Artículo de método

Establecimiento y caracterización de tres afatinas pulmonares resistentes a Afatinib PC-9 Líneas celulares desarrolladas con dosis crecientes de Afatinib

DOI:

10.3791/59473

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26 de junio de 2019

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1Advanced Cancer Translational Research Institute, Showa University, 2Division of Breast Surgical Oncology, Department of Surgery, Showa University School of Medicine, 3Division of Allergology and Respiratory Medicine, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se desarrolló un método para establecer líneas celulares de resistencia al afatinib a partir de células de adenocarcinoma PC-9 pulmonar, y se caracterizaron células resistentes. Las células resistentes se pueden utilizar para investigar los mecanismos de resistencia inhibidor a la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico, aplicables a pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La resistencia adquirida a los inhibidores moleculares de la diana es un problema grave en la terapia oncológica. El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en la mayoría de los países. El descubrimiento de "mutaciones del conductor oncogénico", comoel receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que activa mutaciones, y el desarrollo posterior de agentes moleculares dirigidos de inhibidores de la tirosina quinasa EGFR (TKI) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib y osimertinib) han alterado drásticamente el tratamiento del cáncer de pulmón en las últimas décadas. Sin embargo, estos medicamentos todavía no son eficaces en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) portadores de mutaciones activadoras de EGFR. Tras la resistencia adquirida, la progresión sistémica de la CPN sigue siendo un obstáculo significativo en el tratamiento de pacientes con CPENR con mutación positiva de EGFR. Aquí, presentamos un método de aumento de dosis escalonada para establecer tres líneas celulares independientes adquiridas resistentes al afatinib de células NSCLC PC-9 que albergan mutaciones activadoras por EGFR de eliminaciones de pares de 15 bases en el exón 19 del EGFR. Se presentan brevemente métodos para caracterizar las tres líneas celulares independientes de resistencia a los afatinib. Los mecanismos de resistencia adquiridos a los TKI del EGFR son heterogéneos. Por lo tanto, deben examinarse varias líneas celulares con resistencia adquirida a EGFR-TKIs. Se requieren de diez a doce meses para obtener líneas celulares con resistencia adquirida utilizando este enfoque de escalamiento de dosis escalonada. El descubrimiento de nuevos mecanismos de resistencia adquirida contribuirá al desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces y seguras.

Introducción

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Cinco inhibidores de la tirosina quinasa, dirigidos al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), incluyendo gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib y osimertinib están actualmente disponibles para el tratamiento de pacientes con EGFR-positivo no pequeño pulmón de células (NSCLC). Durante la última década, las terapias para estos pacientes han experimentado un desarrollo dramático con el descubrimiento de nuevos potenciales EGFR-TKIs. Entre los pacientes con adenocarcinoma pulmonar, se identifican mutaciones somáticas en el EGFR en aproximadamente el 50% de los pacientes asiáticos y el 15% de los pacientes caucásicos1. Las mutaciones más comunes en EGFR son una mutación de punto L858R en las eliminaciones del par de pares de base (bp) del EGFR en el exon 192de EGFR. En pacientes con mutación positiva eg-egFR con CPN, EGFR-TKIs mejoran las tasas de respuesta y los resultados clínicos en comparación con el estándar anterior de quimioterapia doble platino3.

Gefitinib y erlotinib fueron los primeros inhibidores de moléculas pequeñas aprobados y generalmente se denominan "TKIs EGFR de primera generación". Estos TKIs de EGFR bloquean la actividad de la tirosina quinasa compitiendo con ATP y enlazando de forma reversible a los sitios de enlace de ATP4. Afatinib es un EGFR TKI de segunda generación que se une irreversible y covalentemente al dominio de la tirosina quinasa de EGFR y se caracteriza como un inhibidor de la familia EGFR panhumano5.

A pesar del beneficio dramático de estas terapias en pacientes con CPNC, la resistencia adquirida es inevitable. El mecanismo de resistencia más común contra los TTI EGFR de primera y segunda generación es la aparición de la mutación T790M en el exon 20 del EGFR, que está presente en el 50-70% de las muestras tumorales6,7,8. Otros mecanismos de resistencia incluyen señales de bypass (a MET, IGF1R y HER2), transformación al cáncer de pulmón de células pequeñas,e inducción de la transición epitelial a mesenquimal, que se producen preclínica y clínicamente 9. Los mecanismos de resistencia a los TKI del EGFR son heterogéneos. Mediante la identificación de nuevos mecanismos de resistencia en estudios preclínicos, puede ser posible desarrollar nuevas terapias para superar la resistencia. Las terapias de secuencia óptimas que maximizan el beneficio clínico para los pacientes deben tener en cuenta los mecanismos de resistencia y la diana terapéutica.

