Un modelo de rata novedoso y traslacional de la conmoción cerebral que combina la fuerza y la rotación con la microdiálisis cerebral In Vivo

Resumen

La alteración del neurotransmisor es un mecanismo de disfunción neuronal que se produce después de la conmoción cerebral y contribuye a las consecuencias a largo plazo a veces catastróficas. Este modelo de rata combina microdiálisis, permitiendo la cuantificación del neurotransmisor in vivo, con una técnica de caída de peso que ejerce una rápida aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso, un factor importante del trauma craneocerebral humano.

Resumen

Los síntomas cognitivos y motores persistentes son consecuencias conocidas de las conmociones cerebrales/lesiones cerebrales traumáticas leves (MFI) que pueden ser en parte atribuibles a la neurotransmisión alterada. De hecho, los estudios de microdiálisis cerebral en roedores han demostrado una liberación excesiva de glutamato extracelular en el hipocampo dentro de los primeros 10 minutos después de un trauma. La microdiálisis ofrece la clara ventaja del muestreo continuo del neurotransmisor in vivo sin tener que sacrificar al animal. Además de la técnica antes mencionada, se necesita un modelo de lesión en la cabeza cerrada que ejerce una rápida aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso, ya que tal factor no está disponible en muchos otros modelos animales. El modelo de caída de peso de Wayne State imita este componente esencial del trauma craneocerebral humano, permitiendo la inducción de un impacto en la cabeza de un roedor sin restricciones con un peso que cae. Nuestro modelo de rata novedoso y traslacional combina la microdiálisis cerebral con el modelo de caída de peso de Wayne State para estudiar, en ratas adultas ligeramente anestesiadas y sin restricciones, los cambios agudos en los niveles de neurotransmisores extracelulares después de la conmoción cerebral. En este protocolo, la sonda de microdiálisis se insertó dentro del hipocampo como región de interés, y se dejó insertada en el cerebro al impactar. Hay una alta densidad de terminales y receptores en el hipocampo, por lo que es una región relevante para documentar la neurotransmisión alterada después de la conmoción cerebral. Cuando se aplica a ratas Adults Sprague-Dawley, nuestro modelo combinado indujo aumentos en las concentraciones de glutamato extracelular del hipocampo dentro de los primeros 10 minutos, de acuerdo con la sintomatología post-conmoción cerebral previamente reportada. Este modelo combinado de caída de peso proporciona una herramienta fiable para que los investigadores estudien las respuestas terapéuticas tempranas a las conmociones cerebrales además de una lesión cerebral repetitiva, ya que este protocolo induce un trauma tenal de cabeza cerrada.

Introducción

El propósito de este método es proporcionar a los investigadores una herramienta confiable que reproduzca fielmente la biomecánica del trauma craneocerebral humano al tiempo que permite la caracterización longitudinal de los efectos moleculares de las conmociones cerebrales/cerebro traumático leve lesiones (mTB). Este método combina la microdiálisis cerebral con el modelo de caída de peso del estado de Wayne para documentar, en ratas adultas ligeramente anestesiadas y sin restricciones, los cambios agudos en los niveles de neurotransmisores extracelulares después de la conmoción cerebral. Con este método mínimamente invasivo, neurotransmisores como glutamato, GABA, taurina, glicina y serina pueden ser cuantificados rápida y continuamente después de trauma, in vivo, mientras que no tener que sacrificar el animal.

