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Artículo de método

Cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes

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DOI:

10.3791/59555

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30 de abril de 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

En este artículo

Resumen

Demostramos el cultivo monocelular de bacterias dentro de vesículas gigantes (GV). Los GV que contenían células bacterianas fueron preparados por el método de transferencia de gotas y fueron inmovilizados sobre una membrana apoyada sobre un sustrato de vidrio para la observación directa del crecimiento bacteriano. Este enfoque también puede ser adaptable a otras células.

Resumen

Desarrollamos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de vesículas gigantes (GV). El cultivo celular bacteriano es importante para entender la función de las células bacterianas en el medio natural. Debido a los avances tecnológicos, varias funciones celulares bacterianas se pueden revelar a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado. Los GV son compartimentos esféricos de tamaño micro compuesto por moléculas de lípidos anfifílicos y pueden contener diversos materiales, incluidas las células. En este estudio, una sola célula bacteriana fue encapsulada en 10-30 m de GV por el método de transferencia de gotas y los GV que contienen células bacterianas fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un sustrato de vidrio. Nuestro método es útil para observar el crecimiento en tiempo real de bacterias individuales dentro de los GV. Cultivamos células escherichia coli (E. coli) como modelo dentro de los GV, pero este método se puede adaptar a otros tipos de células. Nuestro método se puede utilizar en los campos científico e industrial de la microbiología, la biología, la biotecnología y la biología sintética.

Introducción

El cultivo de células bacterianas a nivel de una sola célula ha recibido cada vez más atención. Cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado puede dilucidar funciones bacterianas como la variabilidad fenotípica1,2,3,4, comportamiento celular5, 6 , 7 , 8 , 9, y resistencia a los antibióticos10,11. Debido a los recientes avances en las técnicas de cultivo, el cultivo de bacterias individuales se puede lograr dentro de un espacio confinado, como en un bien-chip4,7,8, gota de gel12,13 , y gota de agua en aceite (W/O)5,11. Para promover la comprensión o la utilización de células bacterianas individuales, se necesitan desarrollos técnicos adicionales de las técnicas de cultivo.

Las vesículas que imitan la membrana celular biológica son compartimentos esféricos que consisten en moléculas anfifílicas y pueden contener diversos materiales. Las vesículas se clasifican según el tamaño e incluyen vesículas pequeñas (SVs, diámetro < 100 nm), vesículas grandes (LV, <1 m) y vesículas gigantes (GV, >1 m). SVs o LV se utilizan comúnmente como portadores de drogas debido a su afinidad con la membrana celular biológica14. Los GV también se han utilizado como sistema de reactores para la construcción de protocélulas15 o células artificiales16. La encapsulación de células biológicas en GV se ha reportado17,18, y por lo tanto los GV muestran potencial como un sistema de cultivo celular cuando se combina con el sistema del reactor.

Aquí, junto con un video de procedimientos experimentales, describimos cómo los GV pueden ser utilizados como nuevos buques de cultivo celular19. Los GV que contenían bacterias fueron fabricados por el método de transferencia de gotas20 y luego fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un vidrio de cubierta. Utilizamos este sistema para observar el crecimiento bacteriano a nivel de una sola célula dentro de los GV en tiempo real.

