Los aceleradores lineales clínicos se pueden utilizar para determinar los efectos biológicos de una amplia gama de tasas de dosis en las células cancerosas. Discutimos cómo establecer un acelerador lineal para ensayos basados en células y ensayos para células similares a tallos de cáncer cultivadas como tumoresferas en suspensión y líneas celulares cultivadas como cultivos adherentes.
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Artículo de método
Uso de un acelerador lineal para la realización de experimentos de radiobiología in Vitro
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Resumen
Resumen
La radioterapia sigue siendo una de las piedras angulares del tratamiento del cáncer. Para la mayoría de los cánceres, es la terapia no quirúrgica más eficaz para debulk tumores. Aquí, describimos un método para irradiar células cancerosas con un acelerador lineal. El avance de la tecnología de acelerador lineal ha mejorado la precisión y la eficiencia de la radioterapia. Los efectos biológicos de una amplia gama de dosis de radiación y dosis siguen siendo un área de investigación intensa. El uso de aceleradores lineales puede facilitar estos estudios utilizando dosis y dosis clínicamente relevantes.
Introducción
La radioterapia es un tratamiento eficaz para muchos tipos de cáncer1,2,3,4. La irradiación de tasa de dosis extra alta es relativamente nueva enradioterapia y es posible gracias a los recientes avances tecnológicos en aceleradores lineales 5. Las ventajas clínicas de la tasa de dosis extra alta sobre la irradiación de la tasa de dosis estándar incluyen un tiempo de tratamiento reducido y una mejor experiencia del paciente. Los aceleradores lineales también proporcionan un entorno clínico para los estudios de biología radiológica basados en cultivos celulares. Las implicaciones biológicas y terapéuticas de las dosis de radiación y las tasas dedosis han sido un foco de interés de los oncólogos y biólogos radioterápicos durante décadas 6,7,8. Sin embargo, la radiobiología de la irradiación de dosis extra alta y la irradiación de flash -una tasa de radiación de dosis extremadamente alta- aún no se ha investigado a fondo.
La irradiación de rayos gamma es ampliamente utilizada en la biología de la radiación basada en cultivos celulares9,10,11. La radiación se logra mediante rayos gamma emitidos por fuentes de isótopos radiactivos en descomposición, típicamente Cesium-137. El uso de fuentes radiactivas está altamente regulado y a menudo restringido. Con la irradiación basada en fuentes, es difícil probar una amplia gama de dosis, limitando su utilidad en el análisis de los efectos biológicos de las dosis clínicas alcanzables12.
Ha habido varios estudios que ilustran los efectos de dosis y dosis12,13,14,15,16,17. En estos estudios, se utilizaron tanto la irradiación gamma generada a partir de isótopos radiactivos como rayos X generados a partir de aceleradores lineales. Se utilizaron una variedad de líneas celulares que representan cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino, glioblastoma y melanoma. Los efectos de radiación sobre la supervivencia celular, la detención del ciclo celular, la apoptosis y el daño del ADN se evaluaron como lecturas12,13,14,15,16,17 . Aquí, describimos un método para definir los efectos biológicos de las dosis de radiación clínicamente relevantes y las tasas de dosis mediante la administración de radiación basada en rayos X mediante un acelerador lineal. Estos estudios deben realizarse con una estrecha colaboración entre el biólogo, el radioncólogo y el físico médico.
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Protocolo
1. Preparación celular para el cultivo celular de suspensión
- Cultivo de células similares a gliomas similares a células madre en medios de cultivo de células madre a aproximadamente 5 x 106 células/10 cm en una incubadora de cultivo celular con 5% de CO2,95% de humedad relativa a 37 oC.
NOTA: La condición de cultivo celular es la misma en todos los procedimientos. Los medios utilizados en el protocolo son medios completos. - Dos días antes de la irradiación programada, recoja las células similares al glioma de la placa de cultivo con una pipeta estéril de 5 ml en un tubo centrífugo de 15 ml en una campana de cultivo.
- Centrifugar las células recogidas a 200 x g durante 3 minutos en una centrífuga de encimera.
