Presentamos un protocolo para un ensayo colorimétrico de la actividad citrato sintasa para la cuantificación de la masa mitocondrial intacta en el tejido Drosophila homogeneatos.
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Artículo de método
Un ensayo colorimétrico de la actividad de citrato sintasa en Drosophila Melanogaster
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Resumen
Resumen
Las mitocondrias desempeñan el papel más prominente en el metabolismo celular mediante la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa y la regulación de una variedad de procesos fisiológicos. La disfunción mitocondrial es una causa primaria de una serie de enfermedades metabólicas y neurodegenerativas. Las mitocondrias intactas son fundamentales para su correcto funcionamiento. La enzima citrato sintasa se localiza en la matriz mitocondrial y por lo tanto se puede utilizar como un marcador de enzima cuantitativa de la masa mitocondrial intacta. Dado que muchas moléculas y vías que tienen funciones importantes en las mitocondrias están altamente conservadas entre los seres humanos y Drosophila,y que una serie de potentes herramientas genéticas están disponibles en Drosophila, Drosophila sirve como un buen sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para la medición rápida y sencilla de la actividad citrato sintasa en el tejido homogeneizado de moscas adultas sin aislar las mitocondrias. Este protocolo también es adecuado para medir la actividad de la citrato sintasa en larvas, células cultivadas y tejidos de mamíferos.
Introducción
Las mitocondrias son más conocidas como los orgánulos que producen energía en la mayoría de los organismos eucariotas, que producen la moneda energética, ATP, a través del ciclo del ácido tricarboxílico (es decir, ciclo Krebs) y fosforilación oxidativa. Mitocondrias también se encuentran para desempeñar un papel importante en una gran cantidad de otros procesos fisiológicos, tales como la regulación de la apoptosis1, Ca2 + homeostasis2,3, especies de oxidación reactiva (ROS) generación4, y retículo endoplasmático (ER)-respuesta de estrés5. La disfunción mitocondrial puede afectar a cualquier órgano del cuerpo a cualquier edad y es una causa primaria de enfermedadmeólica, relacionada con el envejecimiento6,y enfermedades neurodegenerativas7. Las mitocondrias intactas están relacionadas mecanicísticamente con la función mitocondrial. Por lo tanto, la cuantificación adecuada de la masa mitocondrial intacta es muy importante para evaluar la función mitocondrial8. Citrato sintasa, una enzima limitante de velocidad en el primer paso del ciclo de ácido tricarboxílico9, se localiza en la matriz mitocondrial dentro de las células eucariotas, y por lo tanto se puede utilizar como un marcador cuantitativo para la presencia de masa mitocondrial intacta9,10. La actividad de la citrato sintasa también se puede utilizar como factor de normalización para las proteínas mitocondriales intactas11,12.
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un excelente sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial, ya que muchas moléculas y vías que desempeñan papeles fundamentales en las mitocondrias se conservan evolutivamente desde Drosophila a los seres humanos13,14,15. Aquí, presentamos un protocolo para un método rápido y simple para la medición de la actividad citrato sintasa mediante un ensayo colorimétrico en tejido Drosophila homogeneiza16 en un formato de placa de 96 pozos. En el ensayo de actividad de citrato sintasa, citrato sintasa en el tejido drosofílico homogeneizado cataliza la reacción de oxaloacetato con acetil coenzima A (acetil CoA) para formar el citrato CoA-SH y H+. CoA-SH reacciona posteriormente con 5,5'-dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para generar un producto de color, 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB), que se puede medir fácilmente espectrofotométricamente a 412 nm. La actividad de la citrato sintasa puede reflejarse en la tasa de producción de color.
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Protocolo
1. Ensayo de actividad de citrato colorimétrico de la síntesis para D. melanogaster16
- Recoger diez moscas adultas para cada muestra. Recoger al menos muestras triplicadas para cada genotipo.
- Preparar 500 ml de tampón de extracción en frío-hielo que contenga 20 mM de HEPES (pH a 7,2), EDTA de 1 mM y trífino X-100 del 0,1% en un tubo de ensayo de 1,5 ml para cada muestra.
- Anestetiza las moscas adultas conCO2 en una almohadilla de anestesia y aísla los tejidos deseados. Para aislar los thoraxes de mosca adultos, por ejemplo, fijar los thoraxes de mosca por un par de fórceps, y luego aislar los abdomens de la mosca cortando a lo largo del borde del tórax y el abdomen usando un par de tijeras. Recoger los thoraxes mosca para el ensayo de actividad de citrato muscular sintasa.
