Artículo de método

Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de Disparos

DOI:

10.3791/59471

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9 de mayo de 2019

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1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

En este artículo

Resumen

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Un protocolo se presenta utilizando técnicas de biología sintética para sintetizar un conjunto de biosensores bacterianos para el análisis de residuos de disparos, y para probar el funcionamiento de los dispositivos para su uso previsto utilizando espectroscopía de fluorescencia.

Resumen

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MicRoboCop es un biosensor que ha sido diseñado para una aplicación única en la química forense. MicRoboCop es un sistema formado por tres dispositivos que, cuando se usan juntos, pueden indicar la presencia de residuos de disparos (GSR) produciendo una señal de fluorescencia en presencia de tres analitos clave (antimonio, plomo y componentes orgánicos de GSR). El protocolo describe la síntesis de los biosensores utilizando Escherichia coli (e. coli), y los métodos de química analítica utilizados para evaluar la selectividad y sensibilidad de los sensores. El funcionamiento del sistema se demuestra mediante el uso de GSR recogido desde el interior de una carcasa de cartucho gastado. Una vez preparados, los biosensores se pueden almacenar hasta que se necesiten y se pueden utilizar como prueba para estos analitos clave. Una respuesta positiva de los tres analitos proporciona una prueba positiva presuntiva para la GSR, mientras que cada dispositivo individual tiene aplicaciones para detectar los analitos en otras muestras (p. ej., un detector de contaminación por plomo en el agua potable). La principal limitación del sistema es el tiempo necesario para una señal positiva; trabajo futuro puede implicar el estudio de diferentes organismos para optimizar el tiempo de respuesta.

Introducción

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Un biosensor es cualquier dispositivo analítico que utiliza componentes biológicos (como proteínas, ácidos nucleicos o organismos enteros) que producen una respuesta que se puede utilizar para la detección de una sustancia química o un analito. Como ejemplo, la industria minera de carbón utilizó un biosensor durante gran parte del siglo 20 para detectar la presencia de gases tóxicos de la mina: el canario en la mina de carbón1. Los mineros observaron la respuesta del organismo biológico (muerte o angustia) a un analito químico (monóxido de carbono) con el fin de proteger a los trabajadores. En un ejemplo más moderno y sofisticado, la....

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Protocolo

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Nota: se presenta la síntesis de E. coli expresando RFP.

1. preparación del ADN plásmido de E. coli

  1. Descongelar e. coli conteniendo un plásmido con un gen RFP y un gen de resistencia a la ampicilina y cultivar las placas de agar e. coli en el caldo Luria (LB) que contienen 100 μg/ml de ampicilina a 37 ° c durante 24 h. Por ejemplo, utilice el plásmido J10060 del registro de las piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de materiales). El plásmido J10060 incluye un gen para RFP (proteína fluorescente roja) bajo el control de una región promotora ....

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Resultados

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Los espectros de fluorescencia para la variante RFP utilizada en este trabajo se muestran en la figura 2. Estos datos provienen del dispositivo PbRFP, ya que responde al plomo y al dispositivo TNT-RFP, ya que responde a dos analitos, 2, 4-DNT y 1, 3-DNB. Esta figura muestra el espectro de un control negativo (sin analito añadido) y los espectros en dos niveles diferentes de analito añadidos. La señal de fluorescencia máxima para la variante de RFP utilizada se observó en .......

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Discusión

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Las modificaciones y la solución de problemas

El experimento descrito en el cuadro 4 se puede modificar de cualquier manera adecuado a los sensores que se han diseñado. El aspecto más importante de un sensor químico es evaluar su sensibilidad y especificidad. Es beneficioso asegurarse de que se analice una amplia gama de concentraciones del analito para determinar el rango analítico útil del sensor. También vale la pena determinar un nivel máximo de analito pa.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen intereses financieros competidores u otros conflictos de interés para revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean reconocer a los estudiantes de la Universidad de Longwood en BIOL 324 (genética) y los estudiantes en CHEM 403 (solución avanzada de problemas de laboratorio químico) que estuvieron involucrados en la preparación inicial y pruebas de los biosensores de antimonio y plomo. La idea para MicRoboCop fue concebida en el taller GCAT SynBIO (verano 2014), financiado por NSF y el Howard Hughes Medical Institute y organizado por la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore. Los autores también reconocen la financiación recibida de la escuela de Artes y Ciencias Cook-Cole de la Universidad de Longwood y la beca GCAT SynBio Alumni.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,3-dinitrobenceno, 97%AldrichD194255-25G
2,4-dinitrotolueno, 97%Aldrich101397-5G
AgarFisher ScientificBP1423-500
AmpicilinaFisher ScientificBP1760-5
Antimonio, solución estándar de referencia (1000ppm ± 1%/Certificado)Fisher ScientificSA450-100Estándar en HNO3
diluido TampónEngland BioLabsB7204S
Tampón dúplexTecnologías de ADN integradas11-01-03-00
Enzima de restricción EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
Etanol, grado HPLC, desnaturalizadoAcros OrganicsAC611050040No es necesario que los solventes sean de grado HPLC, ACS o grado reactivo funcionarán.
Eurofins Genomics SimpleSeq Kits de secuenciación de ADNEurofins GenomicsSimpleSeq Kit Standard
Forward para PCR de coloniasTecnologías de ADN integradas5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'
Imprimación directa para la secuenciación de ADNIntegrated DNA Technologies5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
Minikit de plásmido de alta velocidad IBI Sciencede IB47101IBI Scientific
,Fisher ScientificBP1426-500
Lead, solución estándar de referencia (1000ppm ± 1%/Certificado)Fisher ScientificSL21-100HNO3
LeadOffdiluidas Hygenall45NRCNVendida en botes o envuelta individualmente, cualquier toallita a base de alcohol funcionará.
Metanol, grado HPLCFisher ScientificA452-4no necesitan ser de grado HPLC, ACS o grado reactivo funcionarán.
NEB 5-alfa Competente E. coli célulasNew England BioLabsC2987I
NheI-HF Enzima de restricciónEngland BioLabsR3131S
Agua libre de nucleasaNew England BioLabsB1500S
OneTaq 2X Master Mix con tampón estándarNew England BioLabsM0482S
Plásmidos del registro de partes biológicas estándar utilizadas para biología sintéticaRegistro de parteshttp://parts.igem.org/Main_Page
secuencias promotoras Tecnologíasintegradas de ADNPromotor Sb: 5'-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5'
Promotor de Pb: 5'-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGCG
AGCTAGCGCAT-3'
3'-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCACA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC
GTA-5'
Promotor TNT: 5' GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACAACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3'
3' CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5'
Imprimación inversa para PCR de coloniasIntegrated DNA Technologies5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'
Imprimación inversa para secuenciación de ADNIntegrated DNA Technologies5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'
ADN ligasa T4 NuevaInglaterra BioLabsM0202S
inteligente de corte New Caldo LB de Miller Standard en toallitas desechables de limpieza y descontaminación Los solventes New biológicas estándar

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
  2. The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
  3. Roda, A., et al.

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