- Deseche el sobrenadante y digiere el pellet celular (alrededor de 1 x 107 células) con 1 ml de trippsina-EDTA a temperatura ambiente durante 5 minutos para hacer una suspensión de una sola célula en trippsina-EDTA. Agitar suavemente la parte inferior del tubo centrífugo cada 2 minutos durante la digestión para asegurarse de que las células se digieren a fondo.
- Agregue 3 ml de medios de cultivo de células madre (consulte la Tabla de materiales)para saciar la trippsina. Centrifugar las células recogidas a 200 x g durante 3 minutos en una centrífuga de contraparte. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet celular.
- Resuspenda las células con 5 ml de medios de cultivo celular y cuente las células con un hemocitómetro.
- Placa 5 x 106 células en dos placas de 10 cm que contienen 10 ml de medios de cultivo celular.
- Justo antes de la irradiación programada, recoja las células y deseche el sobrenadante después de la centrifugación como se describe en el paso 1.3. Vuelva a suspender el pellet celular con 5 ml de medios de cultivo celular. Transfiera 1 ml de suspensión celular a una placa de 35 mm que contenga 2 ml de medios de cultivo celular.
NOTA: El volumen total de los medios es de 3 ml en la placa de 35 mm para hacer el líquido de 1 cm de altura en la placa. - Transfiera las células chapadas en un recipiente secundario, como una caja de plástico o espuma, para reducir el riesgo de contaminación y llevar las células del recipiente a la instalación de irradiación del carro de servicios públicos.
- Irradiar las células como se describe en el paso 4.
2. Preparación celular para el cultivo celular adjunto
- Un día antes de la irradiación, en la capucha de cultivo celular, retire el medio DMEM de la placa de cultivo celular de la línea celular conectada, como las células HEK-293. El medio se puede succionar utilizando una pipeta Pasteur conectada a un vacío.
- Lave las células con 5 ml de PBS estéril a la placa de cultivo para enjuagar los medios residuales.
- Pipetear 1 ml de trippsina-EDTA en el plato de cultivo e inclinar suavemente el plato de cultivo para asegurarse de que todo el plato está cubierto con trippsin-EDTA.
- Pruebe las células a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Centrifugar las células recogidas a 200 x g durante 3 minutos en una centrífuga de contraparte. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet celular.
- Resuspenda las células con 5 ml de medios DMEM y cuente las células con un hemocitómetro.
- Placa 2 x 105 células en una placa de 35 mm utilizando 3 ml de medios de cultivo celular a una altura de 1 cm de medios.
- Después de 24 h de cultivo celular en la incubadora a 37 oC, transfiera las células chapadas en un recipiente secundario (es decir, una caja de espuma aislada) a la instalación de irradiación en un carro de servicios públicos.
- Irradiar células como se describe en el paso 4.
3. Preparación celular para inmunostaining tras la irradiación
- Descongelar la matriz de proteínas extracelulares comerciales en hielo a 4oC durante la noche. Preenfríe las puntas de pipeta de 200 ml y los tubos centrífugos de 1,5 ml a 4 oC durante la noche.
- Matriz proteica extracelular Aliquot con puntas de pipeta preenfriadas y tubos centrífugos de 1,5 ml a 200 ml por tubo.
- Diluir 200 l de matriz proteica extracelular en 20 ml pre-enfriados de medios de cultivo celular para hacer 1% medios de matriz de proteína extracelular.
- Coloque un cubreobjetos esterilizado (22 mm x 22 mm) en una placa de 35 mm. Coloque 400 s l de medios de matriz proteica extracelular del 1% en la cubierta.
- Coloque la placa de 35 mm en la incubadora de cultivo celular a 37 oC durante 1 h para permitir que la matriz proteica extracelular se polimerice en la cubierta.
- Cuando utilice el cultivo de células de suspensión, haga una suspensión de una sola célula como se describe en los pasos 1.1 a 1.5.
- Placa 5 x 104 células en un cubreobjetos recubiertos con matriz de proteína extracelular colocados en una placa de 35 mm. Devolver las células chapadas a la incubadora de cultivo celular durante la noche para asegurarse de que las células son apoyadas por la matriz proteica. El volumen total de los medios en la placa debe ser de 3 ml para hacer que la altura de los medios alcance 1 cm en el plato de cultivo.
