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Artículo de método

Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

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DOI:

10.3791/59519

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16 de mayo de 2019

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1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Las líneas celulares cultivadas primarias o establecidas se utilizan comúnmente para abordar las cuestiones biológicas y mecanicistas fundamentales como un enfoque inicial antes de usar modelos animales. Este protocolo describe cómo preparar extractos celulares enteros y fracciones subcelulares para estudios de zinc (Zn) y otros oligoelementos con espectroscopía de absorbancia atómica.

Resumen

Los metales de transición son micronutrientes esenciales para los organismos, pero pueden ser tóxicos para las células a altas concentraciones al competir con los metales fisiológicos en las proteínas y generar estrés redox. Las afecciones patológicas que conducen a la depleción o acumulación de metales son agentes causales de diferentes enfermedades humanas. Algunos ejemplos incluyen anemia, Acrodermatitis enteropatica, y las enfermedades de Wilson y Menkes. Por lo tanto, es importante poder medir los niveles y el transporte de metales de transición en muestras biológicas con alta sensibilidad y precisión con el fin de facilitar la investigación explorando cómo estos elementos contribuyen a las funciones fisiológicas normales y Toxicidad. El zinc (Zn), por ejemplo, es un cofactor en muchas proteínas de mamíferos, participa en eventos de señalización, y es un mensajero secundario en las células. En exceso, Zn es tóxico y puede inhibir la absorción de otros metales, mientras que en el déficit, puede conducir a una variedad de condiciones potencialmente letales.

La espectroscopía de absorción atómica del horno de grafito (GF-AAS) proporciona un método altamente sensible y eficaz para determinar la concentración de Zn y otras concentraciones de metales de transición en muestras biológicas diversas. La atomización electrotérmica mediante GF-AAS cuantifica los metales mediante la atomización de pequeños volúmenes de muestras para el posterior análisis selectivo de la absorción mediante la longitud de onda de la excitación del elemento de interés. Dentro de los límites de la linealidad de la ley de la cerveza-Lambert, la absorbancia de la luz por el metal es directamente proporcional a la concentración del analito. En comparación con otros métodos de determinación del contenido de Zn, GF-AAS detecta tanto el Zn en las proteínas libres como los complejados y posiblemente en pequeñas moléculas intracelulares con alta sensibilidad en pequeños volúmenes de muestras. Por otra parte, GF-AAS es también más fácilmente accesible que la espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o fluorescencia de rayos X basada en sincrotrón. En este método, se describe la preparación sistemática de muestras de diferentes líneas celulares cultivadas para análisis en un GF-AAS. Las variaciones en este oligoelemento se compararon tanto en los lisados celulares enteros como en las fracciones subcelulares de células proliferantes y diferenciadas como prueba de principio.

Introducción

La transición y los metales pesados, como Zn, Cu, Mn y fe, se encuentran de forma natural en el medio ambiente, tanto en nutrientes como en alimentos y contaminantes. Todos los organismos vivos requieren diferentes cantidades de estos micronutrientes; sin embargo, la exposición a niveles elevados es perjudicial para los organismos. La adquisición de metal es principalmente a través de la dieta, pero los metales también pueden ser inhalados o absorbidos a través de la piel1,2,3,4,5. Es importante señalar que la presencia de metales en las partículas atmosféricas está aumentando y se ha asociado en gran medida a los riesgos para la salud. Debido a las actividades antropogénicas, se han detectado niveles crecientes de metales pesados como AG, como, CD, CR, Hg, ni, fe y Pb en las partículas atmosféricas, el agua de lluvia y el suelo6,7. Estos metales tienen el potencial de competir con oligoelementos fisiológicos esenciales, particularmente Zn y fe, e inducen efectos tóxicos al inactivar las enzimas fundamentales para los procesos biológicos.