La conmoción cerebral/mTBI es una interrupción fisiopatológica que afecta el funcionamiento cerebral causado por un mecanismo de fuerza externa. La conmoción cerebral/mTBI es la forma más común de lesión cerebral traumática, ya que representa el 70-90% de los casos¹. La mayoría de las alteraciones funcionales agudas después de una conmoción cerebral pueden atribuirse a una lesión cerebral primaria y secundaria^2,3: (1) la lesión cerebral primaria es inducida por la rápida aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso que daña los tejidos cerebrales por compresión seguida del estiramiento y cizallamiento de los axons durante la contragolpe^4,5,6 y (2) la lesión cerebral secundaria es la respuesta celular indirecta al trauma. Tiene lugar horas y días después de la lesión cerebral primaria y juega un papel importante en el deterioro motor y cognitivo observado con el tiempo. Muchos de los síntomas pueden atribuirse a una neurotransmisión alterada, como la liberación excesiva de glutamato extracelular previamente demostrada en los primeros 10 minutos después de una lesión^7,8,9. Dada su alta densidad de terminales y receptores, el hipocampo es una estructura cerebral particularmente vulnerable a esta respuesta excitotóxica después de una lesión. Estar muy involucrado en la función cognitiva^10,11, estudios en roedores informaron que el daño del hipocampo asociado con la conmoción cerebral puede conducir a deficiencias en el acondicionamiento del miedo y el aprendizaje de la memoria espacial^{12 , 13}. El objetivo principal de esta metodología era elaborar un modelo de rata de conmoción cerebral/mTBI, utilizando el procedimiento de caída de peso de cabeza cerrada de Wayne State para reproducir fielmente los mecanismos de la lesión cerebral primaria, e incorporar microdiálisis para estudiar in vivo, el neurotransmisor extracelular agudo cambia debido a la lesión cerebral secundaria después de una conmoción cerebral. Concentraciones de glutamato extracelular y GABA se midieron en el hipocampo para actuar como resultados representativos de nuestro método.

Estudios anteriores de roedores han combinado microdiálisis y otros modelos de lesión, como la caída de peso de cráneo abierto y el impacto cortical controlado, para demostrar los cambios agudos en los niveles de neurotransmisores extracelulares después de una lesión de diversa gravedad grados^14,15,16,17. Sin embargo, además de los altos grados de variabilidad, el valor traslacional de modelos como la caída del peso de cráneo abierto y el impacto cortical controlado se ve obstaculizado por una falta inherente de validez ecológica debido a 2 factores: (1) estos modelos inducen lesiones más graves que las conmociones cerebrales relacionadas con el deporte sufridas en humanos, que implican la carga directa del cerebro y (2) estos modelos requieren una craneectomía o una craneotomía, la cabeza del roedor está completamente sujetada en un marco estereotaxico, impidiendo el rápido aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso, reproduciendo así mal la biomecánica de la conmoción cerebral.

La microdiálisis es un método mínimamente invasivo que ofrece la clara ventaja de tomar muestras de neurotransmisores como glutamato, GABA, taurina, glicina y serina, in vivo y continuamente después de trauma, sin tener que sacrificar al animal. Además de las ventajas que ofrece la microdiálisis, la Universidad Estatal de Wayne desarrolló un modelo de caída de peso de cráneo cerrado (a diferencia de la calavera abierta de otros modelos), que permite la inducción de un mTBI en un roedor ligeramente anestesiado y sin restricciones, permitiendo así la rápida aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso¹⁸. Como se mencionó anteriormente, la aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso es una característica biomecánica central de las conmociones cerebrales relacionadas con el deporte vistas en humanos que los modelos anteriores de mTBI de roedores no han podido abordar. El procedimiento de caída de peso se puede hacer muy rápidamente y no requiere ninguna cirugía previa o incisión del cuero cabelludo. Después de la inducción de la conmoción cerebral, los roedores recuperan el reflejo de enderecimiento casi espontáneamente y no experimentan parálisis, convulsiones o dificultad respiratoria después de un solo impacto. Las hemorragias intracraneales y las fracturas craneales son poco frecuentes, y sólo se han notificado déficits menores en la coordinación motora en roedores. Este modelo de rata es fácil de usar, económico y facilita la cuantificación de los neurotransmisores liberados en la fase aguda después de una conmoción cerebral sin quitar la sonda de microdiálisis durante el impacto.

Nuestro modelo de rata que combina microdiálisis y conmoción cerebral es adecuado para investigadores que buscan caracterizar longitudinalmente los efectos moleculares de la conmoción cerebral y podría ser utilizado en una amplia variedad de estudios terapéuticos. De hecho, a pesar de varios años de investigación y una necesidad abrumadora, ningún fármaco para prevenir los efectos a largo plazo de las conmociones cerebrales ha pasado la fase de ensayo clínico¹⁹. Una de las posibles razones de estos fracasos podría ser el uso de modelos animales que no reproducen fielmente las fuerzas biomecánicas traumáticas de las conmociones cerebrales experimentadas por los seres humanos. El método presentado aquí cumple con la definición de conmociones cerebrales humanas que especifica que la lesión cerebral primaria es inducida por un impacto contundente, así como una rápida aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso^2,3.