Es imperativo elegir la línea celular parental correcta, ya que es la base de todos los experimentos posteriores. Las estrategias de selección comienzan con relevancia clínica; es necesario elegir una línea celular ingenua de quimioterapia y radiación. El tratamiento quimioterapéutico y/o radiativo previo puede inducir la alteración de las vías de resistencia y los cambios de la expresión de marcadores de resistencia a los medicamentos. En este estudio, las células PC-9, que transportan eliminaciones de 15 bp en el exón 19 de EGFR, se emplean para el establecimiento de resistencia adquirida a afatinib. Esta línea celular se deriva de un paciente japonés de CpCLC, que no recibió quimioterapia y radiación previas.

Debido a que afatinib se administra por vía oral a diario, el tratamiento in vitro continuo, donde las células se cultivan constantemente en presencia de afatinib sería clínicamente relevante. La dosis de medicamentos utilizados en los diversos pasos del experimento debe optimizarse para la línea celular parental seleccionada. Se puede utilizar un ensayo de citotoxicidad para determinar un rango de fármacos adecuado, que debe ser comparable a la información farmacocinética del medicamento.

A lo largo del proceso de selección, toda la población de células se mantiene como un solo grupo; no se utilizan clonación u otros métodos de separación. Las células se exponen primero continuamente a un nivel bajo de la droga. Posteriormente, después de que las células se adaptan para crecer en presencia de la droga, la dosis de la droga se incrementa lentamente a la dosis óptima final de la droga10,11. Alternativamente, se puede utilizar un pulso de administración de fármacos o mutagénesis para seleccionar células de resistencia, que también se realizan antes del tratamiento farmacológico 12,13. Desafortunadamente, los casos en los que la resistencia a los medicamentos no se desarrollan generalmente no se notifican. Las estrategias de selección se desarrollan con el objetivo de tratar de imitar las condiciones de los pacientes de cáncer para reconstruir la resistencia clínicamente relevante. A veces, para identificar los cambios moleculares asociados con los mecanismos de resistencia a los fármacos, se utiliza una alta concentración de fármacos. Este modelo se vuelve menos relevante clínicamente.

Aquí, describimos un método para establecer tres líneas celulares independientes resistentes a afatinib a partir de células PC-9 que albergan eliminaciones de 15 bp en el exón 19 de EGFR, así como la caracterización inicial de las líneas celulares resistentes a afatinib.

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Protocolo

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1. Establecimiento de tres líneas celulares PC-9 resistentes a Afatinib independientes

