Aislamiento y evaluación cuantitativa de células de pincel de tráqueas de ratón

Summary

Las células del cepillo son células epiteliales quimiosensoriales colinérgicas raras que se encuentran en la tráquea de ratón ingenua. Debido a su número limitado, la evaluación ex vivo de su papel funcional en la inmunidad y remodelación de las vías respiratorias es un desafío. Describimos un método para el aislamiento de células de cepillo traqueal por citometría de flujo.

Abstract

Las células del cepillo traqueal son células epiteliales quimiosensoriales colinérgicas a las que se encuentra para transmitir señales desde el lumen de las vías respiratorias al sistema inmunitario y nervioso. Son parte de una familia de células epiteliales quimiosensoriales que incluyen células de mechón en la mucosa intestinal, células de cepillo en la tráquea, y células quimiosensoriales y microvasas solitarias en la mucosa nasal. Las células quimiosensoriales en diferentes compartimentos epiteliales comparten marcadores intracelulares clave y una firma transcripcional central, pero también muestran una heterogeneidad transcripcional significativa, probablemente reflejo del entorno tisular local. Se requiere aislamiento de las células del cepillo traqueal de las suspensiones de una sola célula para definir la función de estas células epiteliales raras en detalle, pero su aislamiento es difícil, potencialmente debido a la estrecha interacción entre las células del cepillo traqueal y las terminaciones nerviosas o debido a la composición específica de las vías respiratorias de uniones apretadas y adheridas. Aquí, describimos un procedimiento para el aislamiento de las células del cepillo del epitelio traqueal del ratón. El método se basa en una separación inicial del epitelio traqueal de la submucosa, lo que permite una posterior incubación más corta de la lámina epitelial con papaína. Este procedimiento ofrece una solución rápida y conveniente para la clasificación citométrica de flujo y el análisis funcional de células de cepillo traqueal viables.

Introduction

Las células de cepillo pertenecen a una clase de células epiteliales quimiosensoriales caracterizadas por la expresión de receptores de sabor amargo y la maquinaria de transducción de receptores de sabor que se encuentra en las células de los paladares. A diferencia de las células de los cogollos de sabor, las células epiteliales quimiosensoriales se dispersan en superficies epiteliales y se conocen como células quimiosensoriales solitarias (SCC) y células microvasas en el epitelio nasal^1,2, células de cepillo en la tráquea ^3,4, y células de mechón en el intestino^5,6. Las células epiteliales que expresan receptores de sabor amargo y la maquinaria de transducción de sabor amargo también se encuentran en la uretra^7,8 y el tubo auditivo^9. Las células del cepillo de las vías respiratorias tienen funciones únicas en las respuestas neurogénicas e inmunitarias. Son células quimiosensoriales productoras de acetilcolina que evocan reflejos respiratorios protectores tras la activación con compuestos amargos y metabolitos bacterianos como las sustancias de observación de quórum^10. Las células de cepillo de las vías respiratorias son también la fuente epitelial dominante dela VÍA respiratoria de IL-25, que regula la inflamación del tipo 2 con aeroallos en las vías respiratorias 3.

La caracterización del transcriptoma completo de las células del cepillo de las vías respiratorias inferiores y su respuesta a los estímulos ambientales se ha visto limitada por su bajo número en el epitelio traqueal y un número muy limitado más allá de los grandes bronquios^10. Las técnicas utilizadas para el aislamiento de células quimiosensoriales del epitelio intestinal no han dado resultados proporcionalmente altos de la tráquea, posiblemente debido a los contactos íntimos de las células del cepillo traqueal con terminaciones nerviosas¹⁰ u otras factores específicos del tejido en la mucosa respiratoria, como la composición de adheridos y proteínas de unión apretada. Informes recientes de aislamiento exitoso de células de cepillo traqueal en números más altos para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula emplearon una incubación de 2 h con papaína o una incubación de 18 h con pronasa^11,12. Dado que las incubaciones más largas con enzimas digestivas pueden disminuir la viabilidad celular y alterar el perfil transcripcional de las células de los tejidos digeridos^13,esto podría sesgar el análisis comparativo con otras poblaciones epiteliales quimiosensoriales.