Además, nuestro modelo combinado es apropiado para los investigadores que estudian los efectos de la lesión cerebral traumática leve repetida (rmTBI) ya que una de sus características clave que lo diferencia de otros modelos animales de conmoción cerebral es que permite inducir lesiones leves repetidas en el mismo caso¹⁸. En los seres humanos, rmTBI se asocia con síntomas postraumáticos más graves, tiempos de recuperación más largos, y deterioros motores y cognitivos agravados que tienden a propagarse en el tiempo^20,21. Otros modelos animales relevantes también han hecho posible comprender mejor la fisiopatología postraumática de rmTBI^{22,23,24,25,26,27} . Aumento de la vulnerabilidad cerebral se ha demostrado en roedores después de un mínimo de 5 mTBI a intervalos de 24 h. La neuroinflamación aumenta con el número de mTBI experimentados y los marcadores de neurodegeneración aparecen²⁸. El mTBI repetido evitaría la transición de la microglia de un modo proinflamatorio a un modo normal de recuperación, resultando en una actividad excitotóxica prolongada y la activación de mecanismos neurodegenerativos ^29. Con nuestro modelo, las ratas podrían estar expuestas a 1 impacto por día durante el período de 1 semana para un total de 5 exposiciones. Dada la simplicidad de este modelo animal, podría facilitar la caracterización de los efectos acumulativos de la liberación aguda de neurotransmisores indiscriminados que surgen inmediatamente después de un mTBI.

Este modelo también permite a los animales estar fácilmente expuestos a 2 impactos por día, lo que permite estudiar condiciones aún más severas, como cuando un atleta recibe otro impacto traumático en poco tiempo desde el primer golpe^30. Como se demostró en un estudio anterior^31,el momento de un segundo golpe en la cabeza puede afectar dramáticamente el daño vascular y axonal. Cuanto más cerca esté el segundo golpe del primer golpe, más perjudiciales son las consecuencias. Este modelo es apropiado para investigar cómo esta condición particular afecta la liberación de neurotransmisores extracelulares.

En este método, el hipocampo fue utilizado como región de interés debido a su relevancia en la investigación de conmoción cerebral, pero muestras de microdiálisis pueden ser recogidas de otras regiones de interés también. Sin embargo, cualquier otra región cerebral tiene que ser considerada debido al espacio dejado por el sitio de impacto de la cánula guía, incluyendo el cemento dental que la rodea, puede ocupar una cantidad considerable de espacio en la cabeza de la rata. Además de esto, los parámetros de microdiálisis presentados en este método tales como el corte del peso molecular de la membrana y la longitud activa, los intervalos de tiempo de muestreo y el caudal se pueden ajustar de acuerdo con el tipo de molécula estudiada. La recolección eficiente de citoquinas proinflamatorias implicadas en conmociones cerebrales, por ejemplo, requeriría una membrana con un tamaño de poro mucho más grande.

Protocolo

El protocolo animal para este proyecto obtuvo la aprobación del Comité de Cuidado de Animales del Hopital du Sacre-Cáur de Montreal de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

NOTA: En la Figura 1se presenta un esquema del protocolo de investigación.

1. Preparación animal

1. Pida ratas Sprague-Dawley de un proveedor de animales de laboratorio estándar para ser entregados entre 43 y 50 días de edad y a un peso entre 151 y 200 g.
2. Casar a todas las ratas individualmente en un ciclo de 12:12 h de luz: oscuridad, a 24-26 oC con acceso ad libitum al agua y a los alimentos.
3. Durante las 2 semanas antes de iniciar el protocolo, manejar las ratas durante 5 minutos a diario para facilitar su habituación en contacto con los investigadores. Las ratas deben envejecer alrededor de 10 semanas de edad y su peso debe estar entre 295 y 351 g en el momento de la conmoción cerebral o la inducción de lesiones falsas.