  1. Determinación de la concentración inicial de exposición afatinib para células PC-9 utilizando el ensayo 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- bromuro de diphenyltetrazolium (MTT)
    1. Cultivo de células PC-9 en medio de crecimiento que contengan suero bovino fetal (10%), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 g/ml) en una placa de 10 cm tratada con cultivo celular en una incubadora de CO2 al 5% a 37 oC.
    2. Resuspenda las células PC-9 a 4 x 104 células/ml en medio de crecimiento y luego saque a 50 l/bien en una microplaca de 96 pocillos. La concentración final de células es de 2,0 x 103 células/50 l/pozo. Incubar durante la noche en una incubadora de CO2 al 5% a 37oC.
    3. Añadir 50 ml de solución de afatinib a diferentes concentraciones: 0, 0,002, 0,006, 0,02, 0,06, 0,2, 0,6, 2, 6 y 20 m a los pozos que contienen el medio de crecimiento (50 l). El volumen final y las concentraciones de afatinib son 100 l y 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 y 10 m, respectivamente.
    4. Incubar la placa de 96 pocillos durante 96 h en una incubadora de CO2 al 5% a 37oC.
    5. Añadir 15 l de la solución de tinte (ver Tabla de Materiales)a cada pozo e incubar durante 4 h en una incubadora de CO2 al 5% a 37 oC, y luego añadir 100 s de solubilización/solución de parada (ver Tabla de Materiales)a cada pocal e incubar durante la noche en un CO del 5%) c10>2 incubadora a 37oC.
    6. Mida la densidad óptica a 570 nm (OD570) utilizando un lector de microplacas (ver Tabla de Materiales). Prepare 6-12 réplicas y repita los experimentos al menos tres veces.
    7. Utilice software estadístico (ver Tabla de Materiales)para trazar gráficamente estos datos como un gráfico de semi-log y calcular el valor IC50, que es la concentración de fármacos que reduce la respuesta al 50% de su máximo (ver Tabla de Materiales ).
  2. Exposición continua de células PC-9 al irreversible EGFR-TKI, afatinib, por aumento escalonado de la dosis en tres platos independientes de 10 cm
    1. Cultivo pc-9 células en platos p100 que contienen 10 ml de medio de crecimiento. Cuando las células PC-9 alcancen la etapa de subconfluente, transfiera 1 ml de suspensión celular en tres nuevos platos p100, con 9 ml de medio de crecimiento. Las células PC-9 diluidas 1:10 se convierten en subconfluentes en 3-4 días, con un número de celda de aproximadamente 4-5 x 105 células/ml.
    2. Al día siguiente, agregue 1/10 del valor IC50 de afatinib en cada uno de los tres platos p100.
      NOTA: Afatinib se reconstituye en DMSO a concentraciones de 1 M, 10 m, 100 m, 1 mM y 5 mM. Se añade de 1 a 10 ml de solución de afatinib a 10 ml de medio de crecimiento en el cultivo, según las concentraciones finales requeridas.
    3. Cuando las células de los platos p100 que contienen afatinib se conviertan en subconfluentes, mezcle bien por aspiración con una pipeta de 1 ml y agregue 1 ml de la suspensión celular a 9 ml de medio de crecimiento fresco en un nuevo plato p100. A continuación, añadir un 10-20% más de concentraciones de afatinib a la nueva cultura.
    4. Aumentar la concentración de afatinib de 0,1 nM a 1 M en el medio mediante la escalada de dosis escalonada con la concentración de afatinib aumentada en un 10-20% en cada paso durante el período de 10-12 meses.
      NOTA: Cuando la concentración de afatinib se acerca al valor IC50, el crecimiento celular se vuelve bastante lento. Si las células se dividen 1:9, pueden no crecer, ya que estas células mueren por concentraciones más altas de afatinib. Por lo tanto, a concentraciones más altas de afanitib, las células se pueden dividir en una proporción de 1:2. Las células más resistentes se cultivaron en medio contenido de afatinib durante 3-14 días, y el medio no se cambió hasta que las células resistentes necesitaban ser pasajeras.
    5. Cultivo de las células resistentes al afatinib durante 2-3 meses en un medio de crecimiento que contiene afatinib de 1 M. A una concentración de afatinib de 1 M, se requieren 10-12 meses para desarrollar resistencia a afatinib en este modelo. Realice el ensayo MTT para confirmar que las células son resistentes al afatinib. Las tres líneas celulares de resistencia afatinib establecidas de forma independiente se denominaron AFR1, AFR2 y AFR3.

