Preparación y aplicación de un nuevo biosensor bacteriano para la detección presuntiva de residuos de Disparos

Resumen

Un protocolo se presenta utilizando técnicas de biología sintética para sintetizar un conjunto de biosensores bacterianos para el análisis de residuos de disparos, y para probar el funcionamiento de los dispositivos para su uso previsto utilizando espectroscopía de fluorescencia.

Resumen

MicRoboCop es un biosensor que ha sido diseñado para una aplicación única en la química forense. MicRoboCop es un sistema formado por tres dispositivos que, cuando se usan juntos, pueden indicar la presencia de residuos de disparos (GSR) produciendo una señal de fluorescencia en presencia de tres analitos clave (antimonio, plomo y componentes orgánicos de GSR). El protocolo describe la síntesis de los biosensores utilizando Escherichia coli (e. coli), y los métodos de química analítica utilizados para evaluar la selectividad y sensibilidad de los sensores. El funcionamiento del sistema se demuestra mediante el uso de GSR recogido desde el interior de una carcasa de cartucho gastado. Una vez preparados, los biosensores se pueden almacenar hasta que se necesiten y se pueden utilizar como prueba para estos analitos clave. Una respuesta positiva de los tres analitos proporciona una prueba positiva presuntiva para la GSR, mientras que cada dispositivo individual tiene aplicaciones para detectar los analitos en otras muestras (p. ej., un detector de contaminación por plomo en el agua potable). La principal limitación del sistema es el tiempo necesario para una señal positiva; trabajo futuro puede implicar el estudio de diferentes organismos para optimizar el tiempo de respuesta.

Introducción

Un biosensor es cualquier dispositivo analítico que utiliza componentes biológicos (como proteínas, ácidos nucleicos o organismos enteros) que producen una respuesta que se puede utilizar para la detección de una sustancia química o un analito. Como ejemplo, la industria minera de carbón utilizó un biosensor durante gran parte del siglo 20 para detectar la presencia de gases tóxicos de la mina: el canario en la mina de carbón¹. Los mineros observaron la respuesta del organismo biológico (muerte o angustia) a un analito químico (monóxido de carbono) con el fin de proteger a los trabajadores. En un ejemplo más moderno y sofisticado, las bacterias se pueden alterar utilizando técnicas de biología sintética para responder a la presencia de un determinado analito químico mediante la exposición de una respuesta específica, como la expresión de una proteína fluorescente.

La biología sintética es un término amplio que se refiere a la construcción de dispositivos biológicos y sistemas que no existen de forma natural, o el re-diseño de los sistemas biológicos existentes para un propósito específico². La biología sintética se distingue de la ingeniería genética por una metodología estándar y la existencia de piezas estandarizadas (elementos genéticos de biología sintética estándar) que se pueden utilizar para sintetizar dispositivos y sistemas. Una parte se introduce en el genoma de un dispositivo, un organismo como una bacteria, para expresar un cierto rasgo que servirá como una indicación de la función. Por ejemplo, en muchos dispositivos sintéticos, la expresión de una proteína fluorescente se introduce en un organismo unicelado como una proteína reportera. Se pueden combinar varios dispositivos en un sistema. Los genomas de microorganismos como las bacterias son fáciles de manipular de esta manera. Se han notificado numerosos ejemplos de biosensores específicos de una amplia gama de analitos químicos en la bibliografía de la última década^3,4.

En este trabajo, el sistema MicRoboCop se presenta como un ejemplo de un biosensor diseñado utilizando técnicas de biología sintética con nuevas aplicaciones en la química forense y ambiental. MicRoboCop es un sistema de tres dispositivos separados que, cuando se combinan, permitirán a Escherichia coli expresar proteína fluorescente roja (RFP) en presencia de residuos de disparos (GSR) que se han recogido de las manos o de la superficie de una persona. Cada uno de los tres dispositivos responde a un analito químico específico que se sabe que es un componente de GSR⁵. Los tres analitos a los que responde el sistema son I. 2, 4, 6-trinitrotolueno (TNT) y compuestos relacionados, II. plomo (en forma de iones de plomo), y III. Antimonio (también en forma de iones).