2. Microdiálisis Guía de Cirugía de Implantación de La Nula

1. Realice la cirugía en condiciones estériles. Use guantes estériles, un sombrero para el cabello y una máscara quirúrgica durante todo el procedimiento. Autoclave y esterilizar todos los materiales e instrumentos quirúrgicos de antemano. Limpiar y desinfectar a fondo el área de trabajo y el aparato estereofólico con una solución de etanol (70%).
2. Anestetizar a los animales inyectando un cóctel de ketamina (70 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) por vía intraperitoneal. Ases de profundidad anestésica probando el reflejo a un pellizco del dedo del dedo del sol.
3. Retire el pelaje de la cabeza del animal con cortadoras eléctricas. Limpie la cabeza alazada con una solución de 2% de alcohol isopropílico y gluconato de clorhexidina al 2% (3 veces). Aplique pomada lubrial durante la anestesia para prevenir la sequedad.
4. Cubrir el campo quirúrgico para que sólo se exponga la cabeza del animal. Coloque la cabeza de la rata en un aparato estereono, inserte las barras de los oídos en los conductos auditivos con mucho cuidado y luego apriete la abrazadera de la nariz. Fije una cánula guía de acero inoxidable de 26 G al brazo del soporte en el aparato estereotaxico.
5. Inyectar localmente un cóctel anestésico de bupivacaína (1,5 mg/kg) y lidocaína (1,5 mg/kg) por vía subcutánea en la cabeza, 10 minutos antes de la incisión.
6. Mantener la anestesia durante todo el procedimiento mediante la entrega de isoflurano sódico (2,5%) a 0,5 L/min de flujo de oxígeno con un cono nasal.
7. Haga una incisión en la línea media (3 cm) a lo largo del cuero cabelludo con un bisturí. Deje el cráneo limpio instalando 4 abrazaderas alrededor de la incisión.
8. Raspar firmemente el periosteo del cráneo con una cuchilla quirúrgica hasta que las suturas Bregma y Lambda sean visibles. Mantenga una presión firme sobre el cráneo con una almohadilla de gasa o un aplicador con punta de algodón si hay sangrado.
9. Confirme si el cráneo está correctamente alineado en el aparato estereotaxico comparando las coordenadas dorsoventrales de las suturas Bregma y Lambda. Identificar las coordenadas anteroposteriores, mediolaterales y dorsoventral de la sutura Bregma como puntos de referencia para las coordenadas de la cánula guía.
10. Tomando las coordenadas de sutura de Bregma como referencias, calcular las coordenadas del sitio de implantación de la cánula guía en el hipocampo.
    NOTA: Las siguientes coordenadas se determinaron de acuerdo con el atlas cerebral de rata de Paxinos y Watson (anteroposterior: -0,60 cm; mediolateral: 0,58 cm; dorsoventral: -0,16 cm, Figura 2A)³².
11. Marque el lugar de implantación preciso utilizando un marcador.
12. Taladre un orificio de 0,5 mm a través del cráneo en el sitio de destino de la cánula guía. Taladre otros 3 agujeros aproximadamente 5 mm alrededor de este punto para enhebrar 3 tornillos de anclaje en el cráneo que solidifiquen la cánula después de aplicar cemento dental acrílico.
13. Inserte la cánula en el hipocampo y fíjela con cemento dental. Esta cánula se utilizará para insertar la sonda en la región de interés 7 días después durante el procedimiento de microdiálisis. Tenga cuidado de no derramar exceso de cemento dental alrededor del sitio donde se reducirá el peso.
14. Deje secar el cemento durante 2 minutos y, a continuación, retire el brazo del soporte de la cánula. Inserte un obturador desmontable de acero inoxidable en la cánula para evitar la filtración del líquido cefalorraquídeo y los riesgos de infección.
15. Retire las 4 abrazaderas, tire hacia atrás de la piel retraída y sutura con un hilo de sutura quirúrgica 4-0.
16. Retire la rata del aparato e inyecte buprenorfina por vía subcutánea para tratar el dolor (0,05 mg/kg, después de la cirugía y, una vez al día, durante los siguientes 2 días). Coloque el roedor de nuevo en su jaula con una almohadilla de calentamiento debajo hasta que se vuelva consciente, luego devuélvalo al centro de cuidado de animales durante un período de recuperación de 7 días bajo estrecha vigilancia.

