Cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes

Resumen

Demostramos el cultivo monocelular de bacterias dentro de vesículas gigantes (GV). Los GV que contenían células bacterianas fueron preparados por el método de transferencia de gotas y fueron inmovilizados sobre una membrana apoyada sobre un sustrato de vidrio para la observación directa del crecimiento bacteriano. Este enfoque también puede ser adaptable a otras células.

Resumen

Desarrollamos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de vesículas gigantes (GV). El cultivo celular bacteriano es importante para entender la función de las células bacterianas en el medio natural. Debido a los avances tecnológicos, varias funciones celulares bacterianas se pueden revelar a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado. Los GV son compartimentos esféricos de tamaño micro compuesto por moléculas de lípidos anfifílicos y pueden contener diversos materiales, incluidas las células. En este estudio, una sola célula bacteriana fue encapsulada en 10-30 m de GV por el método de transferencia de gotas y los GV que contienen células bacterianas fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un sustrato de vidrio. Nuestro método es útil para observar el crecimiento en tiempo real de bacterias individuales dentro de los GV. Cultivamos células escherichia coli (E. coli) como modelo dentro de los GV, pero este método se puede adaptar a otros tipos de células. Nuestro método se puede utilizar en los campos científico e industrial de la microbiología, la biología, la biotecnología y la biología sintética.

Introducción

El cultivo de células bacterianas a nivel de una sola célula ha recibido cada vez más atención. Cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado puede dilucidar funciones bacterianas como la variabilidad fenotípica^1,2,3,4, comportamiento celular^{5, 6 , 7 , 8 , 9}, y resistencia a los antibióticos^10,

Protocolo

1. Preparación de LOS GV que contienen células bacterianas por el método de transferencia de gotas

1. Preparar soluciones de stock de lípidos de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) y 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en cloroformo/ metanol (2/1, v/v) y almacene el stock a -20 oC.
2. Preparación de una solución de aceite que contenga lípidos
   1. Vierta 20 ml de la solución POPC y 4 l de la solución biotina-PEG-DSPE en un tubo de vidrio (Figura1b (i)).
   2. Evaporar el disolvente orgá....

Resultados

Presentamos un método sencillo para generar GV que contengan células bacterianas individuales utilizando el método de transferencia de gotas (Figura 1). La Figura 1a muestra una imagen esquemática de la precipitación de los GV que contienen bacterias. Las gotas W/O que contienen bacterias se transfieren a través de la interfaz de agua de aceite (monocapa lipídica) por centrifugación para formar GV. La diferencia de densidad entre.......

Discusión

Aquí, describimos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de los GV. Este método simple implica la formación de GV que contienen células bacterianas a nivel de una sola célula mediante el método de transferencia de gotas. En comparación con otros enfoques para la obtención de GV que contienen células bacterianas, este método tiene dos ventajas: (i) es fácil de desarrollar, y (ii) se requiere un pequeño volumen (2 l) de la solución de la muestra para preparar los GV. El método de tran.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bactotriptona	BD Biosciences	211705
Cloroformo	Wako Pure Chemicals	032-21921
Cubreobjetos (18 &18 mm)	Matsunami Glass Ind.	C018181	espesor 0.13– 0,17 mm
Cubreobjetos (30 y 40 mm)	Matsunami Glass Ind.	de pedido personalizado	0.25 – 0,35 mm
Centrífuga de sobremesa	Hi-Tech Co.	Tipo de rotor oscilante	ATT101
Sello de doble cara (10 veces; 10 veces; 1 mm)	Nitoms	T4613
Frasco de vidrio	AS ONE	6-306-01 Tubo de	fermentación Durham
Glucosa	Wako Pure Chemicals	049-31165
Microscopio invertido	Olympus	IX-73
Metanol	Wako Pure Chemicals	133-16771
Sistema de etapa de calentamiento microscópico	TOKAI	HIT TP-110R-100
Aceite mineral	Nacalai Tesque	23334-85
Miniextrusora	Avanti Polar Lipids	610000
Neutravidin	Thermo Fisher Scientific	31000
Lente objetivo	Olympus	LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Membranas de policarbonato	Avanti Polar Lipids	610005	tamaño de poro 100 nm
Cámara sCMOS	Andor	Zyla 4.2 plus
Cloruro de sodio	Wako Pure Chemicals	191-01665
Sacarosa	Wako Pure Chemicals	196-00015
Baño ultrasónico	AS ONE	ASU-3D
Extracto de levadura	BD Biosciences	212750
Tubo de plástico con tapa de 0,6 mL	Watson	130-806C
Tubo de plástico con tapa de 1,5 mL	Sumitomo Baquelita Co.	MS4265-M
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Lípidos polares Avanti	850457P	POPC
1,2-distearoyl-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenglicol)-2000]	Lípidos polares Avanti	880129P	Biotina-PEG-DSPE

espesor