NOTA: Determine el peso fresco del tejido en este paso si lo usa para normalizar la actividad de citrato sintasa. - Transfiera inmediatamente 10 thoraxes de mosca adultas a 100 ml de tampón de extracción en frío y homogeneice con un pestillo sobre hielo. Para mantener las muestras heladas, homogeneizar las muestras durante 5-10 s en hielo, luego hacer que las muestras se senten en hielo durante 5 s, y repetir hasta que todos los tejidos en el tubo se homogeneizan por completo.
NOTA: Tape el tubo, compruebe los homogeneizados para asegurarse de que no hay coágulos en los homogeneizados y que los tejidos del tubo estén completamente homogeneizados. Todos los tratamientos de muestras deben realizarse sobre hielo. - Tomar 10 ml de cada muestra homogeneizada en un tubo nuevo para la medición del contenido proteico. Mantenga las muestras para la medición de proteínas en hielo.
NOTA: Las muestras de proteínas se pueden congelar y almacenar a -80 oC para su posterior análisis. Las concentraciones de proteínas sirven como parámetro interno para la normalización de las actividades de citrato sintasa. - Añadir 400 l de tampón de extracción de hielo-frío a cada muestra restante para hacer un volumen total de 500 l. Mezclar bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 5 veces, evitando la formación de burbujas. Para cada reacción, añadir 1 l de lisato de célula sin diluir a 150 l de la solución de reacción recién preparada (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 mM de DTNB, 0,3 mM de acetil CoA, ácido oxaloacético de 1 mM). Mezcle bien e inmediatamente pipeteando suavemente, evitando la formación de burbujas. Mida la absorbancia a 412 nm cada 10-30 s durante 4 min a 25 oC utilizando un lector de placas capaz de medir la absorbancia a 412 nm a intervalos mínimos de 10 s.
NOTA: Cambie la punta antes de pipetear un reactivo diferente y evite formar burbujas en los pozos. La mezcla incompleta de los reactivos puede causar variaciones en las mediciones. El ensayo de actividad de citrato sintasa debe realizarse a temperatura ambiente inmediatamente después de que se recojan las muestras, ya que este ensayo se utiliza para cuantificar la masa mitocondrial intacta. El búfer de reacción debe prepararse inmediatamente antes de su uso y no debe almacenarse. - Trazar datos como absorbancia de densidad óptica (Abs) (eje Y) frente al tiempo (en minutos) (eje X). A continuación, calcule la pendiente de la parte lineal de la curva, donde la tasa de reacción es
Divida el valor por la concentración de proteína de la muestra para normalizar la actividad de la citrato sintasa. La actividad citrato sintasa se calcula como
NOTA: La concentración de proteínas de la muestra se puede medir mediante un kit de ensayo de concentración de proteínas.
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Resultados
La Figura 1 presenta un ejemplo de las curvas cinéticas para la absorbancia de la OD a 412 nm con el tiempo obtenidas utilizando el ensayo colorimétrico de actividad citrato sintasa para medir los homogeneios del tejido del tórax Drosophila de diferentes genotipos. Es bien sabido que el PGC-1 es un regulador maestro de la biogénesis mitocondrial. El PGC-1se conserva funcionalmente entre Drosophila y los humanos. Drosophila El RNF34 ...
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Discusión
Los estudios metabólicos utilizando Drosophila como modelo deben tener en cuenta los antecedentes genéticos, la dieta y el mantenimiento de las acciones de las moscas18. Para evitar los efectos de diferentes fondos genéticos en la medición de la actividad citrato sintasa, diferentes cepas de Drosophila deben ser retrocruzadas a la cepa de control durante 10 generaciones. El trasfondo genético de todas las cepas Drosophila utilizadas en nuestros experimentos es w...
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31401013 y 31471010), la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái, el Programa Pujiang de Shanghái (14PJ1405900), y la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (19ZR1446400).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]etanosulfónico (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol (base TRIZMA) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| acetil-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Ácido ditio-bis-nitrobenzoico (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetato | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Mortero de pellets | Sangon | F619072 | |
| Motor de mortaja de pellets | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Lector de placas | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Kit de ensayo | Beyotime | P0010S | |
| Tijeras | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Referencias
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984(2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
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Reimpresiones y permisos