El oligoelemento Zn es redox neutro y se comporta como un ácido Lewis en las reacciones biológicas, lo que lo convierte en un cofactor fundamental necesario para la actividad de plegado y catalítico de proteínas en más del 10% de las proteínas de mamíferos8,9, 10; en consecuencia, es esencial para las diversas funciones fisiológicas8,11. Sin embargo, como muchos oligoelementos, hay un delicado equilibrio entre estos metales facilitando la función fisiológica normal y causando toxicidad. En los mamíferos, las deficiencias de Zn conducen a anemia, retraso del crecimiento, hipogonadismo, anomalías de la piel, diarrea, alopecia, trastornos del gusto, inflamación crónica, y las funciones inmunes y neurológicas deterioradas11,12, 13,14,15,16,17,18. En exceso, el Zn es citotóxico y perjudica la absorción de otros metales esenciales como el cobre19,20,21.

Además, algunos metales como Cu y fe tienen el potencial de participar en reacciones dañinas. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de Fenton química puede interferir con el montaje de proteínas de racimo de azufre de hierro y alterar el metabolismo lipídico22,23,24. Para evitar este daño, las células utilizan chaperones de unión metálica y transportadores para prevenir efectos tóxicos. Sin lugar a dudas, la la homeostasis metálica debe controlarse estrechamente para garantizar que los tipos celulares específicos mantengan los niveles adecuados de metales. Por esta razón, hay una necesidad significativa de avanzar técnicas para la medición precisa de trazas de metales en muestras biológicas. En los organismos en desarrollo y maduros existe una necesidad biológica diferencial para oligoelementos a nivel celular, en diferentes etapas de desarrollo, y en condiciones normales y patológicas. Por lo tanto, la determinación precisa de los niveles de tejido y del metal sistémico es necesaria para entender la homeostasis del metal organismal.

La espectrometría de absorción atómica del horno de grafito (GF-AAS) es una técnica altamente sensible utilizada para pequeños volúmenes de muestras, por lo que es ideal para medir la transición y metales pesados presentes en muestras biológicas y medioambientales25,26 , 27 , 28. por otra parte, debido a la alta sensibilidad de la técnica, se ha demostrado que es adecuada para el estudio de las propiedades de transporte fino de na+/k+-ATPasa yH+/k-ATPasa gástrica ovocitos como un sistema modelo29. En GF-AAS, los elementos atomizados dentro de una muestra absorben una longitud de onda de la radiación emitida por una fuente de luz que contiene el metal de interés, con la radiación absorbida proporcional a la concentración del elemento. La excitación electrónica elemental tiene lugar tras la absorción de la radiación ultravioleta o visible en un proceso cuantizado único para cada elemento químico. En un solo proceso de electrones, la absorción de un fotones implica un electrón que se mueve desde un nivel de energía más bajo al nivel más alto dentro del átomo y GF-AAS determina la cantidad de fotómetros absorbidos por la muestra, que es proporcional al número de radiación que absorbe elementos atomizados en el tubo de grafito.

La selectividad de esta técnica se basa en la estructura electrónica de los átomos, en el que cada elemento tiene una línea espectral de absorción/emisión específica. En el caso de Zn, la longitud de onda de absorbancia es de 213,9 NM y se puede distinguir con precisión de otros metales. En general, GF-AAS se puede utilizar para cuantificar Zn con límites adecuados de detección (LOD) y alta sensibilidad y selectividad25. Los cambios en la longitud de onda absorbida se integran y se presentan como picos de absorción de energía en longitudes de onda específicas y aisladas. La concentración del Zn en una muestra determinada se calcula generalmente a partir de una curva estándar de concentraciones conocidas según la ley cerveza-Lambert, en la que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de Zn en la muestra. Sin embargo, aplicar la ecuación de Beer-Lambert a los análisis de GF-AAS también presenta algunas complicaciones. Por ejemplo, las variaciones en la atomización y/o concentraciones no homogéneas de las muestras pueden afectar las mediciones de metal.

La atomización metálica necesaria para el análisis elemental de trazas GF AAS consta de tres pasos fundamentales. El primer paso es la desolvación, donde se evada el disolvente líquido; dejando compuestos secos después de que el horno alcanza una temperatura de alrededor de 100 ° c. Luego, los compuestos se vaporizan calentándolos de 800 a 1.400 ° c (dependiendo del elemento a analizar) y convertirse en un gas. Finalmente, los compuestos en estado gaseoso se atomizan con temperaturas que oscilan entre 1.500 y 2.500 ° c. Como se discutió anteriormente, el aumento de las concentraciones de un metal de interés representará aumentos proporcionales en la absorción detectada por el GF-AAS, sin embargo, el horno reduce el rango dinámico de análisis, que es el rango de trabajo de las concentraciones que se pueden determinado por el instrumento. Por lo tanto, la técnica requiere bajas concentraciones y una cuidadosa determinación del rango dinámico del método mediante la determinación del LOD y el límite de linealidad (LOL) de la ley Beer-Lambert. El LOD es la cantidad mínima requerida para detectar una sustancia, definida como tres veces la desviación estándar de Zn en la matriz. El LOL es la concentración máxima que se puede detectar utilizando la ley de cerveza-Lambert.