3. Procedimiento de microdiálisis

1. Durante el procedimiento de microdiálisis, use guantes estériles, un sombrero para el cabello y una máscara quirúrgica. Siete días después de la cirugía de implantación de la cánula, anestesiar a la rata con isoflurano sódico (2,5%) a 0,5 L/min de flujo de oxígeno.
2. Retire el obturador de la cánula e inserte lentamente una sonda de microdiálisis, perfundida con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (26 mmol/L NaHCO₃, 3 mmol/L NaH₂PO₄, 1,3 mmol/L MgCl₂, 2,3 mmol/L CaCl₂, 3.0 mmol/L KCl, 126 mmol/L NaCl, 0,2 mmol/L ácido L-ascórbico), a través de la cánula en el hipocampo u otra región de interés.
   NOTA: Las ratas deben anestesiarse sólo mientras se retira el obturador e insertan la sonda de microdiálisis, y durante la inducción de la conmoción cerebral o lesión falsa. Las sondas utilizadas aquí están construidas en laboratorio, en forma de I, y están compuestas por líneas de entrada de sílaba fusionadas lado a lado [diámetro interno (ID): 50 m] entubadas de polietileno (ID: 0.58-0.38 mm). El extremo de la cánula se fija con una longitud de membrana de celulosa hueca regenerada [corte de peso molecular: 13 kDa, diámetro exterior (OD): 216 m; ID: 200 m] utilizando adhesivo de cianoacrilato y la punta sellada con epoxi. La membrana activa mide 2,5 mm para su implantación en el hipocampo, pero se puede ajustar según la profundidad de la región de interés. La conexión de la cánula residente de la rata a la sonda se fija con un collar de acero inoxidable roscado instalado.
3. Fije el conjunto de la sonda a un resorte de acero inoxidable atado a un brazo de la palanca giratoria y de contrapeso líquido suspendido por encima de la jaula con un soporte de anillo y abrazaderas para que el animal pueda moverse libremente dentro de su jaula. Las ratas atadas pasan toda la duración del procedimiento de microdiálisis con acceso ad libitum al agua y a los alimentos.
4. Utilice una bomba de microinfusión para enviar perfusato a las sondas y recoja el dializado de la línea de salida de sílice fusionada (volumen muerto: 0,79 l).
5. Al menos 1 h y 30 minutos antes de que comience el procedimiento, suba la sonda a su caudal de trabajo (1 l/min). Compruebe que el caudal de la sonda es coherente midiendo el volumen a lo largo del tiempo con una pipeta.
   NOTA: El caudal puede ser más o menos dependiendo de los neurotransmisores muestreados y la región cerebral de interés. Las muestras de diálisis se toman antes, durante y después de una conmoción cerebral o inducción de lesiones falsas. El intervalo de muestreo depende de la región cerebral de interés, los neurotransmisores que se analizan, las concentraciones de dializado del analito y la sensibilidad del equipo de química analítica utilizado. Las fases de recolección realizadas aquí en el hipocampo para el muestreo de glutamato y GABA son las siguientes:
   1. Línea de base: Al comienzo del experimento, recoja muestras de diálisis a intervalos de 10 minutos durante 60 minutos.
   2. Después de la conmoción cerebral o lesión falsa: Después de una conmoción cerebral o una lesión falsa, recoja las muestras durante 90 minutos adicionales (9 muestras).
6. Recoger cada muestra de dializado en un vial de fracción precargado con 1 l de ácido perclórico de 0,25 mol/L para evitar la degradación del analito. Almacene las muestras a 4 oC para su posterior análisis.
7. Después de la recolección de la última muestra de dializado, vuelva a anestesiar a la rata con un cono nasal que entrega isoflurano sódico (2,5%) a 0,5 L/min de flujo de oxígeno.
8. Retire la sonda de microdiálisis de la cánula, vuelva a insertar el obturador y luego devuelva la rata al centro de cuidado animal.