- Observe las células bajo un microscopio de campo brillante con una lente objetivo de aumento de 10x. Las células deben extenderse en la cubierta en lugar de flotar. Transfiera el plato de cultivo con células chapadas a un recipiente secundario, como una caja de espuma, a la instalación de irradiación en un carro de servicios públicos e irradiar las células como se describe en el paso 4.
- Cuando utilice cultivos de celdas asociados (por ejemplo, células HEK-293), digera las celdas como se describe en los pasos 2.1 a 2.6. Coloque 5 x 104 células en un resbalón de cubierta estéril en una placa de 35 mm un día antes de la irradiación para asegurarse de que las células estén completamente unidas a la superficie de cubierta observándolas bajo un microscopio como en el paso 3.9. Utilice 3 ml de medios DMEM para hacer el líquido de 1 cm de altura en la placa.
- Después de cultivar células en cubreobjetos durante la noche o hasta un día, transfiera el plato de cultivo con células chapadas en un recipiente secundario a la instalación de irradiación. Se puede utilizar un carro de servicios públicos para reducir el riesgo de derrame. Irradiar células como se describe en el paso 4.
4. Irradiación con un acelerador lineal (LINAC)
- Usando el software de la consola del LINAC, ajuste el pórtico y el colimador del acelerador a 0o, abra las mordazas X e Y a un tamaño de campo simétrico de 20 x 20 cm2 y retraiga los colimadores multihoja (MLC) si están presentes.
NOTA: Los LINAC pueden tener un modo libre de filtro de aplanamiento (FFF), lo que permite tasas de dosis muy altas. Como su nombre indica, esta radiación no es uniforme (plana), y la alta tasa de dosis sólo se logra en el centro del haz. En este caso se utiliza un campo de 7 x 7 cm 2. - Coloque al menos 5 cm de material equivalente al agua en el sofá de tratamiento. Coloque el plato de celda para irradiarlo a 400 MU/min (tasa de dosis estándar) sobre el material equivalente al agua y céndelo en el punto de mira de LINAC.
- Coloque las células a irradiar a una profundidad de dosis máxima en un haz de rayos X de 6 MV, alrededor de 1,5 cm. Coloque 1 cm adicional de material equivalente al agua encima del plato. Combinado con los 1 cm de medio a lo largo del cual se suspenden las células, esto coloca las células a una profundidad media de 1,5 cm.
- Fije el puntero frontal a la cabeza del LINAC. Extienda el puntero frontal hasta que entre en contacto con la superficie del material de acumulación y anote la distancia. Ajuste la altura de la mesa hasta que la distancia desde la fuente hasta la superficie de acumulación sea de 100 cm.
NOTA: La distancia se puede confirmar con el indicador de distancia óptica. Alternativamente, el indicador de distancia óptica se puede utilizar en lugar del puntero frontal para establecer la fuente a la superficie de acumulación en 100 cm. - Calcule el número adecuado de unidades de monitor (MU) para administrar la dosis deseada de radiación a las células y programe el acelerador para que se entregue a 400 MU/min.
NOTA: Para la configuración de distancia de origen a superficie (SSD) en un LINAC calibrado para entregar 1 cGy/MU a la profundidad de la dosis máxima, el número requerido de unidades de monitor se calcula utilizando MU - Dosis (cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20), donde OF significa factor de salida. Este cálculo tendrá que ser alterado para LINACs utilizando configuraciones de calibración alternativas. - Salga de la bóveda de tratamiento y verifique que todas las demás personas hayan salido. Vrifify que no hay otras células en la habitación, o recibirán dosis bajas de radiación. Cierre la puerta de la bóveda.
- Confirme el tamaño del campo, MU y MU/min en la consola y, a continuación, habilite la viga.
- Repita los pasos 4.3-4.8 para que las células se irradian a tasas de dosis más altas o más bajas.
- Para lograr tasas de dosis más altas (por ejemplo, 2100 MU/min o superior) con el acelerador, disminuya el SSD con el fin de aumentar la tasa de dosis efectiva a las células de acuerdo con la ley cuadrada inversa: DoseRateEffective - Dosisa * (100 cm / SSD_New)2.