En este trabajo, describimos un método estándar para analizar los niveles de Zn en extractos celulares enteros, fracciones citoplásmicas y nucleares, y en células cultivadas proliferantes y diferenciadoras (figura 1). Adaptamos el rápido aislamiento del Protocolo de núcleos a diferentes sistemas celulares para evitar la pérdida de metal durante la preparación de la muestra. Los modelos celulares utilizados fueron myoblastos primarios derivados de las células del satélite del ratón, células del neuroblastoma murino (N2A o Neuro2A), murino 3T3 L1 adipocitos, una línea de células epiteliales de mama no tumorigénica humana (MCF10A), y el riñón canino de Madin-Darby epitelial ( MDCK). Estas células se establecieron a partir de diferentes linajes y son buenos modelos para investigar variaciones específicas del linaje de los niveles de metal in vitro.

Las mioblastos primarias derivadas de las células satélite del ratón constituyen un modelo in vitro muy adecuado para investigar la diferenciación del músculo esquelético. La proliferación de estas células es rápida cuando se cultiva en condiciones séricas elevadas. La diferenciación en el linaje muscular se induce entonces por las condiciones séricas bajas30. El neuroblastoma murino (N2A) estableció la línea celular se derivó de la cresta neural del ratón. Estas células presentan morfología neuronal y de células madre amoeboides. Al estímulo de diferenciación, las células N2A presentan varias propiedades de las neuronas, como los neurofilamentos. N2A células se utilizan para investigar la enfermedad de Alzheimer, neurita outgrowth, y neurotoxicidad31,32,33. El 3T3-L1 murino pre-adipocitos establecido línea celular se utiliza comúnmente para investigar los cambios metabólicos y fisiológicos asociados con la adipogénesis. Estas células presentan una morfología de fibroblastos, pero una vez estimuladas para la diferenciación, presentan activación enzimática asociada con la síntesis de lípidos y la acumulación de triglicéridos. Esto se puede observar como cambios morfológicos para producir gotas de lípidos citoplásmicos34,35. MCF10A es una línea de células epiteliales mamarias no tumorales derivada de una mujer premenopáusica con enfermedad fibroquística mamaria36. Ha sido ampliamente utilizado para los estudios bioquímicos, moleculares, y celulares relacionados con la carcinogénesis mamaria como la proliferación, migración celular, y la invasión. La línea celular epitelial del riñón de Madin-Darby (MDCK) se ha utilizado extensivamente para investigar las propiedades y los eventos moleculares asociados con el establecimiento del fenotipo epitelial. Al llegar a la confluencia, estas células se polarizan y establecen adherencias de células celulares, características de los tejidos epiteliales de mamíferos37.

