Artículo de método

Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura

DOI:

10.3791/59490

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3 de abril de 2019

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1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

En este artículo

Resumen

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Un novedoso método de preparación de la muestra fue desarrollado para acomodar el cocultivo de células y tejidos para detectar cambio de molécula pequeña usando spectrometry total de la proyección de imagen.

Resumen

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Espectrometría de masas (IMS) la proyección de imagen rutinaria se ha aplicado a tres tipos de muestras: tejido, esferoides y colonias microbianas. Estos tipos de muestras se han analizado mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) para visualizar la distribución de las proteínas, lípidos y metabolitos en muestras biológicas de interés. Hemos desarrollado un método de preparación de la novela muestra que combina las ventajas de las tres aplicaciones anteriores para abordar un enfoque underexplored para la identificación de comunicación química en cáncer, por la siembra de cultivos de células mamíferas en agarosa en cocultivo con tejidos sanos, seguidos de desecación de la muestra. Las células y tejidos de mamíferos son morfología en proximidad cercana, permitiendo la comunicación química a través de la difusión entre el tejido y las células. En momentos específicos, se seca la muestra basado en la agarosa de la misma manera que las colonias microbianas preparado para el análisis IMS. Nuestro método se desarrolló para modelar la comunicación entre el cáncer de ovario seroso de alto grado derivada de la trompa de Falopio como interactúa con el ovario durante la metástasis. Optimización de la preparación de la muestra dio como resultado la identificación de la noradrenalina como un componente clave de la química en el microambiente ovárico. Este nuevo método puede aplicarse a otros sistemas biológicos que requieren una comprensión de la comunicación química entre las células adyacentes o los tejidos.

Introducción

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Espectrometría de masas (IMS) de imágenes ha sido optimizada para caracterizar la distribución espacial de características moleculares en tres aplicaciones ampliamente utilizadas: rebanadas de tejido, esferoides y colonias microbianas1,2,3. Rebanadas de tejido pueden utilizarse para evaluar la localización de los metabolitos en el contexto de las condiciones biológicas en un host, ya sea dirigido o no dirigido dentro de un intervalo específico de masa. Sin embargo, las diferencias entre características moleculares son los más evidentes y significativos comparados con un tejido sano es una condición enferma, por ejemplo, un tumor. Este enfoque IMS es particularmente adaptado a la detección de biomarcadores de la enfermedad, sin embargo, adquirir muestras de tejido en etapas discretas de progresión de la enfermedad (por ejemplo, grados de tumor) impide la identificación de señales que podrían ser importantes para la iniciación de la de la enfermedad. El intercambio de información a través del espacio es una característica omnipresente de muchos sistemas biológicos, y rebanadas de tejido no pueden capturar esta dinámica química relé. Una técnica que es capaz de visualizar la difusión y el intercambio químico es IMS de microbianas colonias cultivadas en placas de agar; pequeñas moléculas son capaces de difundir a través de y en el agar y pueden ser capturadas mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de desorción/ionización espectrometría de masas4. Esta configuración de crecimiento puede utilizarse para identificar moléculas intercambiadas entre entidades biológicas discretas (colonias) y también puede determinar la direccionalidad de la producción del metabolito. La plataforma diseñada originalmente para el crecimiento de la Colonia microbiana se adaptó para explorar el metabolismo primario de explantes de tejido convertido células de mamífero, y IMS se utilizó para evaluar el intercambio químico dinámico en un sistema mamífero in vitro.

En los últimos años, ha quedado claro que el cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) a menudo se origina en el epitelio de la trompa de Falopio (FTE) y luego se extiende por metástasis al ovario durante la enfermedad temprana de desarrollo5,6, 7 , 8. la razón por la que FTE tumorigenic células propagación al ovario, donde grandes tumores eventualmente forman y hacen metástasis más, es actualmente confusa. Investigaciones anteriores se ha centrado en el papel de proteínas ováricos primaria metástasis al ovario; sin embargo, recientemente ha sido demostrado que la transición de una saludable a un tejido tumorigenic resulta en interrupción masiva del metabolismo celular y altera la producción de moléculas pequeñas9,10,11. Por lo tanto, la hipótesis de que moléculas pequeñas entre la FTE y el ovario pueden ser en parte responsables primaria metástasis de HGSOC.

