Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de melanoma

Summary

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) recapitulan más robustamente las características moleculares y biológicas del melanoma y son más predictivos de la respuesta terapéutica en comparación con los ensayos tradicionales basados en el cultivo de tejido plástico. Aquí describimos nuestro protocolo operativo estándar para el establecimiento de nuevos modelos PDX y la caracterización/experimentación de los modelos PDX existentes.

Abstract

La evidencia acumulada sugiere que las propiedades moleculares y biológicas difieren en las células de melanoma cultivadas en los vasos tradicionales del cultivo de tejido bidimensional frente al in vivo en pacientes humanos. Esto se debe a la selección de cuellos de botella de las poblaciones clonales de células de melanoma que pueden crecer de forma robusta in vitro en ausencia de condiciones fisiológicas. Además, las respuestas a la terapia en cultivos de tejido bidimensional en general no reflejan fielmente las respuestas al tratamiento en pacientes con melanoma, y la mayoría de los ensayos clínicos no muestran la eficacia de las combinaciones terapéuticas que han demostrado ser eficaces en Vitro. Aunque la xenorendurecimiento de las células del melanoma en ratones proporciona el contexto fisiológico in vivo ausente de los ensayos de cultivo de tejido bidimensional, las células de melanoma utilizadas para el injerto ya han sido sometidas a una selección de cuellos de botella para las células que podrían crecer bajo condiciones bidimensionales cuando se estableció la línea celular. Las alteraciones irreversibles que se producen como consecuencia del cuello de botella incluyen cambios en las propiedades de crecimiento e invasión, así como la pérdida de subpoblaciones específicas. Por lo tanto, los modelos que recapitulan mejor la condición humana in vivo pueden predecir mejor las estrategias terapéuticas que aumentan eficazmente la supervivencia global de los pacientes con melanoma metastásico. La técnica de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) implica la implantación directa de células tumorales desde el paciente humano hasta un receptor de ratón. De esta manera, las células tumorales se cultivan constantemente bajo tensiones fisiológicas in vivo y nunca se someten al cuello de botella bidimensional, que preserva las propiedades moleculares y biológicas presentes cuando el tumor estaba en el paciente humano. Notablemente, los modelos PDX derivados de sitios de órganos de metástasis (es decir, cerebro) muestran una capacidad metastásica similar, mientras que los modelos PDX derivados de pacientes ingenuos de terapia y pacientes con resistencia adquirida a la terapia (es decir, terapia inhibidora BRAF/MEK) muestran sensibilidad similar a la terapia.

Introduction

Los modelos preclínicos son críticos para todos los aspectos de la investigación traslacional del cáncer, incluida la caracterización de la enfermedad, el descubrimiento de vulnerabilidades procesables exclusivas del cáncer frente a las células normales, y el desarrollo de terapias eficaces que exploten estas vulnerabilidades para aumentar la supervivencia global de los pacientes. En el campo del melanoma, decenas de miles de modelos de líneas celulares han sido muy utilizados para la detección de drogas, con >4,000 aportados por nuestro grupo solo (serie WMXXX). Estos modelos de líneas celulares se derivaron de pacientes con melanoma con diversas formas de melanoma cutáneo (es decir, difusión acral, uveal y superficial) y diversos genotipos (es decir, BRAF^V600-mutante y neuroblastoma RAS homólogo viral oncogó [ NRAS ^Q61R-mutant]), que abarcan el espectro de la enfermedad presente en la clínica^1,2.