Para probar la capacidad de AAS para medir los niveles de Zn en células de mamíferos, analizamos fracciones enteras y subcelulares (citosol y núcleo) de estas cinco líneas celulares. Las mediciones de AAS mostraron diferentes concentraciones de Zn en estos tipos de células. Las concentraciones fueron menores en la proliferación y diferenciación de las mioblastos primarias (4 a 7 nmol/mg de proteína) y superiores en las cuatro líneas celulares establecidas (que oscilan entre 20 y 40 nmol/mg de proteína). Se detectó un pequeño aumento no significativo en los niveles de Zn en la diferenciación de las células mioblastos primarias y del neuroblastoma en comparación con las células proliferantes. El efecto opuesto se detectó en adipocitos diferenciados. Sin embargo, proliferando células 3T3-L1 mostraron concentraciones más altas del metal en comparación con las células diferenciadas. Es importante destacar que, en estas tres líneas celulares, el fraccionamiento subcelular demostró que Zn se distribuye de forma diferencial en el citosol y el núcleo de acuerdo con el estado metabólico de estas células. Por ejemplo, en mioblastos proliferantes, células N2A y preadipocitos 3T3-L1, la mayoría del metal se localiza en el núcleo. Tras la inducción de la diferenciación utilizando tratamientos celulares específicos, Zn localizada en el citosol en estos tres tipos de células. Curiosamente, ambas líneas celulares epiteliales mostraron niveles más altos de Zn durante la proliferación en comparación con al alcanzar la confluencia, en el que se formó una monocapa ajustada característica. En las células epiteliales proliferantes, la línea de células mamarias MCF10A tenía una distribución de Zn igual entre el citosol y el núcleo, mientras que en la línea celular derivada del riñón, la mayor parte del metal se encontraba en el núcleo. En estos dos tipos celulares, cuando las células alcanzaron la confluencia, Zn se encontraba predominantemente en el citosol. Estos resultados demuestran que GF-AAS es una técnica altamente sensible y precisa para realizar análisis elementales en muestras de bajo rendimiento. GF-AAS junto con fraccionamiento subcelular y puede ser adaptado para investigar los niveles de oligoelementos metálicos en diferentes líneas celulares y tejidos.