GSR consiste en muchas sustancias químicas diferentes, pero los tres generalmente utilizados para identificar un residuo como GSR son bario, plomo, y antimonio⁵. La prueba probatoria estándar para la identificación de GSR es utilizar microscopía electrónica de barrido (SEM) con fluorescencia de rayos X de dispersión de energía (EDX)⁵. SEM-EDX permite a los analistas identificar la morfología única y los componentes elementales de GSR. En la actualidad, hay pocas pruebas presuntivas binarias ampliamente utilizadas disponibles. Una prueba presuntiva recientemente publicada utiliza espectroscopía de movilidad iónica (IMS), que es un equipo especializado que podría no estar disponible en muchos laboratorios⁶. También hay algunas pruebas de color "spot" que se pueden utilizar, aunque se utilizan típicamente para la determinación de la distancia o para la identificación GSR en los agujeros de la bala y las heridas⁵. Adicionalmente, ha habido cierta atención limitada en la literatura a las pruebas electroquímicas para GSR que emplean el análisis voltamométrico, que tiene la ventaja de ser potencialmente portable en el campo, o voltametría de desmonte anódico, que es un extremadamente método sensible para los elementos metálicos⁷. Hay muy poca mención en la literatura de biosensores diseñados específicamente con el propósito de detectar GSR, aunque algunos biosensores para otras aplicaciones forenses han sido publicados⁸.

Los elementos biológicos para cada dispositivo en el sistema MicRoboCop, y la construcción del plásmido, se ilustran en la figura 1. La flecha curvada en la figura 1B representa la región promotora que se activa en presencia del analito, el óvalo es el sitio de Unión ribosomal que permite la traducción de la proteína reportera, la caja gris ETIQUETADA como RFP es el gen que expresa el rojo proteína fluorescente, y el octágono rojo es el sitio de terminación de la transcripción. Los tres dispositivos se utilizarán juntos como un sistema para detectar GSR. Cada dispositivo con un promotor específico (SbRFP, PbRFP y TNT-RFP) será incubado con la muestra que se está probando y se medirá la fluorescencia de RFP. La RFP solo se expresará si el analito químico adecuado está presente y activa la región promotora. Tres dispositivos que responden a algunas de las sustancias químicas presentes en GSR han sido diseñados y se presentan en este trabajo.

Los promotores utilizados en los tres dispositivos de microbocop son un promotor sensible al arsénico y antimonio, sbrfp^9,10, un promotor sensible al plomo, pbrfp^11,12 y un promotor sensible de TNT, TNT-RFP ¹³. debido a que una búsqueda en la literatura no reveló ningún promotor diseñado para responder a Barium, el promotor de TNT fue seleccionado en su lugar ya que este promotor es sensible a una serie de compuestos estructuralmente relacionados (en particular, 2, 4-dinitrotolueno y dinitrobenceno) que son conocidos por ser una parte de los compuestos orgánicos dejados atrás en GSR. Este promotor se ha utilizado con éxito para detectar específicamente cantidades minutas de TNT y 2, 4-dinitrotolueno (2, 4-DNT) en las minas terrestres enterradas¹³. Utilizando los tres dispositivos juntos como un sistema, una prueba positiva para GSR producirá fluorescencia en los tres dispositivos. Una señal de fluorescencia en sólo uno o dos dispositivos indicará otra fuente ambiental del analito (s) o en el caso del promotor de TNT, activación por un compuesto que no es un compuesto orgánico dejado atrás en GSR. Mediante el uso de los tres dispositivos juntos, se minimiza la posibilidad de resultados falsos positivos debido a las fuentes ambientales. La munición sin plomo, que está ganando popularidad, todavía representa sólo el 5% de las ventas de municiones en los Estados Unidos; por lo tanto, los resultados falsos negativos debido a la ausencia de plomo pueden ser una posibilidad, pero todavía hay utilidad en un sensor que utiliza plomo como marcador para GSR¹⁴. Además de esta aplicación forense específica, cada dispositivo se puede utilizar por separado con el fin de detectar contaminantes ambientales.