4. Instalación del aparato de conmoción cerebral

1. Antes del inicio del procedimiento, tallar un peso que se utilizará para infligir la conmoción cerebral (19 mm de diámetro) de latón sólido para obtener una masa de 450 g. Inserte un lazo metálico en la parte superior del peso de latón. Taladre agujeros preliminares a una distancia de 1,0 m dentro de un tubo guía vertical de cloruro de polivinilo (PVC).
2. Cortar una hoja de aluminio con una cuchilla de afeitar afilada. La lámina de aluminio ranurado debe soportar el peso de la rata (295 a 351 g) sin interferir con la aceleración de su cuerpo después del impacto de la cabeza del peso de latón.
3. Tape la lámina de aluminio ranurada firmemente a un marco de plexiglás en forma de U (38 cm de largo x 27 cm de ancho x 30 cm de profundidad, Figura 3A,B) que contiene un cojín de espuma (37 cm de largo x 26 cm de ancho x 12 cm de profundidad).
4. Coloque el marco de plexiglás bajo un tubo guía de PVC (20 mm de diámetro x 1,5 m de longitud).
5. Sostenga el tubo guía de PVC en su lugar con un soporte de abrazadera de 3,5 cm por encima del aluminio ranurado.
6. Coloque una línea de pesca con mosca de nylon (capacidad de 9,1 kg, 0,46 mm de diámetro) a través del lazo metálico de modo que la parte inferior del peso cuelgue 2,5 cm sobre el aluminio ranurado para evitar múltiples golpes cuando la rata está cayendo sobre el cojín de espuma después del impacto.
7. Fije la línea de pesca con mosca de nylon al soporte de la abrazadera.
8. Tire hacia arriba del peso a través del tubo de PVC con la línea de pesca de la mosca de nylon y luego mantenerlo en su lugar mediante la inserción de una llave hexagonal a través de los agujeros perforados preliminares a 1,0 m.

5. Inducción por conmoción cerebral

1. Después de la fase basal de la recolección de muestras de diálisis, vuelva a anestesiar a la rata ligeramente colocando un cono nasal que entrega isoflurano sódico (2,5% isoflurano a 0,5 L/min de flujo de oxígeno) hasta que no responda a un pellizco del dedo del pie (como se menciona en la sección 3.1).
2. Coloque el animal sobre su pecho sobre la lámina de aluminio ranurado para que su cabeza se coloque directamente en la trayectoria del peso de latón (Figura3C,D). Mantenga la anestesia con el cono nasal para asegurarse de que la rata no se mueva o se despierte antes de que el peso lo golpee.
3. Retire el cono de la nariz y tire de la llave hexagonal. El peso caerá verticalmente a través del tubo de PVC e impactará la cabeza de la rata. La rata sufrirá una rápida rotación de 180o y aterrizará en su espalda (Figura3E).
4. Retire la rata del cojín de espuma y colóquela en su espalda en su jaula.
5. Utilice un temporizador digital para medir el tiempo reflejo correcto como signo de recuperación y gravedad de lesiones. El tiempo reflejo correcto es el tiempo total desde el impacto hasta que los roedores se despiertan y espontáneamente se despiertan a la posición propensa desde la posición supina, o comienzan a caminar. Tenga en cuenta cualquier signo de muerte, fractura o sangrado.
   NOTA: El procedimiento se puede repetir sobre el mismo tema en diferentes momentos para conmociones cerebrales repetidas.

6. Inducción de Sham

1. Después de la fase basal de la recolección de muestras de diálisis, vuelva a anestesiar a la rata ligeramente colocando un cono nasal que entregue isoflurano sódico (2,5%) a 0,5 L/min de flujo de oxígeno hasta que no responda a un pellizco del dedo del dedo del dedo del tiempo (como se menciona en la sección 3.1).
2. Coloque el animal sobre su pecho sobre la lámina de aluminio ranurado para que su cabeza se asiente directamente en el camino del peso de latón. Mantenga la anestesia con el cono nasal para asegurarse de que la rata no se mueva ni se despierte.
3. Retire el cono de la nariz y retire el animal de la hoja de aluminio sin tirar de la llave hexagonal. La rata no sufrirá una rápida rotación de 180o.
4. Coloque la rata en su espalda en su jaula.
5. Utilice un temporizador digital para medir el tiempo de ajuste como indicador de restauración neurológica.

