El objetivo de este protocolo es genotipo la anémona de mar Nematostella vectensis durante la gastrulación sin sacrificar el embrión.
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Artículo de método
Genotipado de anémona sin mar durante el desarrollo temprano
En este artículo
Resumen
Resumen
Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo el embrión de la etapa de gastrula del anthozoiano cnidario Nematostella vectensis sin sacrificar la vida del animal. Después de la fertilización in vitro y la desgelatina, se permite que los cigotos se desarrollen durante 24 horas a temperatura ambiente para llegar a la etapa de gastrula temprana a media. Los embriones de gastrula se colocan en un lecho de gel de agarosa en un plato de Petri que contiene agua de mar. Bajo el microscopio de disección, se utiliza una aguja de tungsteno para separar quirúrgicamente un fragmento de tejido abortivo de cada embrión. Los embriones post-cirugía se les permite sanar y continuar el desarrollo. El ADN genómico se extrae del fragmento de tejido aislado y se utiliza como plantilla para PCR específico del locus. El genotipo se puede determinar en función del tamaño de los productos PCR o de la presencia/ausencia de productos PCR específicos de alelos. Los embriones post-cirugía se clasifican según el genotipo. La duración de todo el proceso de genotipado depende del número de embriones a examinar, pero requiere mínimamente 4-5 h. Este método se puede utilizar para identificar mutantes noqueantes de una población genéticamente heterogénea de embriones y permite analizar fenotipos durante el desarrollo.
Introducción
Los cnidarios representan un grupo diverso de animales que incluyen medusas, corales y anémonas de mar. Son diploblasts, compuestos de ectodermo y endoderm que están separados por una matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria es un grupo hermano de la especia bilateria, al que pertenecen1. modelos animales tradicionales como Drosophila y Mus. Además, se cree que la divergencia Cnidaria-Bilateria ocurrió en el período pre-Cambriano2. Como tal, los estudios comparativos de cnidarios y bilaterianes son esenciales para obtener información sobre la biología de su ancestro común más reciente. Recientemente, l....
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Protocolo
1. Inducción de desove, fertilización in vitro y de-jellying
- Mantener nematostella vectensis en el agua de mar con una salinidad de 12 partes por mil (ppt) en la oscuridad a 16 oC, alimentando Artemia diariamente.
- El día antes de la inducción del desove, coloque a los animales en una incubadora controlada por temperatura y luz. Programar la incubadora para que los animales estén expuestos a 8 h de luz a 25oC. Opcional: Alimente una pequeña pieza (<1 mm3) de ostra a animales individuales antes de colocarlos en la incubadora para mejorar el desove.
- Dejar a los animales en la incubadora durante 1 h a 16o....
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Resultados
El genoma de Nematostella tiene un único locus que codifica una proteína precursora para el neuropéptido GLWamida. Tres alelos mutantes noqueados en este locus (glw-a, glw-b, y glw-c) se han reportado previamente5. Cuatro machos heterocigotos que llevaban un alelo de tipo salvaje (+) y un alelo de nocaut enel locus GLWamide (genotipo: +/glw-c)fueron cruzados con una .......
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Discusión
Aquí se describe un protocolo basado en PCR para genotipo un solo embrión de anémonas de mar sin sacrificar al animal. Después del desove y la desgelatina, los huevos fertilizados se pueden convertir en gastrulas. La región aborta de cada embrión de gastrula se extrae quirúrgicamente, y el tejido aboral aislado se utiliza para la extracción genómica posterior de ADN, mientras que los embriones post-cirugía restantes sanan y continúan el desarrollo. Los extractos de ADNG se utilizan para un ensayo de PCR para determinar e.......
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los revisores anónimos por los comentarios sobre la versión anterior del manuscrito, que mejoró el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Universidad de Arkansas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Drosophila Peltier Incubadora refrigerada | Shellab | SRI6PF | Se utiliza para la inducción del desove |
| Sal marina oceánica instantánea Océano | instantáneo | 138510 | |
| Quistes de camarones en salmuera | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| Clorhidrato de L-cisteína | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Agitador orbital estándar, modelo 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | CALIDAD BIOLÓGICA | 351-007-01 | |
| Cloruro de potasio | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Sustituto | Biológico | N3500 | |
| Proteinasa K solución (20 mg/mL), grado de ARN | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarosa | VWR | 710 | |
| Micro Portaagujas de disección | Roboz | RS-6060 | |
| Aguja de disección de tungsteno | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Termocicladores | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide imprimación | 5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3' | ||
| Imprimación inversa específica para glw-a | 5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3' | ||
| Imprimación inversa específica para glw-c | 5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3' |
Referencias
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al.
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Reimpresiones y permisos
