Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de melanoma

Resumen

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) recapitulan más robustamente las características moleculares y biológicas del melanoma y son más predictivos de la respuesta terapéutica en comparación con los ensayos tradicionales basados en el cultivo de tejido plástico. Aquí describimos nuestro protocolo operativo estándar para el establecimiento de nuevos modelos PDX y la caracterización/experimentación de los modelos PDX existentes.

Resumen

La evidencia acumulada sugiere que las propiedades moleculares y biológicas difieren en las células de melanoma cultivadas en los vasos tradicionales del cultivo de tejido bidimensional frente al in vivo en pacientes humanos. Esto se debe a la selección de cuellos de botella de las poblaciones clonales de células de melanoma que pueden crecer de forma robusta in vitro en ausencia de condiciones fisiológicas. Además, las respuestas a la terapia en cultivos de tejido bidimensional en general no reflejan fielmente las respuestas al tratamiento en pacientes con melanoma, y la mayoría de los ensayos clínicos no muestran la eficacia de las combinaciones terapéuticas que han demostrado ser eficaces en Vitro. Aunque la xenorendurecimiento de las células del melanoma en ratones proporciona el contexto fisiológico in vivo ausente de los ensayos de cultivo de tejido bidimensional, las células de melanoma utilizadas para el injerto ya han sido sometidas a una selección de cuellos de botella para las células que podrían crecer bajo condiciones bidimensionales cuando se estableció la línea celular. Las alteraciones irreversibles que se producen como consecuencia del cuello de botella incluyen cambios en las propiedades de crecimiento e invasión, así como la pérdida de subpoblaciones específicas. Por lo tanto, los modelos que recapitulan mejor la condición humana in vivo pueden predecir mejor las estrategias terapéuticas que aumentan eficazmente la supervivencia global de los pacientes con melanoma metastásico. La técnica de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) implica la implantación directa de células tumorales desde el paciente humano hasta un receptor de ratón. De esta manera, las células tumorales se cultivan constantemente bajo tensiones fisiológicas in vivo y nunca se someten al cuello de botella bidimensional, que preserva las propiedades moleculares y biológicas presentes cuando el tumor estaba en el paciente humano. Notablemente, los modelos PDX derivados de sitios de órganos de metástasis (es decir, cerebro) muestran una capacidad metastásica similar, mientras que los modelos PDX derivados de pacientes ingenuos de terapia y pacientes con resistencia adquirida a la terapia (es decir, terapia inhibidora BRAF/MEK) muestran sensibilidad similar a la terapia.

Introducción

Los modelos preclínicos son críticos para todos los aspectos de la investigación traslacional del cáncer, incluida la caracterización de la enfermedad, el descubrimiento de vulnerabilidades procesables exclusivas del cáncer frente a las células normales, y el desarrollo de terapias eficaces que exploten estas vulnerabilidades para aumentar la supervivencia global de los pacientes. En el campo del melanoma, decenas de miles de modelos de líneas celulares han sido muy utilizados para la detección de drogas, con >4,000 aportados por nuestro grupo solo (serie WMXXX). Estos modelos de líneas celulares se derivaron de pacientes con melanoma con diversas formas de melanoma c....

Protocolo

Los siguientes protocolos de animales siguen las pautas del comité de ética humana del Instituto Wistar y las pautas de cuidado animal.

1. Recogida de tejido tumoral de melanoma

1. Recoger el tejido tumoral (llamado paso 0) de pacientes con melanoma por uno de los siguientes métodos de cirugía o biopsia.
   1. Para el tejido quirúrgico de escisión, mantener un mínimo de 1 g de tejido (metástasis de resect y lesiones primarias) en medios de almacenamiento de transporte (RPMI 1640 + 0,1% de fungizona + 0,2% de gentamicina) a 4 oC o sobre hielo.
   2. Para el tejido de biopsia quirúrgica, mantenga menos de 1 g de tejido (a menudo....

Resultados

El tejido tumoral para modelos de PDX de melanoma puede provenir de una variedad de fuentes diferentes y también puede ser procesado según la dinámica de crecimiento de los modelos individuales y el uso deseado del tejido PDX. La prioridad a la hora de establecer un modelo PDX es tener material suficiente para el banco para su uso futuro y ADN para la caracterización (Figura 1).

Una vez que se deposita suficiente material, el tejido tumoral se puede expandir en un.......

Discusión

Aquí hemos descrito la generación de modelos PDX de melanoma con tejido del paciente derivado de tumores primarios y metastásicos, biopsias básicas y FNAs. Cuando se injertan directamente en ratones NSG, los tumores presentan propiedades morfológicas, genómicas y biológicas similares a las observadas en el paciente. En el caso de que sólo una pequeña cantidad de tejido esté disponible para los investigadores, como ocurre a menudo con los FNAs, la técnica PDX permite la expansión del tejido tumoral para la caracterización.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (sin Ca++ o Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Tripsina	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL alícuotas almacenadas en – 20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Clorhexidina	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Colagenasa IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	maquillaje en HBSS-/- de colágeno IV en polvo (Worthington #4189, u/mg indicado en el frasco y varía con cada lote); congelar 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNasa	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (etilenglicol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N' Ácido N'-tetraacético)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicina	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurano	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Medios L15 de Leibovitz	Invitrogen	Gato # 21083027
Matrigel	Corning Gato	# 354230	Matriz extracelular artificial
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisición # ::Henry Schein	Gato #	025115 1-5mg/kg, como analgésico
NOD/SCID/receptor de IL2 nulo (NSG) Ratones	The Wistar Institute,	cría
PVA (alcohol polivinílico)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medio (Mod.) 1X con L-Glutamina	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Bisturí	Pluma Gato	# 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Pinzas para heridas	MikRon	Cat #427631

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