Evaluación de la estabilidad del almacenamiento de vesículas extracelulares

Resumen

Aquí presentamos un protocolo fácilmente aplicable para evaluar la estabilidad del almacenamiento de las vesículas extracelulares, un grupo de nanopartículas naturales producidas por las células. Las vesículas se cargan con glucuronidasa como una enzima modelo y se almacenan en diferentes condiciones. Después del almacenamiento, se evalúan sus parámetros fisicoquímicos y la actividad de la enzima encapsulada.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EVs) son objetivos prometedores en la investigación actual, que se utilizarán como fármacos, portadores de fármacos y biomarcadores. Para su desarrollo clínico, no sólo su actividad farmacéutica es importante, sino también su producción necesita ser evaluada. En este contexto, la investigación se centra en el aislamiento de los EVs, su caracterización y su almacenamiento. El presente manuscrito tiene como objetivo proporcionar un procedimiento fácil para la evaluación del efecto de las diferentes condiciones de almacenamiento en los EVs, sin manipulación genética o ensayos funcionales específicos. Esto hace posible obtener rápidamente una primera impresión de la estabilidad de los EVs bajo una condición de almacenamiento determinada, y los EVs derivados de diferentes fuentes celulares se pueden comparar fácilmente. La medición de la estabilidad se basa en los parámetros fisicoquímicos de los EVs (tamaño, concentración de partículas y morfología) y en la preservación de la actividad de su carga. Este último es evaluado por la encapsulación mediada por saponina de la enzima beta-glucuronidasa en el EVs. La glucuronidasa actúa como sustituto y permite una fácil cuantificación a través de la hendiedad de una molécula reportera fluorescente. El presente Protocolo podría ser una herramienta para los investigadores en la búsqueda de condiciones de almacenamiento que conserven de forma óptima las propiedades de EV para avanzar la investigación de EV hacia la aplicación clínica.

Introducción

Los EVs son nanopartículas ligadas a membranas producidas por casi todos los tipos de células. Para las células de mamíferos, los EVS se pueden subdividir en dos grupos principales con distintas vías de producción^1,2. Las vesículas de membrana, con un rango de tamaño de aproximadamente 100-1000 nm, se producen por el brote directo de la membrana celular. Los exosomas, de tamaño 30-200 nm, se derivan de cuerpos multivesiculares formados por la entrada interna en endosomas que posteriormente se fusionan con la membrana celular para liberar múltiples exosomas a la vez. La función principal de estas vesículas es e....

Protocolo

1. el cultivo celular y la producción de medio acondicionado con celdas

1. En general, cultivar las células en las condiciones individuales requeridas para la línea celular respectiva.
2. Cultivar las células durante 24-72 h en condiciones libres de suero o en un medio que contenga suero bovino fetal empobrecido (FBS).
   Nota: si se utiliza FBS empobrecido por EV, emplear un método comprobado para agotar eficientemente el suero, para evitar la contaminación con EVs derivados del suero de bovino²⁶.
3. Recoja el medio de las matraces. Centrifugar a 300 x g durante 10 min para peletiza las células. Recoja cuidadosame....

Resultados

La figura 1 muestra las características de almacenamiento de EVS aislados de HUVECs. Los EVs fueron aislados por la UC, la glucuronidasa fue encapsulada, y después de la SEC, los EVs purificados fueron evaluados por sus propiedades fisicoquímicas por NTA. Una muestra de las vesículas fue sometida posteriormente a la purificación de AF4 y se midió la actividad de la glucuronidasa.

Las vesículas se almacenaron entonces para 7 d a 4 ° c o-80 ° c y a 4 ° c en forma liofilizada, en.......