Con nuestro procedimiento IMS desarrollado recientemente, hemos determinado que cocultivo de FTE tumorigenic y tejido ovárico sano induce la producción de norepinefrina desde el ovario. Sin embargo, otros tipos de la célula o células FTE normales no provocan este efecto. Un beneficio extraordinario de este método es que se pueden visualizar la producción molecular e intercambio de señales que representan moléculas reales, por lo que incluso en un cocultivo es posible determinar la fuente de una señal. Esto es una ventaja sobre el análisis de las muestras homogeneizadas, donde se pierde toda la información espacial. En nuestro sistema modelo, hemos sido capaces de asignar claramente la producción de noradrenalina al ovario. La noradrenalina se ha relacionado con la metástasis y la quimiorresistencia de cánceres ováricos, y la detección de esta molécula ha validado que el novedoso método IMS puede descubrir moléculas biológicamente relevantes12,13, 14. Esta validación nos permite proponer que esta nueva aplicación de IMS puede ser particularmente útil para grupos que están intentando identificar moléculas pequeñas en entornos de cocultivo y para entender los acontecimientos tempranos que influyen en la transformación de la célula de investigación y metástasis. El objetivo general de este método es aclarar la identidad y la distribución espacial de moléculas pequeñas durante el intercambio entre los tejidos y órganos, representados en vitro los cultivos celulares 3D o tejido vivo ex .

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Protocolo

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Todos los procedimientos animales estaban de acuerdo con directrices para los institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobaron por el Comité institucional de Animal de uso y cuidado (IACUC) de la Universidad de Illinois en Chicago.

1. preparación de reactivos

  1. Mantener células del epitelio oviducto murino (MOE) a 37° C con 5% CO2 en una incubadora humidificada en alfa medios medio esencial mínimo (αMEM) suplementados con suero bovino fetal 10% selenio (FBS), 2 mM L-glutamina, 10 mg/mL insulina, transferrina, (ITS) , ng/mL 1.8 factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 U/mL penicilina-estreptomicina, gentamicina 1 mg/mL y estradiol-17β 18.2 ng/mL. Pasar las células cada 3-4 días, asegurando que hay suficientes células en el mismo día los ratones serán sacrificados.
  2. 1 g de agarosa de bajo punto de fusión de la mezcla con 50 mL de agua destilada para preparar agarosa al 2%. Autoclave de la agarosa, deje que se enfríe, y luego alícuota (1 mL) en 2 mL tubos (véase Tabla de materiales) antes de que solidifique la agarosa. Agarosa puede almacenarse a-20 ° C indefinidamente.
  3. Preparar por lo menos 2 mL de medio de medio (DMEM) modificado Eagle de 1 x Dulbecco.
  4. Para la matriz de MALDI-TOF MS, prepare 10 mL de 5 mg/mL 1:1 ácido de alfa-ciano-4-hyroxycinnamic (CHCA): ácido dihydroxybenzoic (DHB) (véase Tabla de materiales) en 90: 10 ACN:H2O + 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Someter a ultrasonidos solución hasta que se disuelva la matriz.

2. Colonia y extirpación de ovario de ratón

  1. Mantener las parejas reproductoras de ratones CD-1 utilizando procedimientos estándar de la vivienda. Cerca del día del parto, revise los ratones todos los días por lo que se conoce la edad de los cachorros.
  2. Eutanasia de cachorros en 16 – 18 días de edad por la inhalación de CO2 por directrices de los NIH. Entregar el CO2 (100%) en un flujo tasa de 10% – 20% cámara de volumen por minuto y continuar durante dos minutos después había parado la respiración. Confirmar la eutanasia por dislocación cervical.
  3. Desinfecte todo el equipo quirúrgico sumergiendo en etanol al 70%. Caliente media de Leibovitz L-15 penicilina-estreptomicina de 1 x a 37 ° C.
  4. Humedezca la superficie abdominal con etanol al 70% para desinfectar la zona y minimizar la contaminación con el pelo. Sujete la piel que cubre la pared abdominal usando blunt tijeras quirúrgicas pinzas y uso para hacer una gran forma de V corta a través de la piel y pared abdominal, exponer los órganos internos.
  5. Hacia el lado con unas pinzas a los órganos internos. Individualmente agarra cada cuerno uterino con pinzas finas y levante ligeramente.
  6. Localizar el ovario, que será el final del cuerno uterino, inmediatamente por debajo de los riñones. Utilice tijeras quirúrgicas para diseccionar el ovario libre de tejido conectivo. Luego, corte el cuerno ovario en la mitad.
  7. Mover el ovario, oviducto y aproximadamente una mitad de cada cuerno uterino a medios de comunicación de L-15 precalentado de Leibovitz.
  8. Con un microscopio de disección mueva cuidadosamente cada ovario de la bursa circundante, liberándola de cualquier tejido adiposo, el oviducto y bursa. Hacia una nueva placa de los medios de comunicación L-15 de Leibovitz a cada ovario.
  9. Corte axial cada ovario en la mitad. Mantenga las piezas ováricas (ahora llamadas explantes) mantenidas a 37 ° C hasta placas de agarosa.