Inequívocamente, la estrategia de terapia dirigida más exitosa en el campo del melanoma ha surgido de 1) la caracterización genómica de los tumores de los pacientes que identifican mutaciones BRAF en el 50% de los melanomas³ y de 2) investigación preclínica aprovechando los modelosde la línea celular del melanoma 4. La combinación de inhibidores BRAF/MEK fue aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) en 2014 para el tratamiento de pacientes cuyos melanomas albergan mutaciones BRAF^V600E/K y cuenta con una tasa de respuesta de >75%⁵. A pesar de esta eficacia inicial, la resistencia surge rápidamente en casi todos los casos debido a los mecanismos de resistencia intrínsecos y adquiridos multifacestados y la heterogeneidad intratumoral. Desafortunadamente, los modelos de líneas celulares no recapitulan la heterogeneidad biológica representativa cuando se cultivan en cultivos bidimensionales en recipientes plásticos, lo que enmascara su potencial clínicamente predictivo cuando los investigadores intentan determinar experimentalmente terapias que podrían ser eficaces en pacientes con una forma específica o genotipo de melanoma⁶. Comprender cómo modelar mejor la heterogeneidad intratumoral del paciente permitirá a los investigadores desarrollar mejor las modalidades terapéuticas que pueden matar a las subpoblaciones resistentes a la terapia que impulsan el fracaso de las terapias estándar de atención actuales.

El valor predictivo limitado de los modelos de línea de celda es cómo se establecen inicialmente. Las alteraciones irreversibles ocurren en el paisaje clonal tumoral cuando se cultiva una suspensión de una sola célula del tumor de un paciente en vasos bidimensionales de cultivo de tejido plástico, incluyendo cambios en el potencial proliferativo e invasivo, la eliminación de subpoblaciones, y la alteración de la información genética⁷. Los xenoinjertos en ratones de estos modelos de línea celular de melanoma representan la plataforma in vivo más utilizada para estudios preclínicos; sin embargo, esta estrategia también sufre de la mala recapitulación de la heterogeneidad tumoral compleja observada clínicamente. Para superar esta deficiencia, ha habido un creciente interés en incorporar modelos preclínicos más sofisticados de melanoma, incluido el modelo PDX. Los modelos PDX se han utilizado durante >30 años, con estudios seminales en pacientes con cáncer de pulmón que demuestran concordancia entre la respuesta de los pacientes a los agentes citotóxicos y la respuesta del modelo PDX derivado del mismo paciente^8. Recientemente, ha habido un impulso para utilizar los modelos PDX como la herramienta de elección para las investigaciones preclínicas tanto en la industria como en los centros académicos. Los modelos PDX, debido a su recapitulación superior de la heterogeneidad tumoral en pacientes humanos,son más relevantes clínicamente para su uso en los esfuerzos de optimización de la terapia que los xenoinjertos de línea celular 9. En el melanoma, hay enormes obstáculos que contenrelan el manejo terapéutico de la enfermedad avanzada^10. Los modelos PDX clínicamente relevantes se han utilizado para modelar la resistencia clínica e identificar estrategias terapéuticas con agentes clínicamente disponibles para tratar tumores resistentes a la terapia^11,12. Brevemente, el protocolo presentado aquí para generar modelos PDX requiere la implantación subcutánea de tejido fresco a partir de melanomas primarios o metastásicos (recogidos por biopsia o cirugía) en ratones NOD/scid/IL2-receptor null (NSG). Diferentes variaciones en el enfoque metodológico son utilizadas por diferentes grupos; sin embargo, existe un núcleo fundamental¹³.

Protocol

Los siguientes protocolos de animales siguen las pautas del comité de ética humana del Instituto Wistar y las pautas de cuidado animal.

1. Recogida de tejido tumoral de melanoma

1. Recoger el tejido tumoral (llamado paso 0) de pacientes con melanoma por uno de los siguientes métodos de cirugía o biopsia.
   1. Para el tejido quirúrgico de escisión, mantener un mínimo de 1 g de tejido (metástasis de resect y lesiones primarias) en medios de almacenamiento de transporte (RPMI 1640 + 0,1% de fungizona + 0,2% de gentamicina) a 4 oC o sobre hielo.
   2. Para el tejido de biopsia quirúrgica, mantenga menos de 1 g de tejido (a menudo punzonar biopsias de metástasis subcutáneas [s.c.] y metástasis de ganglios linfáticos [LN]) en medios de almacenamiento de transporte a 4 oC o sobre hielo.
   3. Para el tejido de biopsia de núcleo, lave un cilindro (núcleo) de tejido de aproximadamente 10 mm x 1 mm (a menudo, biopsias hepáticas) en un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de medios de almacenamiento de transporte a 4 oC o sobre hielo.
   4. Para el tejido de aspirado con aguja fina (FNAs), mantenga una cantidad muy pequeña de tejido (menos de 1 mm de tamaño) tomada directamente del paciente en una aguja y jeringa a 4 oC o sobre hielo.
2. Entregar el tejido en medios de almacenamiento de transporte a 4 oC o en hielo el mismo día o con envío nocturno después de la escisión quirúrgica o biopsia. Procesar el tejido dentro de 1-2 h de la entrega.