Los protocolos presentados incluyen las técnicas de biología sintética utilizadas para crear los dispositivos (bacterias del sensor) y las técnicas analíticas para comprobar la función de los dispositivos y analizar las señales de fluorescencia obtenidas. El protocolo también incluye la recolección de evidencia forense en forma de limpieza de manos para recoger GSR de las agujas de un sospechoso o hisopado para recoger GSR de una superficie. Los resultados del dispositivo del sensor de plomo se presentan como resultados de ejemplo, junto con una demostración de una prueba positiva para GSR utilizando una carcasa de cartucho gastado.

Protocolo

Nota: se presenta la síntesis de E. coli expresando RFP.

1. preparación del ADN plásmido de E. coli

1. Descongelar e. coli conteniendo un plásmido con un gen RFP y un gen de resistencia a la ampicilina y cultivar las placas de agar e. coli en el caldo Luria (LB) que contienen 100 μg/ml de ampicilina a 37 ° c durante 24 h. Por ejemplo, utilice el plásmido J10060 del registro de las piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de materiales). El plásmido J10060 incluye un gen para RFP (proteína fluorescente roja) bajo el control de una región promotora de pBad y un gen de resistencia a la ampicilina. Alternativamente, transforme E. coli (consulte el paso 3,2) con el plásmido antes del crecimiento en las placas de agar lb.
2. Siga un protocolo estándar de qiagenminiprep (consulte la tabla de materiales) para aislar el ADN de 1 ml de una cultura de E. coli que contenga el plásmido J10060. El propósito del siguiente protocolo es quitar el promotor pBad y reemplazarlo con el promotor deseado para el dispositivo.
3. Después del plásmido Miniprep, almacene el ADN en el congelador hasta que esté listo para la digestión.

2. digestión de enzimas de restricción

1. Establecer la siguiente reacción en un tubo de microcentrífuga para la digestión EcoRI y NheI: 10 μL de ADN plásmido J10060 (aislado en el paso 1), 8 μL de agua y 1 μL de enzimas EcoRI y NheI premezcladas con 1 μL de tampón (ver tabla de materiales).
2. Para el ADN promotor, establecer la siguiente reacción en un tubo de microcentrífuga para la digestión EcoRI y NheI: 10 μL de secuencias de ADN promotor recocido (8 μL de agua, y 1 μL cada una de las enzimas EcoRI y NheI pre-mezclado con 1 μL de tampón.
   1. Para SB-, PB-, o TNT-RFP (ver tabla de materiales), disolver los oligonucleótidos en buffer (30 mm HEPES, pH 7,5; 100 mm acetato de potasio), incubar en concentraciones molar iguales, calentar a 94 ° c durante 2 min, y enfriar gradualmente a temperatura ambiente).
3. Mezcle las muestras pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con el conjunto de pipetas a 10 μL.
4. Incubar durante 30 min a 37 ° c.
5. El calor inactiva las enzimas a 80 ° c durante 5 min.
6. Almacene el ADN digerido en el congelador hasta que esté listo para el siguiente paso.