3. puesta en funcionamiento e incubar el portaobjetos tratados con ITO Cocultures

  1. Cocultures indivisos
    1. Licuar la agarosa a 70 ° C en una placa caliente.
    2. Coloque el divisor 8-bien en la parte superior del tinoxide de indio (ITO)-diapositiva tratada (figura 1A). La parte inferior de goma en el divisor del SIDA en la adherencia a la diapositiva, pero no se olvide de aplicar presión continua suave durante placas de agarosa para ninguÌ n escaparse o mezcla entre pozos.
    3. Recoger las células en un tubo cónico de 15 mL, centrifugar (a 5 minutos a 800 rpm) y vuelva a suspender a 50k células por 150 μL en medios x DMEM 1. Si una densidad celular diferentes es óptima, asegúrese de que en este paso la suspensión celular es 2 x la densidad final deseada (por ejemplo, para una concentración final de 50.000 células en 300 μL, densidad celular en este paso es 50.000 células en 150 μL).
    4. Antes de platear el cultivo celular, añadir ovario explante al centro del pozo (figura 1B).
    5. Añadir agarosa a cada cultivo celular en tubos individuales 2 mL justo antes de la galjanoplastia. Para cada bien, combinar 200 μL de suspensión celular y 200 μL de agarosa licuado en un tubo de 2 mL. Por ejemplo, para los cuatro pozos, combinar 800 μl de suspensión celular y 800 μl de agarosa al 2%. Algunos mezcla quedará, pero haciendo un poco más de lo necesario evita las burbujas de aire durante el pipeteo.
      1. Añadir agarosa a cultivos celulares individuales inmediatamente antes de eso cultura de célula de la galjanoplastia. La agarosa se enfríe en menos de un minuto, así que preparados para placa rápidamente.
    6. Inmediatamente añadir 300 μL de la mezcla de agarosa/células a cada pozo (figura 1). Figura 1 muestra tres condiciones de la célula y la condición de media, que cada uno plateado con y sin un ovario.
    7. Incubar los portaobjetos a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
  2. Cocultures divididas.
    1. Corte los separadores de plástico delgado y liso (figura 2A).
      Nota: Este experimento utiliza las partes de una cuenca de medios desechables estériles porque son planas y delgadas. Cortar sólo lo suficientemente ancho como para que calcen bien en la hipotenusa del pozo (~ 13 mm).
    2. Licuar la agarosa a 70 ° C en una placa caliente.
    3. Coloque el divisor 8-bien encima de la diapositiva de ITO-tratada (figura 2B). La parte inferior de goma en el divisor del SIDA en la adherencia a la diapositiva, pero no se olvide de aplicar presión continua suave durante placas de agarosa para ninguÌ n escaparse o mezcla entre pozos.
    4. Recoger las células en un tubo cónico de 15 mL, centrifugar (a 5 minutos a 800 rpm) y vuelva a suspender a 50k células por 150 μL en medios x DMEM 1. Si una densidad celular diferentes es óptimo, asegúrese de que en este paso la suspensión celular es 2 x la densidad final deseada (por ejemplo, para una concentración final de 50.000 células en 300 μL, densidad celular en este paso es 50.000 células en 150 μL).
    5. Inserte separadores plástico diagonalmente en pozos (figura 2).
    6. Añadir agarosa a cada suspensión celular uno en un momento justo antes de la galjanoplastia. Para cada bien, mezclar 100 μl de suspensión celular y 100 μl de agarosa licuado en un tubo de 2 mL. Por ejemplo, combinan cuatro pozos, 400 μL del cultivo celular y 400 μL de agarosa al 2%. Algunos mezcla de agarosa/celular quedará pero haciendo un poco más de lo necesario evita las burbujas de aire durante el pipeteo.
      1. Añadir agarosa a cultivos celulares individuales inmediatamente antes de eso cultura de célula de la galjanoplastia. La agarosa se enfríe en menos de un minuto, así que preparados para placa rápidamente.
    7. En un lado del divisor, placa 150 μL de mezcla de agarosa/célula. Permita que la agarosa se enfríe y solidifique (aproximadamente un minuto) y luego retire el divisor (Figura 2D).
    8. Coloque el explante de ovario en el centro de la mitad vacía del pozo. Mezcla de medios de comunicación/agarosa lugar 150 μL sobre la parte superior del ovario y sólo en el lado correcto del pozo (Figura 2E).
    9. Incubar los portaobjetos a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.