2. Procesamiento de tejido tumoral para la implantación del ratón

1. Escisión quirúrgica o procesamiento de tejido de biopsia quirúrgica
   1. Transfiera el tejido a un plato estéril de Petri y separe el tejido tumoral del tejido normal circundante tanto como sea posible.
   2. Retire el tejido necrótico (generalmente identificado como tejido paleblanqueo ubicado centralmente dentro del tumor) del tumor restante tanto como sea posible.
   3. Utilice un bisturí para subdividir un trozo tumoral inicial en piezas aproximadamente iguales (3 mm x 3 mm) para la implantación quirúrgica del ratón (Figura2).
   4. Opcionalmente, si hay suficiente tejido tumoral disponible, congele a presión el tejido para ensayos aguas abajo (secuenciación de ARN [RNASeq], secuenciación completa de exomas [WES], etc.).
   5. Haz una suspensión tumoral picando el tejido tumoral usando una técnica de cuchilla cruzada con dos cuchillas de bisturí. Mince los trozos del tumor tan finamente como sea posible para formar una suspensión, que ahora está listo para la implantación quirúrgica del ratón.
   6. Alternativamente, si el tejido tumoral es demasiado duro para la disociación mecánica, utilice un procedimiento de disociación de digestión para formar lodos similares al gel y una suspensión de una sola célula para la implantación y / o inyección.
      1. Mince los trozos del tumor tan finamente como sea posible para formar purines.
      2. Coloque la suspensión en un tubo de 50 ml con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en frío^-/- (sin Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺); luego, centrífuga y pellet a 220 x g durante 4 min a 4oC.
      3. Resuspender la suspensión en 10 ml de medios de digestión frescos calentados (200 U/ml de colagenasa IV + 5 mM CaCl₂ + 50 U/ml DNase en HBSS^-/-) por 1 g de tejido tumoral.
      4. Colocar el tubo en un baño de agua de 37oC durante 20 minutos y mezclar vigorosamente cada 5 minutos con una pipeta desechable.
      5. Lavar con hasta 50 ml de HBSS^-/-; luego, centrífuga a 220 x g durante 4 min a 4oC.
      6. Añadir 5 ml de TEG precalentado (0,025% de trippsina + 40 g/ml de etilenglicol-bis (éter aminoetímilo)-N,N,N',N',ácido tetraacético [EGTA] + alcohol polivinílico de 10 g/ml [PVA]) por 1 g de tejido tumoral, resuspender/agitar suavemente el tubo a 37.m..
      7. Añadir al menos 1 volumen igual de medios de tinción en frío (1% albúmina sérica bovina [BSA] + 10 mM 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic acid [HEPES] + 1x penicilina-estreptomicina en l15 media) para saciar la trippsina y centrúfuga a 220 x g durante 4 minutos a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min a 4 min C.