3. ligadura y transformación

1. Ligadura
   1. Utilizando el plásmido y el ADN promotor que fueron digeridos doble con EcoRI y NheI en el paso 2, configurar la mezcla de reacción mostrada en la tabla 1 en un tubo de microcentrífuga sobre hielo; Agregue la ligasa de ADN T4 por última vez.
      Nota: la tabla 1 muestra una ligadura utilizando una relación molar de vector 1:3 para insertar para los tamaños de ADN indicados.
   2. Mezcle suavemente la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo y microcentrífuga brevemente.
   3. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
   4. Inactivar el calor a 65 ° c durante 10 min.
2. Transformación
   1. Descongelar un tubo con 20 μL de células de E. coli competentes de Dh5-Alpha en hielo hasta que desaparezcan los últimos cristales de hielo.
   2. Añadir 5 μL de ADN plásmido a la mezcla celular. Deslice cuidadosamente el tubo 4-5 veces para mezclar las células y el ADN.
   3. Coloque la mezcla sobre hielo durante 2 min.
   4. Choque térmico a exactamente 42 ° c por exactamente 30 s. No mezclar.
   5. Colocar sobre hielo durante 2 min. No mezclar.
   6. Pipetear 380 μL de temperatura ambiente SOC en la mezcla. Inmediatamente se extendió sobre una placa de agar LB que contiene ampicilina (100 μg/mL) e incubar durante la noche a 37 ° c.
   7. Compruebe las placas dentro de las 24 h para el crecimiento.
   8. Selle las placas con una película de sellado y guárdela en el refrigerador hasta que esté lista para el siguiente paso.

4. PCR de colonias

1. Añadir a un tubo PCR (configurar 4 tubos de reacción) las mezclas de reacción que se muestran en la tabla 2.
2. Mezcle suavemente las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
3. Utilizando una punta de pipetas amarilla, raspe una colonia (o región muy pequeña) de la E. colitransformada. Transfiera un barrido de este E. coli a una nueva placa lb/ampicilina/agar que se haya seccionado y, a continuación, inserte la punta de la Piera en el tubo de PCR. Agitar la punta de la Piera para mezclar la E. coli con la mezcla de PCR. Repita tres veces más para las colonias adicionales. Transfiera los tubos de PCR a una máquina de PCR y comience a termociclando utilizando el programa que se muestra en la tabla 3.
4. Ejecutar electroforesis en gel utilizando un gel de agarosa al 2% en TAE para determinar qué colonias tienen la mejor ligadura en el plásmido y cultivar esas colonias en una placa nueva.
5. Almacene las placas en el refrigerador hasta que estén listas para la prueba. Prepare un cultivo líquido en el caldo Luria con 100 μg/mL de ampicilina añadido para las pruebas químicas.

5. secuenciación de ADN

1. Para cada muestra, añadir 5 μL de plásmido, 4 μL de la imprimación de secuenciación y 3 μL de agua desionizada.
2. Coloque esta mezcla en un tubo y envíelo para la secuenciación de ADN (ver tabla de materiales).
3. Analice los datos de la secuencia de ADN para comparar las secuencias de ADN esperadas y observadas utilizando el software de análisis de secuencias de ADN para asegurar que no haya mutación y que los genes se insertaron correctamente.
   Nota: a continuación se presenta el uso de E. coli como sensor químico.

6. preparación de cultivos de E. coli

1. Preparar LB con 100 μg/mL de ampicilina para cultivos líquidos.
2. Preparar cultivos líquidos de las bacterias del sensor, el control positivo * bacterias y el control negativo * * bacterias.
   Nota: * bacterias de control positivo: E. coli que contiene un plásmido con el gen RFP bajo el control de un promotor constitutivo; en este trabajo se utilizó plásmido E1010 del registro de las piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de materiales).
   * * Bacterias de control negativas: E. coli que contiene un plásmido con el gen RFP bajo el control de un promotor diferente, como el promotor de pbad (plásmido J10060 del registro de piezas biológicas estándar utilizadas para la biología sintética (ver tabla de Materiales)) o un plásmido que no tenga el gen RFP.
3. Colocar las culturas en una incubadora de agitación a 37 ° c y 220 rpm por un mínimo de 8 h, máximo de 18 h. el caldo nublado indica crecimiento bacteriano.

7. valorando E. coli para comprobar la función del dispositivo

Nota: una vez que los sensores se han ajustado para comprobar la función, no es necesario repetir este paso. Un control positivo en forma de adición de plomo, antimonio, y 2, 4-DNT o 1,3-dinitrobenceno (1,3-DNB) puede comprobar la función de los dispositivos para cada uso sin la necesidad de la valoración completa.