- Para bajas tasas de dosis (por ejemplo, 20 MU/min), aumente la fuente a la distancia superficial (SSD_New) para disminuir la tasa de dosis. Por ejemplo, el plato de cultivo celular se puede colocar en el suelo de la sala de tratamiento.
- Vuelva a calcular la configuración de la unidad de monitor en el acelerador si esta configuración es necesaria, utilizando MU - Dosis (cGy) / (1 cGy/MU) / OF(20x20)/ (100 cm / SSD_New)2. Para obtener información adicional sobre los cálculos MU, consulte referencia de McDermott y Orton18.
- Determinar la tasa de dosis en Gy/minuto por DoseRate(Gy/Min) - Dosis (Gy)*(MU/min)/MU. por ejemplo, 4 Gy entregado a 400 MU/min requiere 380 MU, por lo que 4* 400/380 a 4,2 Gy/min. Véase el Cuadro 1.
Figura 1 : Configuración del plato de cultivo celular en el acelerador lineal. (A) Se muestra un acelerador lineal clínico. (B) 5 cm de material equivalente al agua se coloca en el sofá de tratamiento. (C) Se coloca un plato de cultivo celular en la superficie del material. (D) El plato se centra utilizando el punto de mira del acelerador en el campo de tratamiento mostrado por el campo de luz cuadrada. (E) 1 cm de material equivalente al agua se coloca en la parte superior de la placa de cultivo celular. La distancia de origen a superficie (SSD) se comprueba mediante un indicador de distancia óptica (F, G) o un puntero frontal (H, I). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Ensayos biológicos después de la irradiación
- Después de la irradiación, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular de la misma manera que se describió anteriormente (paso 1.9, 2.8 y 3.10).
- Según sea necesario, adapte una variedad de ensayos biológicos para encajar en el proyecto de investigación.
NOTA: Aquí, mostramos un análisis representativo del ciclo celular16 como ejemplo de un ensayo biológico después de la irradiación.
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Resultados
Para investigar el efecto del ciclo celular de la dosis estándar y la irradiación de la tasa de dosis extra alta por un acelerador lineal, se prepararon tres muestras de células similares a los tallos de glioma utilizando este protocolo y se recogieron 24 horas después de la irradiación17:una muestra de control que no se irradiaron (Figura2A), una muestra irradiada con 400 MU/min (unidad de monitor, tasa de dosis estándar de 4,2 Gy/min,
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Discusión
La radioterapia es una parte integral del manejo del cáncer. Los esfuerzos en curso buscan mejorar la eficacia y eficiencia del tratamiento con radiación. Los avances en la tecnología de aceleradores lineales han brindado la oportunidad de tratar a los pacientes con una precisión y seguridad sin precedentes. Debido a que la mayoría de los pacientes son tratados con rayos X de alta energía de aceleradores lineales, los estudios que examinan los efectos biológicos de una amplia gama de tasas de dosis realizadas en acelerad...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Departamento de Oncología Radioterápica de la Clínica Cleveland por el uso de los aceleradores lineales. Agradecemos al Dr. Jeremy Rich por su generoso don de células similares a los tallos de glioma. Esta investigación fue apoyada por la Clínica Cleveland.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| glioma similar a un glioma 387 | regalo del Dr. Jeremy Rich | ||
| 293 células | ATCC | CRL-1573 | |
| medios de cultivo de células madre neuronales | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Medios NeurobasalTM |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Proteína EGF humana recombinante | R& D Systems | 236-EG-01M | |
| FGF humano recombinante básico | R& D Sistemas | 4114-TC-01M | |
| B-27 y comercio; Suplemento | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Piruvato de sodio | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030164 | |
| Tripsin-EDTA | Thermo Fisher 25200056 | ||
| matriz de proten extracelular | Corning | 354277 | MatrigelTM |
| Etanol | Fisher químico | A4094 | |
| Equipo | |||
| 10 cm placa de cultivo celular | Denville | T1110 | |
| 3,5 cm placa de cultivo celular | USA Scientific Inc. | CC7682-3340 | |
| Cubierta de vidrio de 22x22 mm Deslizamiento | de microscopía electrónica Sciences | 72210-10 | |
| Tubo de centrífuga de 15 ml | Thomas Scientific | 1159M36 | |
| Tubo de centrífuga de 50 ml | Thomas Scientific | 1158R10 | |
| Pipeta de 5 ml | Fisher Scientific | 14-955-233 | |
| ayuda para pipetas | Fisher Scientific | 13-681-06 | |
| Mezclador de vórtice | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5810R | |
| Acelerador lineal | Varian | n/a | |
| agua | Sun Nuclear corporation | 557 | Agua sólidaTM |
| Preparación de reactivos | |||
| DMEM media | 10% suero fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina G, 100 y micro; g/mL de estreptomicina en 500 ml de DMEM medio | ||
| cultivo de células madre | 10 ml B27 suplemento, 20 & g hFGF, 20 y micro; g hEGF, 2 mM L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina G, 100 y micro; g/mL de estreptomicina en 500 ml de medios |
Referencias
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Stupp, R., et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. The Lancet Oncology. 10 (5), 459-466 (2009).