4. Deslice el secado y preparación para MALDI-TOF MS

  1. Después de cuatro días (o cualquier punto del tiempo preferido), retire el divisor de la cámara de los tacos de agarosa y la diapositiva (figura 1). Separe suavemente los lados de la agarosa de la cámara con una espátula plana y tire suavemente la cámara hacia arriba, teniendo cuidado de no mover enchufes de agarosa. Si se mueven, suavemente resituarlos para que no toquen entre sí.
  2. Colocar el portaobjetos en un horno de 37 ° C durante aproximadamente 4 h, rotando 90 º cada h.
    Nota: La rotación de la diapositiva es importante para asegurar la distribución de calor uniforme a lo largo de la muestra.
  3. Una vez seco, retire la corredera del horno (Figura 1E).
  4. Aplique la solución de la matriz usando el rociador (Figura 1F), con los siguientes parámetros: temperatura = 30 ° C, flujo = 0,2 mL/min, número de pasadas = 8, dirección = CC y la distancia de la boquilla = 40 mm.
    Nota: En lugar de un rociador de matriz, un aerógrafo artístico puede utilizarse para aplicar matriz líquida. La misma solución de matriz puede utilizarse para rociar, pero se requiere aproximadamente dos veces más solución. Con la diapositiva con abrazadera que cuelgue verticalmente, rocíe la diapositiva desde un ángulo de 90° aproximadamente un pie de distancia (adaptado de Hoffmann15) hasta la matriz de la capa es visible.
  5. Añadir 1 μl de calibrant (fósforo rojo para objetivos < 500 Da, una mezcla de péptidos (véase Tabla de materiales) para objetivos < Da 5.000) de claro ver en diapositiva. Fósforo rojo no requiere ninguna mezcla con la matriz, pero la mezcla de péptidos requiere mezcla 1:1 con la matriz para facilitar la ionización. Espere calibrant secar.
  6. Dibujar una X con un marcador permanente en cada esquina de la diapositiva y tomar una imagen óptica con una cámara o un escáner de 1.200 ppp.

5. proyección de imagen de adquisición de datos de espectrometría de masas

  1. Abrir una nueva secuencia en el software de análisis de datos IMS (véase Tabla de materiales). Establecer el ancho de la trama deseada resolución espacial, por lo menos 50 μm.
  2. Cargar la imagen óptica de la diapositiva en el software de análisis y enseñan a establecer tres puntos usando las intersecciones en la x en cada esquina.
  3. Designar las regiones de interés para la proyección de imagen en el software de adquisición y el nombre les por consiguiente.
  4. Calibrar el instrumento con el software de adquisición de datos (véase Tabla de materiales) dentro de error de 5 ppm.
  5. Guarde el método optimizado y comenzar a ejecutar. Este experimento optimizado los parámetros siguientes: polaridad = positivo, Detector = Reflectron, tamaño del Laser = 2, energía del Laser = 50%, Reflector modo detector aumento = x 3.

