Un novedoso método de preparación de la muestra fue desarrollado para acomodar el cocultivo de células y tejidos para detectar cambio de molécula pequeña usando spectrometry total de la proyección de imagen.
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Artículo de método
Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura
En este artículo
Resumen
Resumen
Espectrometría de masas (IMS) la proyección de imagen rutinaria se ha aplicado a tres tipos de muestras: tejido, esferoides y colonias microbianas. Estos tipos de muestras se han analizado mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) para visualizar la distribución de las proteínas, lípidos y metabolitos en muestras biológicas de interés. Hemos desarrollado un método de preparación de la novela muestra que combina las ventajas de las tres aplicaciones anteriores para abordar un enfoque underexplored para la identificación de comunicación química en cáncer, por la siembra de cultivos de células mamíferas en agarosa en cocultivo con tejidos sanos, seguidos de desecación de la muestra. Las células y tejidos de mamíferos son morfología en proximidad cercana, permitiendo la comunicación química a través de la difusión entre el tejido y las células. En momentos específicos, se seca la muestra basado en la agarosa de la misma manera que las colonias microbianas preparado para el análisis IMS. Nuestro método se desarrolló para modelar la comunicación entre el cáncer de ovario seroso de alto grado derivada de la trompa de Falopio como interactúa con el ovario durante la metástasis. Optimización de la preparación de la muestra dio como resultado la identificación de la noradrenalina como un componente clave de la química en el microambiente ovárico. Este nuevo método puede aplicarse a otros sistemas biológicos que requieren una comprensión de la comunicación química entre las células adyacentes o los tejidos.
Introducción
Espectrometría de masas (IMS) de imágenes ha sido optimizada para caracterizar la distribución espacial de características moleculares en tres aplicaciones ampliamente utilizadas: rebanadas de tejido, esferoides y colonias microbianas1,2,3. Rebanadas de tejido pueden utilizarse para evaluar la localización de los metabolitos en el contexto de las condiciones biológicas en un host, ya sea dirigido o no dirigido dentro de un intervalo específico de masa. Sin embargo, las diferencias entre características moleculares son los más evidentes y significativos comparados con un tejid....
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Protocolo
Todos los procedimientos animales estaban de acuerdo con directrices para los institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobaron por el Comité institucional de Animal de uso y cuidado (IACUC) de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. preparación de reactivos
- Mantener células del epitelio oviducto murino (MOE) a 37° C con 5% CO2 en una incubadora humidificada en alfa medios medio esencial mínimo (αMEM) suplementados con suero bovino fetal 10% selenio (FBS), 2 mM L-glutamina, 10 mg/mL insulina, transferrina, (ITS) , ng/mL 1.8 factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 U/mL peni....
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Resultados
Una óptimo secada diapositiva ITO tendrá como resultado una plana muestra desecada con mínimo sin arrugas en la superficie de la agarosa y agarosa piezas que mantienen la separación espacial de la diapositiva (figura 3). Figura 3A muestra secado óptimo, mientras que la figura 3B muestra las arrugas que deben ser evitadas. Esta optimización requiere cuidadoso monitoreo de la diapositiva en el horno, c.......
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Discusión
Hay un cuerpo creciente de evidencia que implica el papel de la norepinefrina en el HGSOC12,17,18, y esta técnica ha aportado información más mecanicista. Con al menos ocho condiciones biológicas presentes en la misma diapositiva, el método puede explicar controles biológicos tales como gene y especificidad celular así como controles de los medios de comunicación en un solo IMS. Mientras que el método fue optimizado evaluar inte.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
La financiación fue proporcionada por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); Universidad de Illinois en Chicago Inicio fondos (L.M.S.); Donación de 543296 de la Alianza de fondo de investigación de cáncer de ovario (M.D.); y ES029073 UG3 (J.E.B.) y por el centro nacional para avanzar traslacional Ciencias, Instituto Nacional de salud, a través de subsidio UL1TR002003 (JEB & LMS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15 mL Tubos Falcon | Denville | C1017-O | Para recolectar células |
| Cámara de 8 pocillos (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Reutilizado de Millipore Millicell EZ-slide chamber |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvente para matriz pulverizada |
| Alpha Minimum Essential Medium (α MEM) | Fisher | 10-022-CV | Medios de cultivo celular |
| Velocidad Autoflex MALDI-TOF LRF | Bruker | Para el análisis de datos IMS | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5810 R | Para recoger células y eliminar el sobrenadante |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 Matrix pulverizado sobre portaobjetos | |
| secos DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix pulverizado en portaobjetos secos |
| Bisturíes desechables | Fisher | 22-079-707 | Para la extracción de los ovarios |
| Tijeras de disección | Fisher | 13-804-6 | Para la extracción de los ovarios |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Medios mezclados con |
| agarosa factor de crecimiento epidérmico | Peprotech Inc. | 100-15 | Suplemento de medios de cultivo celular |
| Tubos Eppendorf | Genesee Scientific | 22-282 | Para alícuotas de agarosa |
| Estradiol-17 y beta; | Simga-Aldrich | E2758 | Suplemento de medios de cultivo celular |
| Suero fetal bovino | Denville | fb5001 | Suplemento de medios de cultivo celular |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | software de adquisición de datos IMS | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS software de análisis de datos | |
| Pinzas (fina) | Fsiher | 22-327379 | Para la extracción de la |
| ovarios Gentamicina | Cellgro | 30-005-CR | Suplemento de medios de cultivo celular |
| Insulina, Transferrina, Selenio (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Suplemento de medios de cultivo celular |
| portaobjetos recubierto de ITO | Bruker | 8237001 | Plataforma para la incubación de cocultivo |
| Medio L-15 de Leibovitz | Gibco | 11415064 | medios utilizados durante el tejido disección |
| L-glutamina | Gibco | 25030-081 Suplemento de medios de | cultivo celular |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mezclado con medios para el recubrimiento |
| Cuenca | de medios Corning | 4870 | Se utiliza para cortar divisores de plástico para cámaras divididas |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 Suplemento | |
| de medios de cultivo celularEstándar de calibración de péptidos | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrante para rango de masa medio |
| Rojo de fóforo | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrante para rango de masa baja |
| SCiLS Lab 2015 Bruker | Daltonic | Análisis estadístico de datos IMS | |
| Pinza quirúrgica (roma) | Fisher | 08-875-8B | Para la extirpación de los ovarios |
| TFA | Fisher Tecnologías | A116-50 | Añadido a la solución de matriz |
| TM Pulverizador | HTX Tecnologías | Para la aplicación de matriz |
Referencias
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C.
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Reimpresiones y permisos