Aquí, informamos de un método para el aislamiento de células de cepillo traqueal para la secuenciación de ARN³. El tratamiento de la tráquea con dosis altas de dosis separa el epitelio de la submucosa. La digestión posterior de la lámina epitelial con papaína permite una excelente recuperación de esta célula estructural.

Protocol

Antes de llevar a cabo los siguientes experimentos, asegúrese de que todo el uso y protocolos de cuidado animal sean aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y realizados de acuerdo con la Guíapara el Cuidado y Uso del Consejo Nacional de Investigación Animales de Laboratorio" (8a Edición, 2011) y las directrices de LA ARRIVE. Todos los procedimientos descritos a continuación han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Brigham and Women's Hospital.

1. Preparación de reactivos

1. Preparar la solución de digestión Dispase, que es una solución de PBS que contiene 16 U/ml de dosis y 20 g/ml de DNase I. Asegúrese de que el polvo de dosificación se disuelva completamente antes de calentar la solución en un baño de agua a 37 oC.
2. Agregue un 5% de suero bovino fetal (FBS) con inactiva en calor a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) para hacer una solución de parada.
3. Preparar tampón de Tyrode I: añadir 26 U/ml de papaína (20 l/ml de solución de papaína de 48 U/mg) y 10 l/ml de L-cisteína al tampón de HEPES-Tyrode sin calcio.
4. Preparar el tampón Tyrode II: añadir leupeptina de 2 l/ml (5 mg/ml) al tampón de HEPES-Tyrode con calcio.
5. Preparar tampón FACS: utilizar la solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS) sin calcio, magnesio y rojo fenol, complementado con ácido etilendiaminetetraacético de 2 mM (EDTA) y añadir 2% FBS.

2. Disección de la tráquea de ratón

NOTA: Los ratones utilizados en este protocolo son ChAT^(BAC)-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 meses de edad de ambos sexos. Minimizar la exposición del tejido a la luz directa para reducir el fotoblanqueo de eGFP.

1. Eutanasia del ratón con 100 mg/kg de solución de eutanasia pentobarbital inyectada por vía intraperitoneal o utilizando protocolos estándar aprobados por la IACUC.
2. Fije el ratón en una placa quirúrgica en la posición supina con agujas de 21 G con las extremidades superiores e inferiores extendidas. Rocíe el pelaje con 70% EtOH para desinfectar el área.
3. Con fórceps rectos, levante la piel y el pelaje del abdomen y haga una incisión en el centro con tijeras dissección (tijeras rectas, 3 cm). Con las tijeras, separe la piel del tejido subcutáneo del abdomen a la mandibula. Mientras sostiene el tejido subcutáneo con los fórceps, haga una pequeña incisión con las tijeras en el centro de la pared abdominal.
4. Abra el peritoneo con una incisión en forma de V. Con los fórceps, mueva suavemente el intestino delgado hacia un lado, localice la aorta abdominal y la vena cava y haga una incisión con las tijeras disectrizantes para permitir una rápida exsanguinación.
5. Localice el diafragma. Con una aguja de 18 G, haga una abertura en el diafragma justo debajo del esternón para desinflar los pulmones. Separe cuidadosamente el diafragma de la caja torácica utilizando tijeras de diselación rectas de punta afilada para cortar a lo largo de la base de las costillas.
6. Usando los fórceps, levante el extremo expuesto del esternón y corte el esternón longitudinalmente desde la base de la caja torácica hasta el cuello. Haga una incisión cervical central con tijeras rectas cortas (2 cm) y separe los dos lóbulos de la glándula submandibulular.
7. Retire cuidadosamente el tejido conectivo circundante y el timo que cubre la carina con un par de fórceps de alta precisión de punta fina.
8. Diseccionar la tráquea libre primero separando el extremo proximal a nivel de la epiglotis y luego diseccionando el extremo distal a nivel de la bifurcación de la tráquea.
9. Localice la epiglotis y corte la tráquea longitudinalmente de la epiglotis a la carina.