6. procesamiento de datos IMS

  1. Importar archivo de .mis en software estadístico (véase Tabla de materiales) para el análisis de la significación.

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Resultados

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Una óptimo secada diapositiva ITO tendrá como resultado una plana muestra desecada con mínimo sin arrugas en la superficie de la agarosa y agarosa piezas que mantienen la separación espacial de la diapositiva (figura 3). Figura 3A muestra secado óptimo, mientras que la figura 3B muestra las arrugas que deben ser evitadas. Esta optimización requiere cuidadoso monitoreo de la diapositiva en el horno, c...

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Discusión

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Hay un cuerpo creciente de evidencia que implica el papel de la norepinefrina en el HGSOC12,17,18, y esta técnica ha aportado información más mecanicista. Con al menos ocho condiciones biológicas presentes en la misma diapositiva, el método puede explicar controles biológicos tales como gene y especificidad celular así como controles de los medios de comunicación en un solo IMS. Mientras que el método fue optimizado evaluar inte...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

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La financiación fue proporcionada por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); Universidad de Illinois en Chicago Inicio fondos (L.M.S.); Donación de 543296 de la Alianza de fondo de investigación de cáncer de ovario (M.D.); y ES029073 UG3 (J.E.B.) y por el centro nacional para avanzar traslacional Ciencias, Instituto Nacional de salud, a través de subsidio UL1TR002003 (JEB & LMS).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
15 mL Tubos FalconDenvilleC1017-OPara recolectar células
Cámara de 8 pocillos (Millipore EZ-slide chamber)MilliporePEZGS0816Reutilizado de Millipore Millicell EZ-slide chamber
AcetonitrileSigma-Aldrich34998-4LSolvente para matriz pulverizada
Alpha Minimum Essential Medium (α MEM)Fisher10-022-CVMedios de cultivo celular
Velocidad Autoflex MALDI-TOF LRFBrukerPara el análisis de datos IMS
CentrífugaEppendorf5810 RPara recoger células y eliminar el sobrenadante
CHCA MatrixBruker Daltonic8201344 Matrix pulverizado sobre portaobjetos
secos DHB MatrixBruker Daltonic8201346Matrix pulverizado en portaobjetos secos
Bisturíes desechablesFisher22-079-707Para la extracción de los ovarios
Tijeras de disecciónFisher13-804-6Para la extracción de los ovarios
DMEM MediaGibco11995-065Medios mezclados con
agarosa factor de crecimiento epidérmicoPeprotech Inc.100-15Suplemento de medios de cultivo celular
Tubos EppendorfGenesee Scientific22-282Para alícuotas de agarosa
Estradiol-17 y beta;Simga-AldrichE2758Suplemento de medios de cultivo celular
Suero fetal bovinoDenvillefb5001Suplemento de medios de cultivo celular
FlexControl 3.4Bruker Daltonicsoftware de adquisición de datos IMS
FlexImaging 4.1Bruker DaltonicIMS software de análisis de datos
Pinzas (fina)Fsiher22-327379Para la extracción de la
ovarios GentamicinaCellgro30-005-CRSuplemento de medios de cultivo celular
Insulina, Transferrina, Selenio (ITS)Sigma-Aldrich11074547001Suplemento de medios de cultivo celular
portaobjetos recubierto de ITOBruker8237001Plataforma para la incubación de cocultivo
Medio L-15 de LeibovitzGibco11415064medios utilizados durante el tejido disección
L-glutaminaGibco25030-081 Suplemento de medios decultivo celular
Agarosa de bajo punto de fusiónSigma-AldrichA9414-10GMezclado con medios para el recubrimiento
Cuencade medios Corning4870Se utiliza para cortar divisores de plástico para cámaras divididas
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122 Suplemento
de medios de cultivo celularEstándar de calibración de péptidosBruker Daltonic8206195Calibrante para rango de masa medio
Rojo de fóforoSigma-Aldrich343-242-5GCalibrante para rango de masa baja
SCiLS Lab 2015 BrukerDaltonicAnálisis estadístico de datos IMS
Pinza quirúrgica (roma)Fisher08-875-8BPara la extirpación de los ovarios
TFAFisher TecnologíasA116-50Añadido a la solución de matriz
TM PulverizadorHTX TecnologíasPara la aplicación de matriz

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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