7. Cromatografía líquida de alto rendimiento

1. Determinar los niveles de neurotransmisores (es decir, glutamato y GABA) mediante derivatización de precolumna utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento con detección de fluorescencia de separación rápida, y un sistema que consiste en un automuestreador de separación rápida y una bomba acoplada a una columna analítica de 3,0 x 50 mm y 5 m.
2. Preparar una fase móvil con 100 mmol/L de fosfato sódico dibásico (Na₂HPO_4),3,5% acetonitrilo y 20% de metanol. Ajustar el pH a 6,7 con ácido fosfórico (85%) según sea necesario.
3. Establezca el caudal en 0,5 ml/min.
4. Preparar reactivos de derivación diarios frescos y estándares de trabajo (100 ng/ml) a partir de soluciones de stock. Cárguelos en un automuestreador de separación rápida refrigerado (10 oC) con muestras.
5. Mezclar cada fracción secuencialmente en la columna analítica con 20 l de ácido mercaptopropico (0,071 mol/L) diluido con H₂O y 20 l de o-ftáldehído (0,0143 mol/L) diluido con tetraborato sódico de 0,1 mol/L. Permita 10 minutos para que la mezcla reaccione.
6. Para evitar la contaminación de las siguientes muestras, enjuague el bucle de inyección con metanol (20%), después de cada inyección.
   NOTA: El tiempo de retención de glutamato sería de 1 min aproximadamente en este protocolo, para un tiempo de ejecución total de 30 min para cada muestra.
7. Durante el análisis de picos cromatográficos, identifique picos desconocidos utilizando muestras igualadas según el tiempo de retención de estándares conocidos. Expresar los niveles de analitos a medida que g/ml.

8. Histología

1. Un mes después del procedimiento de microdiálisis y la inducción de la conmoción cerebral o lesión falsa, anestesia a los animales inyectando un cóctel de ketamina (70 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) por vía intraperitoneal y eutanasiado por paraformaldehído (4%) y la perfusión intracardiaca salina.
2. Decapita a los roedores y disecciona los cerebros.
3. Almacenar los cerebros en paraformaldehído (4%) y posteriormente crioprotegerlos en una solución de sacarosa (30%).
4. Corta los cerebros en secciones coronales de 50 m con un criostato.
5. Manchar las rodajas cerebrales con cresilo violeta para la verificación histológica de la lesión y la colocación de la sonda (tinción Nissl).

Resultados

Utilizando nuestro modelo de conmoción cerebral que combina fuerza y rotación con microdiálisis cerebral in vivo, el glutamato extracelular agudo y cambios GABA con el tiempo después de una conmoción cerebral o lesión falsa fueron investigados en 21 ratas macho, adulto, Sprague-Dawley por el implantación de una cánula guía en la región CA1 del hipocampo.

Verificación histológica de colocación y lesiones de la sonda
No se notificaron cambios morfológicos como hemorragias intracerebrales masivas o contusiones después de la verificación histológica del daño del tejido del hipocampo en secciones manchadas con violeta cresíl. La implantación de cánulas guía y la inserción de la sonda de microdiálisis indujeron daños menores y similares entre casos lesionados y falsos. Por otra parte, no retirar la sonda justo antes de una lesión falsa o inducción de conmoción cerebral no produjo ningún daño de tejido del hipocampo distinguible como se ve bajo un microscopio (Figura2B,C, respectivamente), con la membrana de la sonda todavía intacta posteriormente(Figura 2D,E). Cerebros de conmoción cerebral y lesiones falsas perfundidos con paraformaldehyde (4%) 1 mes después de los procedimientos de microdiálisis son indistinguibles tras la inspección visual (Figura2F,G).

Tiempo reflejo correcto
Los animales del grupo lesionado tuvieron un tiempo de retorcente significativamente mayor en promedio en comparación con los casos falsos (prueba t del estudiante, p a 0,042801) (Figura4) y parecían aturdidos al recuperar la conciencia. De los 10 casos del grupo de conmoción cerebral, un solo animal mostró signos menores de sangrado bajo el lugar del impacto después de la caída de peso. No se observaron otros signos de fractura de cráneo o sangrado intracraneal.