2. Caracterización de tres células independientes resistentes a Afatinib

  1. Determinación de la curva de crecimiento de las células parentales PC-9 y establecimiento de células resistentes a afatinib
    1. Cultivo de las células PC-9, AFR1, AFR2 y AFR3 en medio de crecimiento en una incubadora de CO2 al 5% a 37 oC.
    2. Resuspenda las células a 5 x 103 células/ml con medio de crecimiento, y la semilla de 100 ol/pozo en una microplaca de 96 pocillos, de forma que la concentración final de células sea de 500 células/100 l/pozo.
      NOTA: El ensayo MTT se realiza para medir los valores de OD570 en 0, 1, 2, 3, 5 y 7 días. Se requieren seis microplacas de 96 pocillos para cada día.
    3. Realice el ensayo MTT cada 24 h y luego los días 0, 1, 2, 3, 5 y 7. Mida los valores de OD570 y prepare 6-12 réplicas; repetir los experimentos al menos tres veces y trazar gráficamente los resultados utilizando un software estadístico (ver Tabla de Materiales).
  2. Identificación de las alteraciones genómicas del ADN en EGFR por PCR en tiempo real
    NOTA: Afatinib es un inhibidor de molécula pequeña que se dirige a la tirosina quinasa EGFR. El estado de la expresión EGFR se determina a los niveles de ADN y proteínas.
    1. El ADN genómico se aísla utilizando un kit de purificación de ADN (ver Tabla de Materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante. Mida la concentración del ADN genómico aislado con un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales)y ajuste todas las muestras de ADN genómicaa a 25 ng/L.
    2. Amplifique 50 ng de ADN genómico, que equivale a 2 l de las existencias de 25 ng/L, utilizando una mezcla maestra SYBR Green (ver Tabla de materiales)y analice los resultados utilizando un sistema de detección RT-PCR basado en fluorescencia (ver Tabla de Materiales).
      NOTA: Las condiciones de ciclo de PCR comenzaron con un paso inicial de desnaturalización a 95 oC para 20 s, seguido de 40 ciclos de desnaturalización de 95 oC para 3 s, 60 oC de recocido durante 30 s. Los conjuntos de imprimación específicos son los siguientes: EGFR F: 5'-CAAGGCCATGGAATCTGTCA-3', R: 5'-CTGGAATGAGGTGGAGGAACA-3'. Gen de normalización LINE-1 F: 5o-AAAGCCTCTCAACTACATGG-3o, R: 5o-TGCTTTGAATGCCCCAGAG-3o.
  3. Evaluación del efecto de las alteraciones proteicas en el nivel de EGFR mediante el análisis de manchas occidentales
    1. Tratar las células con afatinib continuamente antes de los experimentos para 24 h. Lavar las células PC-9, AFR1, AFR2 y AFR3 dos veces con PBS y luego sembrarlas en medios de crecimiento sin afatinib. Lave dos veces las células PC-9, AFR1, AFR2 y AFR3 con 5 ml de PBS helado.
    2. Lisia de las células en el tampón RIPA que contiene 1% de cóctel inhibidor de la proteasa (ver Tabla de Materiales)y cóctel inhibidor de fosfatasa II y III (ver Tabla de Materiales)e incubar esta solución a 4oC durante 30 min. Centrifuge los lysatos durante 10 min a 100 x g y 4 oC y recoger los lysates despejados.
    3. Determinar las concentraciones de proteínas utilizando el ensayo de ácido bicinhigiónico (ver Tabla de Materiales), ajustar todas las muestras de proteínas a 0,5 o 1 g/L utilizando tampón de muestra 4x (500 mM Tris (PH 6.8), 40% glicerol, 8% SDS, 20% H2O, 0.02% bromofenol azul) y hervir a 96 oC durante 5 min. Almacene estas muestras de proteínas a -80 oC hasta que se realice el análisis de la mancha occidental.
    4. Separar las cantidades iguales de muestras de proteínas, preferiblemente 20-30 l, por 8% SDS-página y transferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF).
      NOTA: La electroforesis de gel de dodecilo-poliacrilamida (SDS-PAGE) se utiliza comúnmente en el laboratorio para la separación de proteínas en función de su peso molecular.
      1. Limpie las placas de vidrio con etanol y monte la placa de vidrio y los espaciadores. Preparar geles de poliacrilamida al 8% que contengan 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% Bis-acrilamida, 10% SDS, 10% APS y TEMED. Polimerizar durante 30 min a temperatura ambiente.
      2. Posteriormente, preparar un gel de apilamiento que contenga 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% bis-acrilamida, 10% SDS, 10% APS y TEMED. Agregue la solución de gel de apilamiento, inserte el peine y polimerice el gel durante 20-30 min a temperatura ambiente.
      3. Coloque los geles en el aparato de electroforesis y llene el tanque con tampón de funcionamiento (0,25 M Tris, 1,92 M de glicina y 1% de SDS). Cargar la misma cantidad de muestras de proteínas (20-30 l) y ejecutar el gel a 180 V. Detener la electroforesis una vez que el frente del tinte fluye fuera del gel, después de aproximadamente 60 min.
      4. Lavar el gel durante 1-2 min con TBST y luego transferir las proteínas a una membrana PVDF mediante hinchazón semiseca (ver Tabla de Materiales)durante 1,5 h a una corriente constante de 300 mA.
    5. Bloquear las membranas con un 5% de leche seca sin grasa (ver Tabla de Materiales)diluida con solución TBST (ver Tabla de Materiales)durante 1 h a temperatura ambiente, y luego sondear las membranas con anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR (Y1068), anti-HER2, anticuerpos anti-HER3, anti-MET y antiactin (diluidos 1:3,000 en TBST) (ver Tabla de Materiales)a 4oC durante la noche.
    6. Lavar las membranas con TBST tres veces durante 10 minutos, y luego exponer las membranas al anticuerpo secundario (diluido 1:200 en TBST) durante 1-1,5 h a temperatura ambiente. Lave las membranas cinco veces con TBST durante 10 minutos a temperatura ambiente, expongalas a la solución ECL (ver Tabla de Materiales)y visualice las señales utilizando películas.
  4. Análisis de mutaciones del EGFR por secuenciación
    1. Amplificar el ADN genómico usando imprimaciones específicas para exons de EGFR 19-21. Las condiciones de ciclo de PCR comienzan con un paso inicial de desnaturalización a 94 oC durante 1 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98 oC durante 10 s, recocido a 55oC durante 30 s y extensión a 72oC durante 1 min.
      NOTA: Los imprimadores específicos para el exon 19 del EGFR: F: 5o-GCAATATCCTTAGGTGCGGCTC-3o R: 5o-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATG-3o, exón 20: F: 5o-CCATGAGTACTTTTGAAACTC-3o, R: 5o-CATATCCCCATCAACTCT-3o, y exón 21: F: 5o-ATGAACATCCCTGAATTCGG-3o, R: 5o- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3o.
    2. Purifique los productos de PCR amplificados utilizando un kit de purificación de PCR (ver Tabla de Materiales)y secuenciar los amplificadores.