Discusión

En este manuscrito, presentamos un protocolo integral para estudiar la estabilidad de los EVs en diferentes condiciones de almacenamiento. Con la combinación de la glucuronidasa encapsulada como una lectura funcional y la evaluación de los parámetros fisicoquímicos de los EVs, el protocolo permite una evaluación directa de la estabilidad del almacenamiento de EVs y la comparación de EVs de diferentes células Líneas. SEM y TEM como métodos complementarios permiten una visión de los cambios de los EVs en el nivel de una so.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2 dimyristoyl-sn glicero-3-fosfocolina (DMPC)	Sigma-Aldrich	P2663-25MG
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)	Sigma-Aldrich	P4329-25MG
225 cm² matraces de cultivo celular	Corning	431082	Utilizado con 25 ml de membrana de
celulosa regenerada de 30 kDa	Wyatt Technology Europe	1854
350 y micro; espaciador	m Wyatt Technology Europe
Colector de fracciones automatizado	Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidasa	Sigma-Aldrich	G7646-100KU
Cloroformo	Fisher scientific	C/4966/17
Horno de columna	Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalosa dihidratada	Sigma-Aldrich	T9531-10G
DAWN HELEOS II, Detector de dispersión de luz multiángulo	Wyatt Technology Europe
Filtro de membrana Durapore, PVDF,  0,1  y micro; m, 47 y nbsp; mm	Merck	VVLP04700	Se utiliza para la preparación de tampones para AF4
EBM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3156	Medio basal de crecimiento de células endoteliales, utilizado para el cultivo libre de suero de células HUVEC
Eclipse dualtec	Wyatt Technology Europe
EGM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3162 Medio de	crecimiento de células endoteliales, utilizado para el cultivo normal de células HUVEC
Selladores de placas ELISA	R& D Systems	DY992	utilizado para el sellado de placas de 96 pocillos para el ensayo de glucuronidasa
	Etanol Fisher scientific	E/0665DF/17
Juego de extrusoras con soporte/bloque calefactor	Avanti Polar Lipids	610000-1EA
Soporte de filtro	Avanti Polar Lipids	610014-1EA	utilizado para la preparación de
liposomas Fluoresceína di-β-D-glucoronida	Thermo Fisher Scientific	F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36	Thermo Fisher Scientific	18912014
Hettich Universal 320 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Se utiliza para la peletización de células de 300 g
Hettich Rotina 420 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Se utiliza para la granulación de residuos más grandes de 3000 g
Celdas HUVEC	Lonza Verviers, S.p.r.	C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM	Kimble	420401-1030
Liofilizador ALPHA 2-4 LSC	Christ
Tubos de microcentrífuga, Polipropileno	VWR international	525-0255	los tubos utilizados para toda la manipulación de vehículos eléctricos, resultaron ser más favorables que los productos comparables de otros proveedores en lo que respecta a la recuperación de partículas
Nanosight LM14 equipado con un láser verde	Malvern Pananalytical
Nanosight-software versión 3.1	Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm membranas de policarbonato de grabado en pista	Whatman/GE Healthcare		110406 utiliza para la preparación de liposomas
PEEK Portafiltros en línea	Wyatt Technology Europe
Hidrato de ácido fosfotúngstico	Sigma-Aldrich	79690-25G
Frascos de policarbonato para ultracentrifugación	Beckman Coulter	355622
QuantiPro BCA Kit	de ensayo Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT
Saponina	Sigma-Aldrich	47036
Microscopía electrónica de barrido Zeiss EVO HD 15	Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b	GE Healthcare	17014001
SEM de cobre rejillas con película de carbono	Plano	S160-4
Canal AF4 pequeño	Wyatt Technology Europe
Máquina de recubrimiento por pulverización catódica Q150R ES	Quorum Technologies
Microscopía electrónica de transmisión JEOL JEM 2011	Oxford Instruments
Tipo 45 Ti rotor de ultracentrifugación	Beckman Coulter	339160
Ultimate 3000 muestreador automático Dionex	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex bomba isocrática	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex desgasificador de vacío en línea	Thermo Fisher Scientific
Ultracentrífuga OptimaTM L-90 K	Beckman Coulter
Detector UV	Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 y micro; m tamaño de poro filtro de celulosa mixta	Whatman/GE Healthcare	10401712	Se utiliza para la filtración de todos los tampones utilizados con los EV y en SEC