3. Digestión epitelial traqueal

1. Colocar la tráquea en un tubo de 1,5 ml que contenga 750 ml de solución de disipación precalentada (a 37 oC). Incubar en una coctelera a 200 rpm durante 40 min a temperatura ambiente. Cubra el tubo con papel de aluminio para reducir la exposición a la luz directa.
2. Añadir 750 ml de DMEM en frío con 5% de FBS para detener la reacción. Colocar en hielo.
3. Transfiera la tráquea a una placa Petri (100 mm x 15 mm) y colóquela bajo un microscopio de disección. Orientar la tráquea con el lado epitelial hacia arriba. La tráquea diseccionada longitudinalmente tiene una forma semi-cilíndrica mantenida por los anillos cartilaginosos. El epitelio está en la superficie cóncava.
4. Ate el área de epiglotis de la tráquea con fórceps rectos a la placa Petri y usando un bisturí desechable de tamaño 22, raspar el epitelio de la tráquea. La capa epitelial se separa como una hoja translúcida.
5. Mince el epitelio con el bisturí. Transfiera la capa epitelial a un tubo de 2 ml.
6. Enjuague la placa Petri con 750 ml de tampón Tyrode I y transfiera al tubo de 2 ml que contiene la capa epitelial.
7. Incubar la capa epitelial traqueal en tampón Tyrode I durante 30 min a 37 oC en una coctelera a 200 rpm. Cubra el tubo con papel de aluminio para reducir la exposición a la luz directa.
8. Añadir 750 l de tampón Tyrode II frío. Vortex el tejido digerido vigorosamente durante 20-30 s. Triturar el homogeneizado con una jeringa unida a una aguja de 18 G 10 veces.  Cambie a una aguja de calibre 21 G y triturar 10-20 veces más.
9. Filtrar las células a través de un colador de 100 m en un tubo cónico de 50 ml. Agregue 30:1 vol/vol del buffer frío FACS.
10. Girar a 350 x g durante 10 min a 4 oC y desechar el sobrenadante. Resuspenda el pellet en tampón FS frío y transfiera la suspensión a un tubo de poliestireno de 12 mm x 75 mm (5 ml). Vuelva a girar a 350 x g durante 10 min a 4 oC y deseche el sobrenadante.
11. Vuelva a suspender el pellet en 100 l de búfer FACS.
12. Añadir 1 l de anticuerpo de bloqueo antiratón CD16/32 para bloquear la unión no específica e incubar durante 15 minutos sobre hielo. No lavar.
13. Añadir los siguientes anticuerpos y los respectivos controles de isotipo: azul pacífico antiratón CD45 o rata IgG2a, k (0,25 g/10⁶ células en volumen de 100 l) y aloficocianina (APC) anti-ratón EpCAM o rata IgG2b, k (0,5 g/10⁶ celdas en volumen de 100 ol) anticuerpos monoclonales. Incubar durante 45 min sobre hielo protegido de la luz directa. Añadir 4,5 ml de tampón DE FACS frío, mezclar y girar a 350 x g durante 10 minutos a 4 oC. Deseche el búfer FACS y vuelva a suspender el pellet en 300 ml de búfer FACS frío.
14. Añadir yoduro de propidium (PI) (5 g/ml) inmediatamente antes de la clasificación citométrica de flujo.
    NOTA: Las células de pincel tienen una forma irregular con varios procesos que potencialmente podrían aumentar su adherencia a los filtros (Figura3C). Comparamos filtros de 30 mm a 70 mm y 100 mm y encontramos que los filtros de poros más grandes aseguraban mejores rendimientos. Además, la trituración exhaustiva de la suspensión celular después de la digestión de la papaína mejora significativamente el rendimiento de la célula del cepillo. Recomendamos el uso de una aguja de 18G para la trituración inicial seguida de un agujero más pequeño (21 o 23 G aguja) para una disociación más fina de las células.