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Resultados

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El esquema para establecer tres líneas celulares de resistencia afatinib a partir de células PC-9 mediante un procedimiento de aumento de dosis escalonada se muestra en la Figura1. La Figura 2 muestra una disminución en la proliferación celular de células PC-9 parentales a medida que aumenta la concentración de afatinib, lo que indica que las células PC-9 son sensibles a la exposición a afatinib. La Figura 3<...

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Discusión

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Aquí, describimos un método para establecer tres líneas celulares independientes resistentes a afatinib y caracterizamos estas células en comparación con las células pc-9 parentales. Mediante la exposición escalonada a la escalada de dosis, las células pc-9 parentales adquirieron resistencia a afatinib durante un período de 10-12 meses. Clínicamente, los mecanismos de resistencia a los TKI del EGFR son heterogéneos y, por lo tanto, después del tratamiento inicial con afatinib, las células PC-9 se dividieron en tres plato...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al miembro del Advanced Cancer Translational Research Institute por sus comentarios reflexivos y Editage por su ayuda con la edición del idioma inglés. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (número de concesión: 16K09590 a T.Y.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
afatinibSelleckS1011
anticuerpo monoclonal anti-EGFRtecnología de señalización celular4267S ensayo de
ácido bicinchonincsigmaB9643
placa de 10 cm tratada con cultivo celularViolamo2-8590-03
CELL BANKER1 TakaRaCB011medio de criopreservación
CellTiter 96Promega  G4100  ensayo de proliferación de células no radiactivas; Solución de colorante y solución de solubilización/parada
DMSOWako043-07216
Solución ECLPerkin ElmerNEL105001EA
FBSgibco26140-079
GeneAmp 5700Sistema de detección RT-PCR basado en fluorescenciaApplied Biosystems
Software GraphPad Prism v.7 GraphPad, Inc.un software estadístico
NanoDrop Lite espectrofotómetroTermoespectrofotómetro
Leche en polvo descremadatecnología de señalización celular9999S
Pluma Estreptococogibco15140-163
cóctel de inhibidores de fosfatasa 2sigmaP5726
cóctel de inhibidores de fosfatasa 3sigmaP0044
Lector de microplacas Powerscan HTBioTek
  Mezcla maestra Power SYBR Green Applied BiosystemsSYBR Cóctel
inhibidor de proteasasigmaP8340
QIAamp DNA Mini kitQiagen51306kit de purificación de ADN
QIAquick PCR kit de purificación QIAGENPCR kit de purificación
RPMI-1640 Wako189-02025con L-glutamina y rojo
fenol TBST en polvosigmaT9039
Trans-Blot SD Semi-Seco Electroforético Célulade transferencia Bio-Radsemi-seco t4ransfer aparato
96 pocillos MicroplacaThermo130188
de   de mezcla maestra verde de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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