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Protocolo

1. Preparación de LOS GV que contienen células bacterianas por el método de transferencia de gotas

  1. Preparar soluciones de stock de lípidos de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) y 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en cloroformo/ metanol (2/1, v/v) y almacene el stock a -20 oC.
  2. Preparación de una solución de aceite que contenga lípidos
    1. Vierta 20 ml de la solución POPC y 4 l de la solución biotina-PEG-DSPE en un tubo de vidrio (Figura1b (i)).
    2. Evaporar el disolvente orgánico por flujo de aire para formar una película lipídica y colocar la película en un desecador durante 1 h para evaporar completamente el disolvente orgánico (Figura1b (ii)).
      NOTA: Es necesario evaporar el disolvente orgánico en una campana de humo.
    3. Añadir 200 l de aceite mineral (0,84 g/ml, tabla de materiales)al vial de vidrio (Figura1b (iii)).
    4. Envuelva la parte inicial del vial de vidrio con película y sonicarla en un baño ultrasónico (120 W) durante al menos 1 h (Figura1b (iii)). Las concentraciones finales de POPC y biotina-PEG-DSPE son de 1 mM y 0,002 mM, respectivamente.
  3. Precultivo de células bacterianas
    1. Inocular E. coli en 1x medio LB (1 g de extracto de levadura, 2 g de bacto triptona y 2 g de cloruro de sodio en 200 ml de agua desionizada) de una placa LB e incubar a 37 oC durante 12-14 h (durante la noche).
    2. Después de la incubación, recoger 20 l de la solución de cultivo y transferir a 1,98 ml de medio fresco 1x LB, y volver a cultivar las células durante 2 h.
    3. Compruebe la densidad óptica en el valor de 600 nm (OD600) de la solución de precultivo (preparada en el paso 1.3.2). Se debe utilizar una solución precultal de600 OD a 1,0–1,5.
  4. Preparación de las soluciones acuosas externas e internas de los GV
    1. Disolver la glucosa en un medio de 1x LB para preparar una solución acuosa externa de GV. Prepare 20 mL de una solución de glucosa en stock (500 mM).
    2. Diluir la solución de glucosa en stock con 1x LB medio a 200 mM (Tabla1).
    3. Disolver la sacarosa en un medio de 1x LB para preparar una solución acuosa interna de GV. Prepare 20 ml de una solución de sacarosa en stock (500 mM).
    4. Mezclar la solución de precultivo (OD600 a 1,0–1,5), la solución de sacarosa (500 mM) y el medio 1x LB (Tabla1). El valor final de oD600 de la solución de cultivo debe ser 0,01–0,015 y la concentración final de sacarosa debe ser de 200 mM.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar la presión osmótica. Es necesario equilibrar la concentración entre la solución acuosa interna y externa.
  5. Preparación de gotas de agua en aceite (W/O) que contienen células bacterianas
    1. Añadir 2 l de la solución acuosa interna de los GV (preparadoen en el paso 1.4.4) a 50 l de la solución de aceite que contiene lípidos (aceite mineral con POPC y biotina-PEG-DSPE) en un tubo de plástico tapado de 0,6 ml (Figura1b (iv)).
    2. Emulsionar los dos componentes en el tubo de plástico tocando el tubo a mano (Figura1b (v)).
  6. Formación de GV que contienen células bacterianas
    1. Añadir 50 ml de la solución acuosa externa de los GV (preparado en el paso 1.4.2) en un tubo de plástico tapado de 1,5 ml (Figura1b (vi)) y colocar suavemente 150 ml de la solución de aceite que contiene lípidos (aceite mineral con POPC y biotina-PEG-DSPE) en la superficie del acuoso externo solución (Figura1b (vii)). Incubar esta muestra a temperatura ambiente (RT, 25 oC) durante 10-15 min. Compruebe que la interfaz del aceite y las soluciones acuosas sea plana.
    2. Añadir 50 l de la solución de gotas para rinuofencias (preparada en el paso 1.5.2) en la interfaz del aceite y la solución acuosa utilizando una pipeta (Figura1b (viii)).
    3. Centrifugar el tubo de plástico tapado de 1,5 ml (del paso 1.6.2) durante 10 min a 1.600 x g a RT en una centrífuga de escritorio (Figura1b (ix)). Después de la centrifugación, aspirar el aceite (capa superior) del tubo de plástico tapado de 1,5 ml utilizando una pipeta, y recoger los GV que contienen células bacterianas (Figura1b (x)).