4. Estrategia de galada de citometría de flujo

1. Identifique las células de los escombros por el ángulo de dispersión hacia adelante y hacia los lados. Excluya los dobletes utilizando la altura y la anchura de dispersión hacia delante y la altura y anchura de dispersión lateral. Los dobletes serían las celdas que tienen valores de ancho alto.
2. Dentro de las células individuales, identifique las células vivas como la población que es PI negativa.
3. Dentro de las celdas individuales vivas, identifique las celdas CD45 de baja a negativa en función del control de isotipo.
4. Dentro de las células bajas/negativas CD45, identifique las células positivas EpCAM que también son positivas eGFP (en el canal FITC). Esta es la población de células de pincel (Figura2A).

Results

Este procedimiento se ha implementado con éxito para aislar células de cepillo traqueal para la secuenciación de ARN³. Después del aislamiento de la tráquea y ladigestión del tejido con un protocolo de 2 pasos (Figura 1), las células se recogieron y se mancharon con CD45 etiquetado fluorescentemente y EpCAM después de la exclusión de células muertas con PI. Después de hacer dobletes basados en las características de dispersión hacia adelante y lateral, definimos las c...

Discussion

Encontramos que una combinación de tratamiento de dosis altas durante 40 minutos seguido de un tratamiento corto con papaína (30 min) proporciona un protocolo óptimo para la digestión traqueal y el aislamiento de células de cepillo. Esta combinación evita una digestión extensa y produce el mayor rendimiento de células de cepillo, en comparación con los protocolos alternativos.

Mientras que la digestión pulmonar para extraer células hematopoyéticas se ha basado clásicamente en enzimas digestiva...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticuerpos
Anti-GFP (Ig policlonal de cabra)	Abcam	cat# ab5450
APC anti-ratón CD326 (EpCAM)  (G8.8)	Biolegend	gato#118214
APC Rata IgG2a, control de isotipo k	Biolegend	gato#400511
DAPI	Biolegend	gato#422801
Anticuerpo secundario anti-cabra burro IgG (H+L) altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488	Life Technologies/Sondas moleculares	gato#A-11055
IgG de cabra normal	R& D Systems	gato#AB-108-C
Azul Pacífico anti-ratón CD45 (30F-11)	Biolegend	gato#103126
Rata azul del Pacífico IgG2b, control de isotipo k	Biolegend	gato#400627
TruStain FcX (anti-ratón CD16/32) Anticuerpo	Biolegend	gato#101320
Productos químicos, péptidos y proteínas
Dispasa	Gibco	gato# 17105041
DNasa I	Sigma	gato# 10104159001
HEPES-Tyrode' Tampón s sin calcio (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM de glucosa. Preparado en agua de 18,2 megaohmios y filtrado a través de 0,22 y micro; m filtro	Boston BioProducts	cat# PY-912
Tyrode' Solución s (tamponada con HEPES) 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 25 mM de HEPES, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2 y 10 mM de glucosa. Preparado en agua de 18,2 megaohmios y filtrado a través de 0,22 y micro; Filtro M. )	Boston BioProducts	cat# BSS-355
L-cisteína	Sigma	cat# C7352
Sal de trifluoroacetato de leupeptina	Sigma	cat# L2023
Papaína de látex de papaya	Sigma	cat# P3125
Yoduro de propidio	Sigma	cat# P4170
Modelos experimentales: Organismos/Cepas
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg (RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)	El Jackson Laboratory	7902
Equipment
LSM 800 con sistema confocal Airyscan  en A  Microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss
LSRFortessa	BD	647465
Equipos desechables
1,5 mL tubos estériles Thomas	Scientific	1157C86
5 mL Tubo de fondo redondo de Poysterene, 12 mm x 75 mm estilo	Falcon	14-959-1A
50 mL Tubo cónico de polipropileno, 30 mm x 115 mm estilo	Falcon	352098
Feather Bisturí desechable n.º 12	Fisher Scientific	NC9999403
placa de Petri, 100 mm x 15 mm estilo	Falcon	351029
Colador de células estériles, 100 μ m	Fisherbrand	gato#22363549