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Protocolo

1. cultivo celular de mamíferos

  1. Consideraciones generales
    1. Siga las técnicas asépticas para el cultivo celular de mamíferos previamente revisados38.
    2. Mantener todas las líneas celulares en una incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c. Las condiciones de cultivo celular varían para cada tipo de célula. Es importante mantener las condiciones de cultivo apropiadas para cada línea celular utilizada, ya que las variaciones de estos procedimientos conduciarán a fenotipos aberrantes y al fracaso del cultivo celular.
    3. Asegure el conocimiento con la línea celular de interés, y siga los protocolos proporcionados para cada tipo de célula seleccionada para los experimentos específicos (vea algunos ejemplos abajo).
  2. Procedimiento general para la tripsinización y el paso de las células adherentes
    1. Retire el medio de cultivo celular de la placa de cultivo por aspiración.
    2. Lavar las células suavemente utilizando PBS sin calcio y magnesio (5 mL por cada 10 cm2 área de superficie de cultivo). Agregue la solución de lavado al costado de la placa para evitar separar la monocapa celular; remolino la placa para maximizar la cobertura de la solución. Para las células epiteliales, es necesario incubar las células durante 10 a 15 min en la incubadora a 37 ° c en PBS para facilitar la disociación de las células en los siguientes pasos.
    3. Retire la solución de lavado por aspiración.
    4. Añadir suficiente reactivo de disociación (0,25% de tripsina) a la placa (aproximadamente 0,7 mL por 10 cm2). Gire suavemente la placa para obtener una cobertura completa de la monocapa celular.
    5. Incubar la cultura a temperatura ambiente durante 2 a 5 min. El tiempo de incubación real varía con la línea celular utilizada, en el caso de las células epiteliales se recomienda incubar durante 10 a 15 min en la incubadora a 37 ° c. Observe las células bajo el microscopio para el desprendimiento de células.
    6. Cuando la mayoría de las células se han desprendido, recuperar la suspensión celular en 5 mL del recubrimiento pre-calentado o medio de crecimiento (ver más abajo para algunos ejemplos). Disociar mecánicamente los grumos de las células pipeteando sobre la monocapa celular varias veces.
    7. Transfiera la suspensión de la célula a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue a 1.000 x g durante 2 a 5 min. La velocidad de centrifugación y el tiempo varían en función del tipo de célula. Retire los medios por aspiración suave, teniendo cuidado de no tocar el pellet de la célula. Resuspenda el pellet de células en 5 a 10 mL del medio de crecimiento pre-calentado adecuado y extraiga una muestra para contar con un hemociómetro o un contador de células automático.
    8. Utilice el volumen adecuado de la suspensión celular para sembrar la densidad recomendada para cada línea celular específica (vea a continuación algunos ejemplos). Complementar con el volumen adecuado de medios de cultivo de acuerdo con el tamaño del plato de cultivo y colocar las células de nuevo en la incubadora.
  3. Myoblastos primarios derivado de las células satélite del ratón
    1. Antes de comenzar, Prepare placas recubiertas de colágeno para el crecimiento primario de myoblast. Una solución que contiene 0,02% de colágeno y 0,05 M de ácido acético en agua desionizada debe esterilizarse mediante filtración con un dispositivo de filtro estéril de 0,22 μm. Incubar las placas de cultivo con la solución de colágeno durante la noche a 37 ° c.
    2. Al día siguiente, aspirar la solución de colágeno, dejar secar las placas en el gabinete estéril y almacenar a 4 ° c hasta su uso.
      Nota: los volúmenes mínimos de colágeno son: para 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Semillas de mioblastos primarios a 1 x 104 células/cm2 en 55 cm2 placas de cultivo recubiertas de colágeno. Los medios de proliferación son el medio de cultivo de la mezcla de nutrientes F12 de Dulbecco (DMEM)/Ham, que contiene un 20% de suero bovino fetal (FBS), 25 ng/mL de factor de crecimiento fibroblástico básico recombinante (FGF) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
      Nota: las células proliferantes y de stock deben mantenerse por debajo del 50% de la confluencia. El contacto celular induce el compromiso de las células a la diferenciación miogénica y perjudica las capacidades de crecimiento de la cultura.
    4. Para diferenciar las mioblastos primarias, permita que las células alcancen el 80% a 100% de confluencia, que normalmente ocurre después de 48 h de chapado. Luego, cambiar a medios de diferenciación (DMEM, 2% suero de caballo, 1% de insulina, transferrina, selenio un suplemento, y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina). Refresque los medios diariamente hasta la cosecha.
  4. Neuroblastoma murino (N2A)
    1. Placa N2A células a una densidad de 2 x 104 células/cm2 en medios de crecimiento, que contiene una mezcla de medio suero reducido/DMEM que contiene alta glucosa y L-glutamina (1:1, v:v), suplemento con 10% FBS y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Mantener la cultura bursátil bajo 50% confluencia.
    2. Inducir la diferenciación de células N2A una vez confluencia alcanzó 25% a 40%. Cambio a los medios de diferenciación que contengan una mezcla de medio suero reducido/DMEM, 1% de FBS y 20 μM de ácido retinoico durante 7 a 10 días. Refresque los medios cada otro día hasta la cosecha celular.
      Nota: como las células N2A diferencian, algunas células se vuelven redondas, se separan fácilmente, y pueden someterse a la apoptosis. Tenga cuidado al aspirar y agregar el medio de cultivo a las placas.
  5. 3T3 L1 murinos pre-adipocitos
    1. Mantener el ratón 3T3/L1 células en DMEM con alta glucosa, complementado con 10% FBS y 100 U/mL de penicilina/streptomicina. El proceso adipogénico depende de la confluencia de las células; por lo tanto, no deje que la cultura de la acción crezca más de 50% confluencia, como mayor confluencia perjudicará la capacidad de las células para diferenciar.
    2. Placas de las células a 2 x 104 células/cm2. A esta densidad, las células llegarán a la confluencia en 3 días.
    3. Inducir la diferenciación adipogénica dos días después de que las células alcancen el 100% de la confluencia. Los medios de inducción consisten en DMEM que contiene 10% de FBS, 10 μg/mL de insulina, 0,5 mM 3-isobutilo-1-metixantina, 1 μM de dexametasona y 10 μM de troglitazona.
    4. Reemplace los medios de inducción después de la incubación de 48 h a los medios de diferenciación (DMEM que contiene 10% de FBS y 5 μg/mL de insulina). Refresque los medios cada otro día hasta la cosecha. Muestras representativas de la diferenciación total se recogen normalmente entre 7 y 10 días después de la inducción adipogénica.
      Nota: a medida que la adipogénesis progresa, las células se vuelven redondas y tienden a desprenderse fácilmente. Tenga cuidado al aspirar y agregar el medio de cultivo a las placas.
  6. MCF10A celdas
    1. Placas MCF10A células en DMEM/F12 (1:1, v:v), complementadas con 5% de FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 10 μg/mL de insulina y 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF). La densidad de siembra recomendada es de 1 x 105 células/cm2. En estas condiciones, las células alcanzarán un 100% de confluencia en un plazo de 4 días. Refresque los medios cada 2 a 3 días hasta la cosecha.
      Nota: las celdas MCF10A son difíciles de separar. Se recomienda incubar las células durante 10 a 15 min a 37 ° c en PBS libre de calcio con 0,5 mM EDTA antes de la tripsinización.
  7. Células de riñón canina Madin-Darby (MDCK)
    1. Células de placas MDCK en DMEM complementadas con 10% de FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. La densidad de siembra recomendada es de 1 x 105 células/cm2, donde las células alcanzarán un 100% de confluencia en 3 días. Refresque los medios cada 2 días hasta la cosecha.
      Nota: las células MDCK son difíciles de separar. Se recomienda incubar las células durante 5 a 10 min a 37 ° c en PBS libre de calcio y magnesio antes de la tripsinización. Para evitar la aglomeración de células, no agitar las placas golpeando o sacudiendo el matraz mientras espera a que las células se separen.