      8. Resuspenda la muestra en 10 ml de medios de tinción por cada 1 g de tejido tumoral y filtre a través de un colador de células de 40 m para obtener una suspensión de una sola célula para la inyección del ratón (Figura2).
      9. Los purines que quedan en la parte superior del colador celular también se pueden recoger para la implantación quirúrgica del ratón.
2. C Procesamiento de tejido de biopsia de mineral
   1. Vierta el tejido del cilindro central en el tubo de transporte de tejido en una placa Petri de 5 cm.
   2. Retire el exceso de líquido, raspe el tejido hasta el borde de la placa Petri, mince finamente el tejido tumoral, agregue 100-150 ol de HBSS^-/- en la parte superior del tejido tumoral y extraiga rápidamente la suspensión del tejido HBSS/tumor en la jeringa de 1 ml.
   3. Coloque una aguja de 23 G en la jeringa de 1 ml, pase la suspensión de tejido HBSS/tumor a través de la aguja en un tubo de giro de 1,5 ml.
   4. Vuelva a dibujar la suspensión del tumor en la jeringa con la aguja encendida hasta que pueda pasar suavemente a través de la aguja.
   5. Finalmente, extraiga la suspensión del tumor de nuevo en la jeringa y desenganche la aguja de 23 G.
   6. Coloque una aguja de 27 G y extraiga un volumen igual (-100–150 l) de matriz extracelular artificial (ver Tabla de Materiales)en la jeringa.
   7. Añadir un volumen igual de matriz extracelular artificial lentamente en el tubo de centrifugado de 1,5 ml con la suspensión tumoral/HBSS^-/-, evitando cuidadosamente la formación de burbujas.
   8. Dibuje una última vez en la jeringa y el tejido tumoral de la biopsia central ya está listo para la inyección del ratón.
3. Procesamiento de tejido FNA
   1. Coloque la jeringa que contiene las muestras de FNA (atrapadas en la aguja) sobre hielo.
   2. Separe la aguja (que contiene tejido FNA) de la jeringa y retire el émbolo de la jeringa, agregue entre 150 y 200 ml de HBSS^-/- a la parte superior de la jeringa.
   3. Vuelva a insertar el émbolo en la jeringa y la aguja (que contiene tejido FNA) y expulse el HBSS^-/- a través de la aguja en un tubo de giro de 1,5 ml. Este paso elimina el tumor FNA de la aguja.
   4. Repita el paso 2.3.3 con la suspensión HBSS^-/-/FNA dos veces utilizando la misma jeringa para maximizar la recuperación del tejido tumoral de la aguja.
   5. Agregue un volumen igual (-100–150 l) de matriz extracelular artificial al tubo de centrifugado de 1,5 ml que contiene la suspensión HBSS/FNA.
   6. Mezcle adecuadamente redibujando lentamente la suspensión artificial extracelular/HBSS^-/-/FNA en la aguja de 23 G y repitiendo dos veces.
   7. Dibuje toda la matriz extracelular artificial/HBSS^-/-/FNA volumen de nuevo en la jeringa, reemplace la aguja de 23 G con una aguja de 27 G, y la muestra FNA ya está lista para la inyección del ratón.