1. Prepare una solución de stock del analito (s) de interés a una concentración de 10 ppm en agua. Si la solubilidad es un problema, utilice una mezcla de 50/50 agua/metanol.
2. Usando la tabla 4 como guía, etiquete el número apropiado de tubos de cultivo estéril y Coloque 2 ml del caldo cultivado (del paso del Protocolo 6) en cada tubo.
   Nota: con el fin de determinar un rango analítico general, hacer al menos tres niveles diferentes de un analito con las bacterias del sensor, un nivel con el control negativo, y un nivel con el control positivo. También debe haber un tubo de cada una de las bacterias que no tiene ningún metal añadido (otro tipo de control negativo). Para determinar con mayor precisión el rango analítico y los límites de detección, utilice una mayor gama de concentraciones de analito.
3. Añada una solución de analito a los tubos que contengan 2 mL de caldo como se indica en la tabla 4, coloque los tapones de ajuste en el tubo de cultivo para que estén sueltos (para permitir el flujo de aire en el tubo), y vórtice el tubo de cultivo.
4. Dejando las tapas de encaje vagamente sobre los tubos de cultivo, colóquelo en una incubadora de agitación a 220 rpm y 37 ° c durante al menos 24 h.
5. Retire los tubos de la incubadora, encaje firmemente las tapas en los tubos y almacene los tubos en el refrigerador hasta que estén listos para el análisis de fluorescencia.

8. utilizando E. coli como sensor químico para GSR

1. Utilizando una toallita a base de etanol diseñada para eliminar el plomo (ver tabla de materiales), limpie todas las superficies de las manos, incluso entre los dedos. Utilice una toallita separada para cada mano. Almacene las toallitas en una bolsita sellable apropiadamente etiquetada hasta el análisis.
2. Para las superficies a probar: utilice una toallita a base de alcohol para superficies grandes o un bastoncillo de algodón humedecido con etanol para superficies pequeñas.
   Nota: para demostrar la respuesta de los sensores a GSR, el interior de una carcasa de cartucho de calibre 40 gastada fue subastado con un hisopo de algodón humedecido en etanol.
3. Usando guantes limpios y utilizando tijeras que se han limpiado con alcohol, cortar una sección de aproximadamente 1 cm² fuera del centro de la toallita.
4. Coloque la pieza cortada de la toallita de mano o el bastoncillo de algodón directamente en un tubo de cultivo que contenga 2 mL de las bacterias del sensor, asegurando que esté sumergida en el caldo.
5. Proceda como se describió anteriormente en los pasos 7,4 – 7,5.

9. Análisis de fluorescencia utilizando espectrómetro portátil (ver tabla de materiales)

1. Utilice un mezclador de vórtice para agitar los tubos.
2. Prepare el espectrómetro para recolectar la emisión de fluorescencia en la longitud de onda apropiada para su variante RFP con una longitud de onda de excitación de 500 nm.
3. Utilice el caldo Luria para grabar un espectro en blanco.
4. Transfiera cuidadosamente cada sobrenadante a una cubeta de volumen bajo y recoja la intensidad de la emisión.

10. Análisis de fluorescencia utilizando 96-lector de placas de pozo (ver tabla de materiales)

1. Utilice un mezclador de vórtice para agitar los tubos.
2. Transferir 200 mL del caldo a un pozo en la placa de pozo. Registre qué muestras entraron en cada pozo de la placa.
3. Configure el fluorómetro para recoger la intensidad de emisión en la longitud de onda adecuada para la variante RFP.

11. Análisis de datos

1. Utilizando la señal obtenida de todos los controles negativos (bacterias negativas de RFP o bacterias de sensor sin analito añadido), calcule una señal de fluorescencia promedio para el fondo.
2. Reste la señal de fondo promedio de cada señal de fluorescencia obtenida para que las bacterias del sensor obtengan una intensidad de fluorescencia corregida en el fondo.
3. Calcule la relación señal-ruido (S/N) dividiendo la intensidad de fluorescencia corregida en el fondo por la señal de fondo media. Si la relación S/N es mayor que 3, la prueba es positiva.

