O como control de calidad.
   NOTA: Idealmente cada animal tendrá tres réplicas por muestra y el promedio de las tres réplicas reportadas. Debido al volumen limitado de la muestra y al volumen de muestra requerido para el equipo FT-IR utilizado por los autores, no se realizaron réplicas para las muestras de murciélagos. Si alguna muestra contiene menos de 50 ml de plasma, pipetee la cantidad de la muestra en la tapa del tubo de microcentrífuga cónica y registre el volumen.
3. Mantenga la tapa de microcentrífuga boca abajo y atornille el tubo de microcentrífuga cónico de 1,5 ml en la tapa. Coloque el tubo invertido (al revés) con la tapa en contacto con la arena en el baño de arena durante un mínimo de 12 h (durante la noche).
4. Después de las 12 h, retire la tapa y reemplácela con una tapa nueva y limpia. Pulse el tubo de microcentrífuga durante 10 s en una centrífuga.
5. Crear las siguientes normas: 0 ppm (0 mg D₂O en 1 L de agua destilada), 293 ppm (293 mg D₂O en 1 L de agua destilada), 585 ppm (585 mg D₂O en 1 L de agua destilada), 878 ppm (878 mg D₂O en 1 L de agua destilada) y 1170 ppm D₂O (1170 mg D₂O en 1 L.
   NOTA: Los valores anteriores se sugieren para una curva estándar. Se pueden utilizar valores alternativos como 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, etc.
6. Instale una célula de transmisión líquida en el espectrómetro de espectrofotometría infrarroja de transformación de Fourier (FTIR)(Tabla de materiales). Llene la célula con metanol y conecte el puerto de inyección. Llene lentamente la celda con agua de fondo mientras retira cuidadosamente la jeringa de metanol para reducir el riesgo de burbujas de aire. Conecte el tubo al puerto de salida para permitir la extracción de las muestras posteriores al análisis.
7. Prepare el software del espectrómetro FTIR(Tabla de materiales)para el análisis de D₂O en agua. La configuración de los parámetros para el software del espectrómetro utilizado en este protocolo se enumeran en la Tabla 1.
8. Recoger una muestra de fondo utilizando el diluyente, 0,22 m de agua destilada. Debe ser el mismo agua utilizada para las normas.
9. Inyectar 40 oL de la 0 ppm D₂O y registrar los espectros. Guarde los espectros como un archivo de valores separados por comas (CSV).
10. Continúe inyectando y guarde los espectros de todos los estándares para crear una curva estándar.
11. Repita el fondo y la curva estándar cada 60 a 90 min.
12. Inyectar 40 l de cada muestra destilada en la célula de transmisión líquida y guardar los espectros.
    NOTA: Modificar el volumen de inyección de las normas y las muestras destiladas en función del volumen de la célula de transmisión líquida. Utilice una celda de transmisión líquida de menor volumen si el volumen de la muestra es inferior a 40 ml o diluya 1:1 con agua destilada de fondo.
13. Determinar la concentración de D₂O de cada muestra de los espectros FTIR utilizando un programa de hoja de cálculo como se describe en Jennings et al.¹¹ o el software espectral. Cuando se realizan réplicas, utilice la concentración media para calcular la composición corporal.

5. Cálculo de la composición corporal

1. Convierta el enriquecimiento de deuterio (ppm) a concentración porcentual de átomos para cada muestra utilizando la siguiente ecuación^12:
   
   donde x es el enriquecimiento de deuterio medido (ppm) de la muestra y 0.0001557 es la fracción mole de deuterio reportada en Vienna Standard Mean Ocean Water (VSMOW)¹³.
2. Calcular el agua corporal total para cada muestra utilizando la siguiente ecuación^4,12,14:
   )
   donde E es el enriquecimiento medido (átomo%) dedeuterio en la muestra después de la corrección de fondo, B es la masa de inyección en g, y 0.998 es la concentración de D₂O inyectado.
   NOTA: El intercambio de deuterio con hidrógeno lábil provoca una sobreestimación del 2% de la masa total de agua corporal. El agua corporal total debe corregirse reduciendo la estimación total de la masa de agua corporal en un 2% del peso corporal.
3. Estimar la masa libre de grasa (masa corporal magra y todos los demás componentes no grasos) de cada murciélago utilizando la siguiente ecuación:
   
   NOTA: Utilice el valor convencionalmente aceptado de 0.732 para el contenido de humedad fraccionada de masa corporal magra para murciélagos sanos, euhidratados y no lactantes. El contenido de humedad fraccionada de masa libre de grasa puede cambiar en lactación de grandes marrones basados en la semana¹⁵post-parto. Para otras especies, utilice los valores publicados en la literatura o determine el contenido de humedad fraccionaria de la masa corporal magra antes de realizar cálculos de la masa corporal magra.
4. Calcule la masa grasa corporal utilizando la siguiente ecuación:
   