3. Implantación e inyección de tumores en ratones

1. Implantación de escisión quirúrgica o tejido de biopsia quirúrgica
   NOTA: Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos sean estériles mediante autoclave o el uso de instrumentos desechables preesterilizados.
   1. Afeitar el cabello de la parte inferior de la espalda de los ratones machos o hembras de la semana 6-8 de la semana dejando un área de aproximadamente 1,5 cm x 3 cm sin pelo. Anestesia los ratones usando isoflurano, y confirma apretando suavemente el pie como una prueba de capacidad de respuesta. Use pomada de veterinario en los ojos para evitar la sequedad.
   2. Coloque ratones individuales en una almohadilla de calor en el cono nasal de la máquina de anestesia, frote el área arasada con clorhexidina. A continuación, douse con 70% etanol y dejar evaporar.
   3. Preparar trozos o dividir lodos tumorales en una placa de Petri en montículos individuales para la implantación quirúrgica (es decir, en tres montículos iguales si se quiere implantar en 3 ratones).
   4. Usando la cuchilla del bisturí, haga una incisión de aproximadamente 5 mm de largo en el centro de la parte posterior del ratón, tome un par de fórceps y levante la piel en el lado de la incisión opuesta al operador.
   5. Tome las tijeras en la otra mano y separe la piel de la capa muscular cortando suavemente la membrana fascial con pequeños cortes de tijera, creando así un "bolsillo" para el tejido tumoral.
   6. Recoge un trozo tumoral o un montículo individual de tejido lodoteco tumoral con la cuchilla del bisturí y coloca suavemente el tejido en el bolsillo creado.
   7. Administrar 100 l de matriz extracelular artificial en el montículo de tejido tumoral en el bolsillo.
   8. Usando dos pares de fórceps, tire hacia arriba de la incisión en ambos extremos para que los bordes de la herida se acerquen y cierre la herida aplicando uno o dos clips de la herida.
   9. Inyección subcutánea 1-5 mg/kg meloxicam como analgésico en ratones después de la cirugía.
   10. Saque el ratón del cono de la nariz y colóquelo de nuevo en su jaula original, observe el ratón mientras se despierta. No vuelva a una jaula hasta que esté completamente recuperado.
   11. Retire los clips de la herida después de aproximadamente 7 días. Si la curación no está completa después de 7 días, deje el clip de la herida durante uno o dos días adicionales.
       NOTA: Si se utiliza una suspensión de una sola célula de la escisión quirúrgica o el procesamiento de tejido de biopsia quirúrgica, se mezclará con la matriz extracelular artificial (con una proporción de 1:1) para la inyección de ratones.
2. Inyección de FNA o tejido de biopsia de núcleo
   1. Coloque un ratón NSG en un estante de rejilla de acero, sostenga el ratón firmemente por la cola y tire suavemente del ratón hacia atrás. Agarrará la rejilla con sus patas delanteras firmemente. Alternativamente, limite un ratón en la mano no dominante y deje que el área del flanco sea visible.
   2. Desinfectar la piel del flanco con hisopos de preparación de alcohol, inyectar lenta y constantemente el contenido de la jeringa bajo la piel del ratón.
   3. Tire de la aguja y vuelva a colocar el ratón en su jaula.

4. Monitorear el crecimiento tumoral

1. Monitoree a los ratones una vez por semana para verificar si hay tumores palpables.
2. Una vez que los tumores estén enun tamaño medible (aproximadamente 50 mm 3), utilice una pinza para registrar las dimensiones del tumor. Utilice la siguiente fórmula para calcular los volúmenes tumorales: (ancho x ancho x largo) / 2.
3. Cosecha el tumor una vez que el volumen del tumor alcance alrededor de 1,5 cm³ (aproximadamente 4-10 semanas). El tumor ahora se llama pasaje del ratón 1 (MP1).

5. Cosecha de tumor para tejido bancario, reimplantación y experimento/caracterización

1. Euthanice el ratón en una cámara de CO 2, compruebe los signos vitales para confirmar la muerte y luego sumerja el ratón en una solución de Virkon para esterilizar la piel durante 30 s en el bio-cabina.
2. Usa tijeras curvas y fórceps quirúrgicos para levantar la piel adyacente al tumor y hacer un corte horizontal.
3. Utilice una técnica de separación contundente para movilizar la piel en ambos lados del tumor y sobre el tumor, exponiendo el tumor.
4. Usa tijeras o una cuchilla de bisturí para separar el tumor de la fascia.
5. Reseque el tumor y transfiera el tumor a una placa estéril de Petri, corte el tumor en trozos pequeños y extraiga el tejido necrótico del tumor.
6. Tejido tumoral bancario para futuras implantaciones.
   1. Tome 2-3 piezas pequeñas de tumores menores de 10 mm x 10 mm y picarlas en trozos de menos de 1 mm x 1 mm.
   2. Transfiera todo el tejido picado a un vial criogénico de 2 ml, agregue 1 ml de medio de congelación (10% DMSO + 90% FBS).
   3. Mezcle bien y coloque los viales criogénicos en un recipiente de congelación celular preenfriado a base de isopropanol sobre hielo seco.
   4. Almacene el recipiente en un congelador de -80 oC durante la noche y, a continuación, transfiera los viales criogénicos al almacenamiento de nitrógeno líquido (LN₂).
7. Tejido de congelación rápida para ensayos aguas abajo (RNASeq, WES, etc.).
   1. Coloque las piezas de tejido tumoral (3 mm x 3 mm) en un vial criogénico y coloque el vial criogénico en LN₂ inmediatamente. Almacene los viales en un congelador de -80 oC.