Resultados

Los espectros de fluorescencia para la variante RFP utilizada en este trabajo se muestran en la figura 2. Estos datos provienen del dispositivo PbRFP, ya que responde al plomo y al dispositivo TNT-RFP, ya que responde a dos analitos, 2, 4-DNT y 1, 3-DNB. Esta figura muestra el espectro de un control negativo (sin analito añadido) y los espectros en dos niveles diferentes de analito añadidos. La señal de fluorescencia máxima para la variante de RFP utilizada se observó en ...

Discusión

Las modificaciones y la solución de problemas

El experimento descrito en el cuadro 4 se puede modificar de cualquier manera adecuado a los sensores que se han diseñado. El aspecto más importante de un sensor químico es evaluar su sensibilidad y especificidad. Es beneficioso asegurarse de que se analice una amplia gama de concentraciones del analito para determinar el rango analítico útil del sensor. También vale la pena determinar un nivel máximo de analito pa...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,3-dinitrobenceno, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotolueno, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimonio, solución estándar de referencia (1000ppm ± 1%/Certificado)	Fisher Scientific	SA450-100	Estándar en HNO3
diluido Tampón	England BioLabs	B7204S
Tampón dúplex	Tecnologías de ADN integradas	11-01-03-00
Enzima de restricción EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
Etanol, grado HPLC, desnaturalizado	Acros Organics	AC611050040	No es necesario que los solventes sean de grado HPLC, ACS o grado reactivo funcionarán.
Eurofins Genomics SimpleSeq Kits de secuenciación de ADN	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward para PCR de colonias	Tecnologías de ADN integradas		5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'
Imprimación directa para la secuenciación de ADN	Integrated DNA Technologies		5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
Minikit de plásmido de alta velocidad IBI Science	de IB47101		IBI Scientific
,	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, solución estándar de referencia (1000ppm ± 1%/Certificado)	Fisher Scientific	SL21-100	HNO3
LeadOff	diluidas Hygenall	45NRCN	Vendida en botes o envuelta individualmente, cualquier toallita a base de alcohol funcionará.
Metanol, grado HPLC	Fisher Scientific	A452-4	no necesitan ser de grado HPLC, ACS o grado reactivo funcionarán.
NEB 5-alfa Competente E. coli células	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Enzima de restricción	England BioLabs	R3131S
Agua libre de nucleasa	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix con tampón estándar	New England BioLabs	M0482S
Plásmidos del registro de partes biológicas estándar utilizadas para biología sintética	Registro de partes		http://parts.igem.org/Main_Page
secuencias promotoras Tecnologías		integradas de ADN	Promotor Sb: 5'-GCATGAATTCA GTCATATATGTTTTTGACTTATCC GCTTCGAAGAGAGAGACACTACCT GCAACAATCGCTAGCGCAT-3' 3'-CGTACTTAAGCTCACTATA TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG TTAGCGATCGCGTA-5' Promotor de Pb: 5'-GCATGAATTCG TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG TGTATAATCGGCAACGCG AGCTAGCGCAT-3' 3'-CGTACTTAAGCAGAA CTGAGATATCATTGATCTCCCACA TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC GTA-5' Promotor TNT: 5' GCATTCTAGAT CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT AAAAAAACGTGATACTCATCACAT CGACGAAACAACGTCACTTATACA AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT GAATTCGCAT3' 3' CGTAAGATCTAGTTAA ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA GTGGACGCTCTCTCTAATTAACTTAA GCGTA5'
Imprimación inversa para PCR de colonias	Integrated DNA Technologies		5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'
Imprimación inversa para secuenciación de ADN	Integrated DNA Technologies		5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'
ADN ligasa T4 Nueva	Inglaterra BioLabs	M0202S