Las imágenes espectrales se han convertido en una solución fiable para la identificación y separación de múltiples señales de fluorescencia en una sola muestra y pueden distinguir fácilmente las señales de interés del fondo o la autofluorescencia. Las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación mejoran esta técnica al reducir el tiempo de adquisición de imagen necesario y, al mismo tiempo, aumentar la relación señal-ruido.
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Artículo de método
Microscopía de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación para discriminar eficientemente las señales de fluorescencia
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Resumen
Resumen
Varias técnicas se basan en la detección de señales de fluorescencia para identificar o estudiar fenómenos o para dilucidar funciones. La separación de estas señales de fluorescencia se demostró engorrosa hasta el advenimiento de imágenes hiperespectrales, en las que las fuentes de fluorescencia pueden separarse entre sí, así como de las señales de fondo y la autofluorescencia (dado el conocimiento de su firmas). Sin embargo, las imágenes hiperespectrales tradicionales de escaneo de emisiones sufren de tiempos de adquisición lentos y bajas relaciones señal-ruido debido al filtrado necesario de excitación y luz de emisión. Se ha demostrado anteriormente que las imágenes hiperespectrales de análisis de excitación reducen el tiempo de adquisición necesario y al mismo tiempo aumentan la relación señal-ruido de los datos adquiridos. Utilizando equipos disponibles comercialmente, este protocolo describe cómo ensamblar, calibrar y utilizar un sistema de microscopía de imágenes hiperespectrales de escaneo de excitación para la separación de señales de varias fuentes de fluorescencia en una sola muestra. Si bien es muy aplicable a las imágenes microscópicas de células y tejidos, esta técnica también puede ser útil para cualquier tipo de experimento que utilice fluorescencia en la que es posible variar las longitudes de onda de excitación, incluyendo pero no limitado a: imágenes químicas, aplicaciones ambientales, el cuidado de los ojos, la ciencia de los alimentos, la ciencia forense, la ciencia médica y la mineralogía.
Introducción
Las imágenes espectrales se pueden realizar de diversas maneras y se hace referencia a varios términos1,2,3,4. En general, las imágenes espectrales se refieren a datos adquiridos en al menos dos dimensiones espaciales y una dimensión espectral. Las imágenes multiespectrales e hiperespectrales se distinguen con mayor frecuencia por el número de bandas de longitud de onda o si las bandas espectrales son contiguas1. Para esta aplicación, los datos hiperespectrales se definen como datos espectrales adquiridos con bandas d....
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Protocolo
1. Configuración del dispositivo
- Fuente de luz: seleccione una fuente de luz espectral de banda ancha con salida de alta potencia y alta colimación (se utilizó una lámpara de arco Xe de 300 W para estos estudios).
- Obturador (opcional): añada un obturador a la trayectoria óptica para reducir el fotoblanqueo de imágenes de lapso de tiempo.
- Sistema de filtro ajustable: incorpore un conjunto de ajuste mecánico y un filtro ajustable de película delgada (TFTF) configurado para habilitar el rango de excitación ajustable en longitud de onda deseado (por ejemplo, 360-485 nm).
- Microscopio: utilice un microscopio de fluorescencia invertido....
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Resultados
Varios pasos importantes de este protocolo son necesarios para garantizar la recopilación de datos que son precisos y carentes de imágenes y artefactos espectrales. Omitir estos pasos puede dar lugar a datos que parezcan significativos pero que no puedan ser verificados o reproducidos con cualquier otro sistema de imágenes espectrales, anulando así efectivamente cualquier conclusión hecha con dichos datos. El principal de estos pasos importantes es la corrección de salida espectral adecua.......
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Discusión
El uso óptimo de una configuración de imágenes hiperespectrales de análisis de excitación comienza con la construcción de la trayectoria de luz. En particular, la elección de la fuente de luz, los filtros (ajustables y dicoicos), el método de conmutación de filtros y la cámara determinan el rango espectral disponible, la posible velocidad de escaneo, la sensibilidad del detector y el muestreo espacial. Las lámparas de arco de mercurio ofrecen muchos picos de longitud de onda de excitación, pero no proporcionan una salida.......