5. Convierta la masa grasa corporal en g en porcentaje de masa grasa corporal utilizando la siguiente ecuación:
   

6. Determinación de la composición del agua en un carnívoro(Felis catus,gato doméstico)

1. Prepare la solución de stock como se describe en la sección 1.
2. Pesar cada gato hasta los 3 decimales más cercanos y registrar el peso. Calcule la dosis para cada gato como se describe en el paso 3.6 utilizando una dosis de D₂O de 0,70 g/kg.
3. Prepare cada dosis como se describe en los pasos 3.7 a 3.8. utilizando una jeringa de 3 ml o 5 ml con una aguja de 22 G en lugar de una jeringa de insulina.
4. Recoger 500 ml de sangre entera y posteriormente administrar por vía subcutánea los tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 0,7 g/kg D₂O. Centrifuge a 2.000 x g durante 15 min y almacenar el plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis.
5. Recoger 500 l de sangre entera 4 h después de la inyección. Centrifugar sangre entera a 2.000 x g durante 15 min y almacenar plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis.
6. Recoger 500 l de sangre entera 14 días después de la inyección. Centrifugar sangre entera a 2.000 x g durante 15 min y almacenar plasma en tubos superiores de tornillo de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 oC hasta el análisis.
   NOTA: El número de días entre la recolección de sangre puede basarse en las necesidades experimentales y el período posterior a la inyección en el que se puede detectar D₂O por encima de los niveles de fondo. Catorce días fue la longitud de los bloques de tratamiento dietético de Hooper et al.⁹.
7. Realice el análisis FT-IR de acuerdo con la sección 4 y calcule la composición corporal de acuerdo con la sección 5 de este protocolo.
8. Calcule el consumo de agua en ml/día utilizando las siguientes ecuaciones:
   
   
   
   donde TBW es agua corporal total, la inicial D₂O y la d₂O final son las concentraciones medidas en ppm en las muestras de D₂O post-inyección.

Resultados

La técnica de dilución de óxido de deuterio se puede utilizar para evaluar la composición corporal de una variedad de especies. Para demostrar la adaptabilidad, estamos reportando el primer uso de la técnica de dilución de óxido de deuterio en una especie de murciélago insectívoro norteamericano, Eptesicus fuscus, el gran murciélago marrón para resultados representativos. Se completó una meseta de cronometraje tomando muestras de sangre de inyección de 2 O antes y después de D

Discusión

El uso de óxido de deuterio para determinar TBW se ha utilizado desde la década de 1940¹⁷ y se utiliza en los seres humanos y una variedad de especies domésticas y de vida silvestre^4,6,7. Se han desarrollado otras técnicas no destructivas, como el análisis de impedancia bioeléctrica (BIA), DXA y la resonancia magnética cuantitativa (QMR). Cada método tiene ventajas y desventajas que deben tenerse en cuent...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de disco no pirogénico de 0,2 micras	Argos Technologies	FN32S	nylon, 30 mm de diámetro, 0,22 um, estéril
Tubos de microcentrífuga cónicos de 1,5 mL	USA Scientific	1415-9701	Tubo de microcentrífuga autónomo de 1,5 ml, natural con tapa azul
Vial de vidrio estéril de 10 mL para inyección	Mountainside Medical Equipment	MS-SEV10	unidad
Jeringa de 10 mL	Becton Dickinson	305219	estéril Jeringa de 10 mL envuelta individualmente
Frasco de vidrio estéril de 100 mL para inyección	Mountainside Medical Equipment	AL-SV10020	vidrio transparente y estéril unidad de inyección
aguja de calibre 20	Exel	26417	agujas hipodérmica 20g x 1" cubo de plástico (amarillo) / bisel regular
aguja de calibre 22	Exel	26411	agujas hipodérmicas 22g x 1" cubo de plástico (negro) / bisel regular
de deuterio	Sigma-Aldrich	151882-25G	99.9 átomo % D
isofluorano	Vetone	3060	fluriso isoflurano, USP
OMNIC Spectra Software	ThermoFisher Scientific	833-036200	FT-IR software estándar
vaselina		305212311006	Vaselina, vaselina 100% pura, original, protector de la piel
tubos capilares de plástico	Innovative Med Tech	100050	anticoagulante de heparina sódica, 50 μ Capacidad L, 30 mm
de longitud Espectrofotómetro de líquido sellado SL-3 FTIR CAF2 Cell	International Crystal Laboratory	0005D-875	0,05 mm Longitud de paso
cloruro de sodio	EMD Millipore	1.37017	adecuado para la producción biofarmacéutica
Espectrómetro Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR	ThermoFisher Scientific	269-169400	modelo descatalogado, modelos más nuevos disponibles