- Tao, R., et al. Hypoxia imaging in upper gastrointestinal tumors and application to radiation therapy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1044-1053 (2018).
- Gajiwala, S., Torgeson, A., Garrido-Laguna, I., Kinsey, C., Lloyd, S. Combination immunotherapy and radiation therapy strategies for pancreatic cancer-targeting multiple steps in the cancer immunity cycle. Journal of Gastrointestinal Oncology. 9 (6), 1014-1026 (2018).
- Liney, G. P., Whelan, B., Oborn, B., Barton, M., Keall, P. MRI-Linear accelerator raiotherapy systems. Clinical Oncology Journal | The Royal College of Radiologists. 30 (11), 686-691 (2018).
- Hall, E. J. Radiation dose-rate: a factor of importance in radiobiology and radiotherapy. The British Journal of Radiology. 45 (530), 81-97 (1972).
- Steel, G. G., et al. The dose-rate effect in human tumour cells. Radiotherapy & Oncology. 9 (4), 299-310 (1987).
- Ling, C. C., Gerweck, L. E., Zaider, M., Yorke, E. Dose-rate effects in external beam radiotherapy redux. Radiotherapy & Oncology. 95 (3), 261-268 (2010).
- Castro, G., et al. Amotosalen/UVA treatment inactivates T cells more effectively than the recommended gammadose for prevention of transfusion-associated graft-versus-host disease. Transfusion. 58 (6), 1506-1515 (2018).
- Gaddini, L., et al. Exposing primary rat retina cell cultures to γ-rays: An in vitro model for evaluating radiation responses. Experimental Eye Research. 166, 21-28 (2018).
- Simara, P., et al. DNA double-strand breaks in human induced pluripotent stem cell reprogramming and long-term in vitro culturing. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 73(2017).
- Wang, Z., et al. A comparison of the biological effects of 125I seeds continuous low-dose-rate radiation and 60Co high-dose-rate gamma radiation on non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 10 (8), 0133728(2015).
- Lasio, G., Guerrero, M., Goetz, W., Lima, F., Baulch, J. E. Effect of varying dose-per-pulse and average dose rate in X-ray beam irradiation on cultured cell survival. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (4), 671-676 (2014).
- Karan, T., et al. Radiobiological effects of altering dose rate in filter-free photon beams. Physics in Medicine and Biology. 58 (4), 1075-1082 (2013).
- Sarojini, S., et al. A combination of high dose rate (10X FFF/2400 MU/min/10 MV X-rays) and total low dose (0.5 Gy) induces a higher rate of apoptosis in melanoma cells in vitro and superior preservation of normal melanocytes. Melanoma Research. 25 (5), 376-389 (2015).
- Hao, J., et al. The effects of extra high on glioma stem-like cells. PLoS One. 13 (8), 0202533(2018).
- Liu, J., et al. Radiation-induced G2/M arrest rarely occurred in glioblastoma stem-like cells. International Journal of Radiation Biology. 94 (4), 394-402 (2018).
- Mcdermott, P., et al. The Physics and Technology of Radiation Therapy. , Medical Physics Pub Corp. Madison WI. (2010).
- Lohse, I., et al. Effect of high dose per pulse flattening filter-free beams on cancer cell survival. Radiotherapy & Oncology. 101 (1), 226-232 (2011).
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