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Divulgaciones
Los doctores Leavesley y Rich revelan interés financiero en una empresa emergente, SpectraCyte LLC, fundada para comercializar la tecnología de imágenes espectrales.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer el apoyo de NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, y el Fondo de Investigación de Cáncer.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células musculares lisas de las vías respiratorias | Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (NDRI) | Aislados de tejidos pulmonares humanos obtenidos de NDRI | Células altamente autofluorescentes y sensibles al calcio |
| Obturador automatizado | Thorlabs Inc. | SHB1 | Obturador controlable a distancia para minimizar el fotoblanqueo |
| Etapa automatizada | H177P1T4 | Etapa controlable a distancia para la recopilación automatizada de múltiples campos de visión o imágenes unidas. | |
| Controlador de etapa automatizado (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | Para la interfaz de la etapa automatizada con el ordenador y el joystick |
| Búfer | De fabricación propia | 145 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 20 mM de HEPES, 10 mM de D-glucosa, 1 mM de MgCl2 y 1 mM de CaCl2, a pH 7,3 | |
| celdas | ThermoFisher Scientific | Attofluor A7816 | Soporte de cubreobjetos compuesto de acero inoxidable quirúrgico y una junta tórica de goma para sellar el medio y evitar la contaminación de la muestra y/o del objetivo |
| Filtros de excitación | Semrock Inc. | TBP01-378/16 Rango de longitud de | onda central (340-378 nm), Ancho de banda (mínimo 16 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 Rango de longitud de | onda central (360-400 nm), Ancho de banda (mínimo 16 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 Rango de longitud de | onda central (400-448,8 nm), Ancho de banda (mínimo 15 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 Rango de longitud de | onda central (448,8-501,5 nm), Ancho de banda (mínimo 15 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 Rango de longitud de | onda central (501,5-561 nm), Ancho de banda (mínimo 14 nm, FWHM nominal 20 nm), Índice de refracción (1,83) | |
| Cubo de filtro de fluorescencia Dichroico Divisor de haz | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separa la excitación y la luz de emisión a 495 nm (>98% de reflexión entre 350-488 nm, >93% de transmisión entre 502-950 nm), Índice efectivo del filtro (1.78) |
| Filtro de fluorescencia Cubo de filtro de paso largo | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Permite el paso de luz a más de 496 nm (>93% de transmisión promedio entre 503.2-1100 nm), Índice de refracción (1.86) |
| Sonda GCaMP | Addgene | G-CaMP3; Plásmido #22692 | Un indicador de calcio codificado genéticamente basado en GCaMP2 de longitud de onda |
| única Esfera integradora Ocean Optics | FOIS-1 | Se utiliza para la medición precisa de la iluminación de gran angular | |
| Microscopio de fluorescencia invertida | Nikon Instruments | TE2000 | microscopios invertidos permiten la excitación directa de la muestra sin necesidad de penetrar capas de medios y/o tejidos. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Etiquetas mitocondrias |
| Lámpara de calibración trazable al NIST | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | Una lámpara con un espectro conocido para su uso como fluoresceína |
| trazable al NIST | estándar ThermoFisher Scientific | F36915 | Para verificar la respuesta espectral adecuada del sistema |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Etiquetas núcleos celulares |
| Objetivo (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Útil para grandes campos de visión |
| Objetivo (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Más utilizado para muestras de tejido |
| Objetivo (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Se utiliza con mayor frecuencia para muestras de células |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | Para adquirir imágenes digitales de alta sensibilidad |
| Espectrómetro | Ocean Optics | QE65000 | Se utiliza para medir la salida espectral del sistema espectral de excitación-barrido |
| Cambiador de filtro sintonizable | Instrumento Sutter Lambda | VF-5 | Unidad motorizada para el ajuste automatizado del filtro de excitación/ |
| Lámpara de arco de xenón | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Fuente | de luz Fuente de luz con salida espectral relativamente uniforme |
Referencias
- Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
- Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements an....
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Reimpresiones y permisos