6. Ensayos de terapia con PDX

NOTA: Se necesitarán dos fases de expansión para crecer suficiente tejido tumoral para generar el número necesario de ratones portadores de PDX para el ensayo de terapia.

1. Recoja un criovial que contenga tejido PDX bancario de LN₂y coloque el criovial en un baño de agua de 37 oC hasta que el medio de congelación que contiene el tejido tumoral esté empezando a derretirse.
2. Vacíe el contenido del criovial en HBSS precalentado^-/- en un tubo de 50 ml y lave el tejido.
3. Tejido de pellet por centrifugación durante 5 min a 1.200 rpm.
4. Retire el HBSS^-/- de la muestra tumoral por aspiración al vacío con un pipeta Pasteur.
5. Deslice el tejido PDX del tubo de 50 ml en un plato Petri de 5 cm o 10 cm y colóquelo sobre hielo húmedo.
6. Siga el protocolo de implantación anterior para implantar tejido depositado de un vial criogénico en 5 ratones NSG para la primera ronda de expansión del tumor PDX.
7. Una vez que los tumores alcanzan los 600-800 mm³, cosechar 1-2 tumores para obtener una suspensión de una sola célula con el protocolo anterior para el procesamiento de tejido tumoral: disociación mecánica, procedimiento de disociación de digestión de la colagenasa.
8. Células de pelet y resuspend en 6 ml de matriz extracelular HBSS^-/-/artificial (relación 1:1), inyectar subcutánea 50 nsg ratones, con 100 l de mezcla celular por ratón para la segunda ronda de expansión del tumor PDX.
9. Mida el tamaño del tumor con pinzas quincenalmente.
10. Espere un tamaño de tumor de 100 mm³ en 3-5 semanas, aleatore los ratones en grupos e inicie el tratamiento.
11. Cuando el tamaño del tumor alcance el volumen máximo aprobado por la IACUC, interrumpa el tratamiento.
12. Siga el protocolo de tumor de cosecha anterior para recoger piezas de tumor congeladas, piezas tumorales para bloques de parafina.

Results

El tejido tumoral para modelos de PDX de melanoma puede provenir de una variedad de fuentes diferentes y también puede ser procesado según la dinámica de crecimiento de los modelos individuales y el uso deseado del tejido PDX. La prioridad a la hora de establecer un modelo PDX es tener material suficiente para el banco para su uso futuro y ADN para la caracterización (Figura 1).

Una vez que se deposita suficiente material, el tejido tumoral se puede expandir en un...

Discussion

Aquí hemos descrito la generación de modelos PDX de melanoma con tejido del paciente derivado de tumores primarios y metastásicos, biopsias básicas y FNAs. Cuando se injertan directamente en ratones NSG, los tumores presentan propiedades morfológicas, genómicas y biológicas similares a las observadas en el paciente. En el caso de que sólo una pequeña cantidad de tejido esté disponible para los investigadores, como ocurre a menudo con los FNAs, la técnica PDX permite la expansión del tejido tumoral para la caracterización...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (sin Ca++ o Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Tripsina	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL alícuotas almacenadas en – 20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Clorhexidina	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Colagenasa IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	maquillaje en HBSS-/- de colágeno IV en polvo (Worthington #4189, u/mg indicado en el frasco y varía con cada lote); congelar 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNasa	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (etilenglicol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N' Ácido N'-tetraacético)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicina	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurano	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Medios L15 de Leibovitz	Invitrogen	Gato # 21083027
Matrigel	Corning Gato	# 354230	Matriz extracelular artificial
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisición # ::Henry Schein	Gato #	025115 1-5mg/kg, como analgésico
NOD/SCID/receptor de IL2 nulo (NSG) Ratones	The Wistar Institute,	cría
PVA (alcohol polivinílico)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medio (Mod.) 1X con L-Glutamina	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Bisturí	Pluma Gato	# 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Pinzas para heridas	MikRon	Cat #427631