2. Preparación de un sistema de observación GV (Sistema de cultivo celular de bacterias)

  1. Preparación de pequeñas vesículas (SVs) para constructi ng un membrana bicapa apoyada
    1. Vierta 20 ml de la solución POPC y 4 l de la solución biotina-PEG-DSPE en un tubo de vidrio (utilizando la misma composición lipídica utilizada para la preparación de GV en el paso 1.1).
    2. Evaporar el disolvente orgánico por flujo de aire para formar una película lipídica y colocar esta muestra en un desecador durante 1 h para evaporar completamente el disolvente orgánico.
    3. Añadir 200 ml de glucosa de 200 mM en un medio de 1x LB (la solución acuosa externa de GV) al vial de vidrio.
    4. Envuelva la parte inicial del vial de vidrio con película y sonicarla en un baño ultrasónico (120 W) durante al menos 1 h.
    5. Prepare SVs por el método de extrusión21 utilizando una membrana miniextrusora y policarbonato con tamaño de poro de 100 nm.
  2. Preparación de una cámara hecha a mano
    1. Taladre un orificio de 7 mm con un punzón hueco en un sello de doble cara (10 mm x 10 mm x 1 mm).
    2. Pegue el sello de doble cara con el orificio en un vidrio de cubierta (30 mm x 40 mm, espesor 0,25-0,35 mm).
  3. Preparación de una membrana bicapa apoyada en el vidrio de la cubierta en el orificio de la cámara
    1. Añadir 30 l de la solución SV al orificio de la cámara (preparado en la sección 2.2) e incubar a RT durante 30 min.
    2. Lave suavemente el orificio dos veces con 20 ml de medio de 1lb que contiene 200 mM de glucosa (la solución acuosa externa de GV) mediante pipeteo.
  4. Inmovilización de los GV en el membrana bicapa apoyada en el vidrio de la cubierta en el agujero de la cámara
    1. Introducir 10 ml de neutravidina con la solución acuosa externa de GV (1 mg/ml) en el orificio e incubar a RT durante 15 min.
    2. Lave suavemente el orificio dos veces con 20 ml de medio de 1lb que contiene 200 mM de glucosa (la solución acuosa externa de GV) mediante pipeteo.
    3. Añadir toda la solución que contenga GV (preparado en el paso 1.6.3) en el orificio de la cámara y sellar con un vidrio de cubierta (18 mm x 18 mm, espesor 0,13–0,17 mm) (Figura2b).
  5. Observación microscópica del crecimiento celular bacteriano dentro de los GV
    1. Establecer un sistema de etapa de calentamiento microscópico con un microscopio invertido equipado con una lente objetivo de apertura numérica (NA) de 40x/0.6 con una larga distancia de trabajo (Figura2b).
    2. Coloque la cámara en el sistema de etapa de calentamiento microscópico (Figura2b). Incubar los GV que contienen células bacterianas en la cámara a una condición estática durante 6 h a 37 oC.
    3. Capture y grabe imágenes de microscopio sin crecimiento celular bacteriano dentro de los GV cada 30 minutos mediante el uso de una cámara científica complementaria complementaria de semiconductores de óxido metálico (sCMOS).

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Resultados

Presentamos un método sencillo para generar GV que contengan células bacterianas individuales utilizando el método de transferencia de gotas (Figura 1). La Figura 1a muestra una imagen esquemática de la precipitación de los GV que contienen bacterias. Las gotas W/O que contienen bacterias se transfieren a través de la interfaz de agua de aceite (monocapa lipídica) por centrifugación para formar GV. La diferencia de densidad entre...

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Discusión

Aquí, describimos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de los GV. Este método simple implica la formación de GV que contienen células bacterianas a nivel de una sola célula mediante el método de transferencia de gotas. En comparación con otros enfoques para la obtención de GV que contienen células bacterianas, este método tiene dos ventajas: (i) es fácil de desarrollar, y (ii) se requiere un pequeño volumen (2 l) de la solución de la muestra para preparar los GV. El método de tran...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una Iniciativa Líder para Excelentes Investigadores Jóvenes (LEADER, No. 16812285) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón, una Beca en Ayuda para la Investigación de Jóvenes Científicos (No 18K18157, 16K21034) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a M.M., y la Beca en Ayuda de MEXT a K.K. (No 17H06417, 17H06413).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BactotriptonaBD Biosciences211705
CloroformoWako Pure Chemicals032-21921
Cubreobjetos (18 &18 mm)Matsunami Glass Ind.C018181espesor 0.13– 0,17 mm
Cubreobjetos (30 y 40 mm)Matsunami Glass Ind.de pedido personalizado0.25 – 0,35 mm
Centrífuga de sobremesaHi-Tech Co.Tipo de rotor oscilanteATT101
Sello de doble cara (10 veces; 10 veces; 1 mm)NitomsT4613
Frasco de vidrioAS ONE6-306-01 Tubo defermentación Durham
GlucosaWako Pure Chemicals049-31165
Microscopio invertidoOlympusIX-73
MetanolWako Pure Chemicals133-16771
Sistema de etapa de calentamiento microscópicoTOKAIHIT TP-110R-100
Aceite mineralNacalai Tesque23334-85
MiniextrusoraAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
Lente objetivoOlympusLUCPLFLN 40×/0.6 NA
Membranas de policarbonatoAvanti Polar Lipids610005tamaño de poro 100 nm
Cámara sCMOSAndorZyla 4.2 plus
Cloruro de sodioWako Pure Chemicals191-01665
SacarosaWako Pure Chemicals196-00015
Baño ultrasónicoAS ONEASU-3D
Extracto de levaduraBD Biosciences212750
Tubo de plástico con tapa de 0,6 mLWatson130-806C
Tubo de plástico con tapa de 1,5 mLSumitomo Baquelita Co.MS4265-M
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolinaLípidos polares Avanti850457PPOPC
1,2-distearoyl-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenglicol)-2000]Lípidos polares Avanti880129PBiotina-PEG-DSPE
espesor

Referencias

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