2. preparación de muestras de cultivo celular de mamíferos para AAS: fraccionamiento de células enteras y subcelulares

  1. Cultivo de las células de interés en 55 cm2 placas. El uso de placas de cultivo más pequeñas puede producir muestras con niveles de metales bajo los límites de detección del GF-AAS.
  2. Extracto de células enteras
    1. Aspiran los medios de cultivo utilizando una trampa de vacío. Asegúrese de eliminar todos los rastros de los medios. Enjuague las células de los puntos de tiempo deseados o las condiciones de cultivo tres veces con PBS helada y libre de calcio y magnesio.
    2. Raspe inmediatamente las células de la placa utilizando un nuevo raspador de células plásticas en 1 mL de PBS libre de calcio y magnesio. Transferir la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugar durante 2 min a 2.000 x g y aspirar el sobrenadante. El protocolo se puede pausar aquí. Almacene muestras de pellets a-20 ° c o proceda al paso 2,4.
  3. Fraccionamiento subcelular
    1. Aspiran los medios de cultivo utilizando una trampa de vacío. Asegúrese de eliminar todos los rastros de los medios. Enjuague las células de los puntos de tiempo deseados o las condiciones de cultivo tres veces con PBS helada y libre de calcio y magnesio. Raspe las células de la placa con 1 mL de PBS helada y libre de calcio y magnesio.
    2. Transfiera las muestras a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y manténgase en hielo. Centrifugar por 10 s a 10.000 x g. Continuar el aislamiento rápido de los núcleos si se desea el análisis de metales de fracciones citoplásmicas y nucleares. Este procedimiento minimizará la pérdida potencial de metales debido a la extracción de células39, 40.
    3. Retirar el sobrenadante aspirando y resuspender el pellet de células en 400 μL de PBS helado libre de calcio y magnesio, conteniendo 0,1% de Nonidet P-40 (NP-40), un detergente no iónico. Transfiera 100 μL a un nuevo tubo de microcentrífuga y Considéralo como toda la muestra de células. Esta alícuota representa el 25% de la muestra.
    4. Aísle los núcleos pipeteando la suspensión de la célula de 5 a 10 veces en el hielo con una punta de Micropipetas P1000. El aislamiento de los núcleos de las células epiteliales requiere una concentración de 0,5% NP-40. Logre la disociación celular pasando la suspensión celular a través de una aguja de 26 3/4 G 10 a 15 veces, seguida de 10 a 15 pasajes a través de una aguja de 30 1/2 G.
      Nota: Verifique la integridad de los núcleos mediante microscopía de luz utilizando un objetivo de 40x.
    5. Centrifugar la suspensión de lisado celular restante (300 μL) durante 10 s a 10.000 x g. El sobrenadante contendrá la fracción citosólica. Transfiera los 300 μL a un nuevo tubo de microcentrífuga.
    6. Enjuagar el pellet que contiene la fracción nuclear en 500 μL de PBS libre de calcio y magnesio, conteniendo 0,1% NP-40, luego centrifugar durante 10 s a 10.000 x g. Extraer el sobrenadante y resuspender el pellet que contiene los núcleos en 100 μL de la misma solución.
      Nota: el protocolo se puede pausar aquí. Las muestras se pueden almacenar a-20 ° c.
  4. Lyse las células por tres ciclos de sonicación (30 s on/30 s apagado, a 50 kHz, 200 W) durante 5 min. cuantificar el contenido total de proteínas en la muestra por Bradford41.
  5. Realizar el control de calidad de la pureza de las fracciones por Western Blot utilizando anticuerpos específicos para la nuclear (histonas, remodeladores de cromatina, proteínas de matriz nuclear) o fracciones citosólicas (β-tubulina, β-actina) (figura 2).
    Nota: no utilice sonicadores con una punta metálica. Estos pueden contaminar la muestra con metales.

