Artículo de método

Imágenes de alta resolución de la dinámica nuclear en células vivas bajo tensión de tracción uniaxial

DOI:

10.3791/59474

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2 de junio de 2019

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1BioSystems and Micromechanics Interdisciplinary Research Group, Singapore-MIT Alliance for Research and Technology, CREATE, 2Department of Material Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

En este artículo

Resumen

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Utilizando un dispositivo previamente diseñado para aplicar la cepa mecánica a las células adherentes, este papel describe una geometría de sustrato rediseñado y un aparato personalizado para la imagen de célula única de alta resolución de células tensas con un objetivo de inmersión de aceite 100x.

Resumen

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Se sabe que la cepa mecánica extracelular provoca respuestas fenotísicas celulares y tiene relevancia fisiológica en varios sistemas tisulares. Para capturar el efecto de la tensión de tracción extracelular aplicada en las poblaciones celulares in vitro a través de Ensayos bioquímicos, un dispositivo ha sido previamente diseñado que puede ser fabricado simplemente y es lo suficientemente pequeño para caber dentro de incubadoras de cultivo de tejido, así como en la parte superior de etapas del microscopio. Sin embargo, el diseño anterior del sustrato de polidimetilsiloxano no permitía la creación de imágenes subcelulares de alta resolución a través de objetivos de inmersión en aceite. Este trabajo describe una geometría rediseñada del sustrato de polidimetilsiloxano y una configuración de imágenes personalizada que, en conjunto, puede facilitar la toma de imágenes subcelulares de alta resolución de las células vivas bajo tensión aplicada. Este sustrato se puede utilizar con el mismo dispositivo diseñado anteriormente y, por lo tanto, tiene las mismas ventajas que se enumeran anteriormente, además de permitir la imagen óptica de alta resolución. El diseño del sustrato de polidimetilsiloxano se puede mejorar mediante la incorporación de una rejilla que facilitará el seguimiento de la misma célula antes y después de la aplicación de la cepa. Los resultados representativos demuestran la creación de imágenes en tiempo de lapso de alta resolución de núcleos etiquetados con fluorescencia dentro de las células tensas capturadas utilizando el método descrito aquí. Estos datos de dinámicas nucleares proporcionan información sobre el mecanismo mediante el cual la cepa de tracción aplicada promueve la diferenciación de las células progenitoras de oligodendrocitos.

Introducción

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Las células y los tejidos en el cuerpo están sometidos a diversas señales mecánicas, incluyendo las cepas de tracción. Sin embargo, los efectos de estas señales en la biología de las células neuronales aún no se han estudiado extensamente y entendido completamente. En el sistema nervioso central, las fuentes de la cepa mecánica incluyen crecimiento del desarrollo1,2,3,4, procesos fisiológicos tales como flexión de la médula espinal, sangre y líquido cefalorraquídeo palpitaciones y afecciones patológicas como trauma, hinchazón de Axon, cicatr....

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Protocolo

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1. diseño del molde de polidimetilsiloxano de un solo pozo para imágenes de alta resolución

Nota: el molde para fabricar placas de polidimetilsiloxano está diseñado con las siguientes características para permitir la creación de imágenes con una lente de inmersión de aceite de 100x y un ajuste correcto en el dispositivo de deformación unitaria de construcción personalizada (figura 1A, B).

  1. Mantenga las dimensiones generales de la placa de tal manera que encaje en las abrazaderas del dispositivo de deformación unitaria.
    Nota: aquí, son 60 mm x 73 mm.
  2. Hacer ....

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Resultados

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Los trabajos recientes dirigidos a investigar el efecto de la tensión de tracción en los oligodendrocitos10 mostraron que una cepa de tracción uniaxial al 10% promueve la diferenciación de las células progenitoras de oligodendrocitas por los cambios globales en la expresión génica. El mecanismo detrás de estos cambios en la expresión génica se puede sondeado a través de la imagen de los parámetros subcelulares, como la estructura del citoesqueleto, la localización .......

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Discusión

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Un dispositivo ha sido previamente1 diseñado para la aplicación de la tensión de tracción extracelular en las células adherentes. El diseño del sustrato de polidimetilsiloxano en ese trabajo fue suficiente para los ensayos bioquímicos, así como la imagen de baja resolución de las células estiradas. En este trabajo, se rediseñó el sustrato y se introdujo una nueva configuración de imágenes que facilita la imagen de células vivas subcelulares de alta resolución. Las ventajas de este sistema son nume.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Todos los autores reconocen con gratitud el apoyo a la financiación de la Fundación Nacional de investigación de Singapur a través del grupo de investigación interdisciplinar de la Alianza de Singapur-MIT para la investigación y la tecnología (SMART) BioSystems y Micromechanics (BioSyM). Los autores Dr. Jagielska y el Dr. van Vliet también reconocen con gratitud la financiación y el apoyo de la Fundación Saks-Kavanaugh. Los autores agradecen a William ONG y al Dr. Sing Yian Chew de la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, por proporcionar células progenitoras de oligodendrocitos de rata para algunos experimentos descritos en este trabajo, y los autores agradec....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
oligodendrocitos primarias fuertes aisladas de ratas neonatales
fueron proporcionadas por el laboratorio del Dr. S. Y. Chew en la Universidad Tecnológica de Nanyang
Media
DMEM high  glucosaGibco11996-065-500ml
Pluma/EstreptococoGibco15070-063-100ml
FGFProspecCYT-608-50ug
PDGFProspecCYT-776-10ug
Media Componentes de stock
BSASigmaA9418-10G
ProgesteronaSigmaP8783-1G
PutrescineSigmaP5780-5G
Selenito de SodioSigmaS5261-10G
Tri-yodotironinaSigmaT6397-100MG
TiroxinaSigma T1775-100MG
Holo-TransferrinSigmaT0665-500MG
InsulinaSigmaI9278
Molde y placa
PDMS PDMS - Dow Corning Sylgard 184Ellsworth184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Molde - Plástico LíquidoSmooth-OnSmooth Cast 310 - Tamaño de
Recubrimientos de
poly-D-lisinaSigmaP6407-5MG
FibronectinaSigmaF1141-2MG
fuerte>Tinción de histonas
CellLigt H2B-GFP BacMamSondas MolecularesC10594
Funcionalización de superficies
APTESSigma A3648-100ml
BS3Covachem13306-100mg
Tampón HEPES pH 8.0Alfa AesarJ63578-AK-250ml
Desprendimiento de células
AccutaseInvitrogenA1110501-100ml
rastrosustrato<

Referencias

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  1. Bray, D. Mechanical tension produced by nerve cells in tissue culture. Journal of Cell Science. 410, 391-410 (1979).
  2. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Developmental Biology. 389, (1983).

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Etiquetas

Im genes de c lulas vivassubstrato de polidimetilsiloxanoobjetivo de inmersi n en aceiteim genes de lapso de tiempoc lulas progenitoras de oligodendrocitosn cleos fluorescentesdeformaci n mec nica

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