3. análisis del contenido de Zn de fracciones celulares y subcelulares de cultivos celulares de mamíferos por espectroscopía de absorbancia atómica

  1. Mineralizar las muestras de cultivo celular (fracciones celulares o nucleares enteras) por digestión ácida utilizando un volumen igual de concentrado de HNO3 de grado de metal (PRECAUCIÓN) para 1 h a 80 ° c, luego durante la noche a 20 ° c.
  2. Detenga la reacción añadiendo un 30% del volumen de reacción de H2O2. Lleve el volumen de la muestra a 500 μL con agua purificada de 18 MΩ.
    Nota: el manejo de HNO3 debe realizarse con gafas de seguridad químicas, un protector facial para protección contra salpicaduras, guantes y un respirador de vapor aprobado si no se dispone de una ventilación adecuada (campana extractora). El protocolo se puede pausar aquí. Las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente (RT).
  3. Prepare soluciones estándar y muestras experimentales para mediciones de Zn por AAS equipadas con un horno de grafito.
    1. Utilice un 2% (v/v) de HNO3 solución en agua desionizada, procedente del mismo lote utilizado para la curva estándar como la solución en blanco para la calibración en todo. Utilice estándares de grado analítico diluidos en agua purificada de 18 MΩ.
    2. Prepare un estándar de 1.000 ppb de Zn a partir de una solución de stock de 1.000 ppm de Zn disponible comercialmente con una solución de HNO3 de 2% (v/v) en agua desionizada. Prepare soluciones estándar de trabajo a partir del estándar 100 ppb diluyendo a 5, 8, 10, 15, 20 y 25 ppb directamente con una solución de HNO3 de 2% (v/v) en agua desionizada. Prepare los estándares de Zn y el espacio en blanco con un modificador de matriz de 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 .
      Nota: el LOD de Zn es 0,01 ppb (μg/L). Al aumentar la concentración de las normas, se determinó que el límite de linealidad de Zn era de 20 ppb (figura 3).
    3. Mida el estándar y las muestras bajo las mismas condiciones optimizadas: caudal de introducción de 250 mL/min, temperatura de inyección de 20 ° c y temperatura de GF de 1.800 ° c.
      Nota: la temperatura del GF se incrementó a 2450 ° c para los pasos de limpieza, antes de la inyección de una nueva muestra o estándar.
    4. Optimizar la lámpara (C-HCL) a una corriente de 20 A, longitud de onda de 213,9 NM, y hendidura de 0,7 nm.
    5. Mida las muestras mineralizadas utilizando la curva estándar Zn para determinar el contenido metálico. A medida que se miden pequeños volúmenes, las muestras pueden evaporarse si las mediciones toman largos periodos de tiempo. Por lo tanto, se recomienda añadir agua a las muestras. Diluir las muestras con 18 MΩ de agua purificada tratada con 0,01% HNO3 (grado analítico) si los datos obtenidos están más allá del LOD.
      Nota: típicamente, las muestras se diluyen a un volumen de 500 μL, colocado en el muestreador automático del AAS para ser medido justo después de que se establezca la curva estándar. El volumen requerido debe ser determinado por el usuario y debe tener en cuenta los cálculos finales de las concentraciones. Se recomienda terminar las determinaciones de Zn por AAS de un experimento completo en un intento. Pausar las mediciones puede llevar a grandes variaciones experimentales e inconsistencias.
  4. Convierta las mediciones de ppb a la molaridad obtenida de Zn medida a través de AAS. Considere la masa de Zn (65,39 AMU). Divida la cantidad de ppb obtenida por AAS por 63.390.000. En las células, las concentraciones de Zn oscilan entre las unidades de pmol a μmol.
    1. Divida la concentración de Zn (pmol o μmol) por la masa inicial de proteína en la muestra determinada por Bradford (paso 2,4). Este cálculo representará la cantidad de metal (pmol o μmol Zn) contenida por mg de proteína de la muestra.
      Nota: es importante tener en cuenta los factores de dilución utilizados durante las determinaciones metálicas.

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Resultados

Probamos la capacidad del GF-AAS para detectar los niveles de los minutos de Zn en las células de mamíferos (figura 1). Así, cultivamos las mioblastos primarias derivadas de las células satélite del ratón, y las líneas celulares establecidas N2A (neuroblastoma derivado), 3T3 L1 (adipocitos), MCF10A (epitelio mamario) y células MDCK (epitelio renal del perro). En primer lugar, aislamos fracciones de células enteras, citosólicas y nucleares de todos estos tipos...

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Discusión

La espectroscopía de absorbancia atómica es un método altamente sensible para la cuantificación de Zn en muestras biológicas de volumen pequeño/masa. La optimización descrita de la medición de Zn hace que la aplicación de este método sea simple y garantiza condiciones analíticas ideales. Aquí, utilizando GF-AAS, determinamos la concentración de Zn en células enteras, y en fracciones citosólicas y nucleares, de diferentes líneas celulares. Los resultados demuestran que esta técnica es comparable a la obtenida por sondas f...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Premio de académicos de diversidad de la Facultad de la escuela de medicina de la Universidad de Massachusetts a T.P.-B. N.N.-T. es apoyado por SEP-CONACYT, subvención 279879. J. g. N es apoyado por la Fundación Nacional de ciencia Grant DBI 0959476. Los autores están agradecidos al Dr. Daryl a. Bosco por proporcionar la línea celular N2A y a Daniella Cangussu por su apoyo técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3-isobutil-1-metilxantinaSigma AldrichI5879
Ácido acéticoSigma Aldrich1005706
Anti Brg1-anticuerpo (G7)Santa Cruz biotechnologiessc-17796
Anti b-tubulina-anticuerpo (BT7R)Thermo ScientificMA5-16308
BradfordBiorad5000205
DexametasonaSigma AldrichD4902
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)ThermoFischer-Gibco11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)ThermoFischer-Gibco11320033
Dulbecco's Phosphate Buffered Sano (DPBS)ThermoFischer-Gibco14190144
Factor de crecimiento epidemal (EGF)Sigma AldrichE9644
Suero fetal bovino (FBS)ThermoFischer-Gibco16000044
factor de crecimiento fibroblástico-básico (FGF) (AA 10-155)ThermoFischer-GibcoPHG0024
suero de caballoThermoFischer-Gibco16050122
hidrocortisonaSigma AldrichH0888
Peróxido de hidrógeno (H2O2)Sigma Aldrich95321
InsulinaSigma Aldrich91077C
Insulina-Transferrina-Selenio-AThermoFischer51300044
Ácido nítrico (HNO3)Sigma Aldrich438073
Nonidet P-40 (NP-40)Thermo Scientific85125
OptiMEM (medios séricos reducidos)ThermoFischer-Gibco31985070
Penicilina-EstreptomicinaThermoFischer-Gibco15140148
PureCol (Colágeno)Advanced BioMatrix5005
Ácido ReiónicoSigma AldrichPHR1187
TroglitazonaSigma Aldrich648469-M
Tripsina-EDTA (0,25%), rojofenolThermoFischer-Gibco25200056
zinc (Zn) puro de un solo elemento estándar, 1.000 µ g/mL, 2% HNO3Perkin ElmerN9300168
Establecido Líneas Celulares
3T3-L1 Colección deCultivos Tipo AmericanoCL-173
MCDKColección de Cultura de Tipo AmericanoCCL-34
MCF10AColección de Cultura de Tipo AmericanoCRL-10317
N2AAmericano Tipo Colecciónde cultivos CCL-131
Equipo
absorción atómicaPerkinElmerAanalyst 800
BioruptorDiagnodeUCD-200
espectrofotómetro de

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