Microdiálisis cerebral In vivo
Para actuar como resultados representativos de nuestro método, se extrajeron quince muestras de dializado de 10 l del hipocampo, in vivo, a intervalos de 10 min y un caudal de 1 l/min. Los niveles extracelulares de glutamato y GABA se midieron a partir de 6 muestras durante la línea de base ( 60 min) y a partir de 9 muestras tras la inducción de una lesión falsa o una conmoción cerebral (90 min).

Concentraciones extracelulares de glutamato
Se observaron aumentos significativos en las concentraciones de glutamato extracelular en la región CA1 del hipocampo durante los primeros 10 minutos después de la inducción de traumaense en comparación con una lesión falsa (Prueba de Mann-Whitney U, p - 0.009175) (Figura 5). No se observó ninguna otra diferencia en las concentraciones de glutamato entre los grupos en cualquier otro momento.

Concentraciones extracelulares de GABA
No se observaron cambios significativos en las concentraciones de GABA en la región CA1 del hipocampo durante los primeros 10 minutos después de la inducción del trauma en comparación con la lesión falsa (Prueba de Mann-Whitney U, p - 0.943861) (Figura6). No hubo otra diferencia significativa en las concentraciones de GABA en cualquier otro momento entre casos de conmoción cerebral y casos de lesiones falsas.

Figura 1: Esquema del protocolo de investigación. Esta cifra ha sido modificada de IO Masse 2018. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Verificación histológica de colocación y lesiones de la sonda. (A) Vista coronal de la sonda de microdiálisis y el sitio de colocación de cánulas guía en el hipocampo utilizando el atlas estereotaxico de Paxinos y Watson. (B) Fotomicrografía representativa del daño tisular del hipocampo (cresyl violeta) producida por una sonda de microdiálisis y cánula guía a partir de una funda de lesiones falsas. (C) Fotomicrografía representativa del daño tisular del hipocampo (cresyl violeta) producida por una sonda de microdiálisis y cánula guía a partir de un caso de conmoción cerebral. (D) Fotomicrografía representativa de una sonda de microdiálisis antes de la inducción de la conmoción cerebral. (E) Fotomicrografía representativa de una sonda de microdiálisis después de la inducción de la conmoción cerebral. La membrana sigue intacta. (F-G). Fotomicrografía representativa de una farsa (F) y una conmoción cerebral (G) lesionada después de la perfusión con 4% de paraformaldehído a 1 mes después de una lesión falsa o procedimiento de conmoción cerebral. Tras la inspección visual, los 2 cerebros son indistinguibles. Esta cifra ha sido modificada de IO Masse 2018. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Aparatos de conmoción cerebral e instrumentos de microdiálisión componentes esenciales representaciones. (A) Una fotografía de todo el conjunto compuesta por un tubo guía vertical de cloruro de polivinilo (PVC) para el peso de caída situado por encima de la etapa de rata, marco de plexiglás, cojín de espuma, bomba de microinfusión controlada por ordenador, jeringas estancas a gas, líquido giratorios, y líneas de entrada-salida de sílice fusionada en paralelo. (B) Representación esquemática del marco de plexiglás y cojín de espuma con todas las dimensiones pertinentes. (C) Una fotografía de la pieza ranurada de papel de aluminio que sirve como la etapa de la rata por encima del cojín de espuma. (D) Una fotografía que muestre el posicionamiento de la rata en el escenario inmediatamente antes del impacto de la cabeza por la caída de peso. (E) Una fotografía que muestra la rata después del impacto de la cabeza, ilustrando la rotación horizontal de 180o del cuerpo de la rata después del impacto de la cabeza y la posterior aceleración y rotación. Esta cifra ha sido modificada de IO Masse 2018. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Tiempo de enderección. Representaciones del histograma del tiempo que tardan las ratas en despertar desde el anestésico y pasar de la posición supina a la posición propensa o comenzar a caminar después de una conmoción cerebral (diamantes rojos, n x 10) o lesiones falsas (cuadrados azules, n a 11). Las ratas del grupo de conmoción cerebral tardaron mucho más en enderedarse en comparación con el grupo de lesiones falsas. Los valores medios se representan como una línea horizontal en cada gráfico. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Esta cifra ha sido modificada de IO Masse 2018. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Concentraciones extracelulares de glutamato. Concentraciones extracelulares medias de glutamato (g/ml) medidas por microdiálisis en el hipocampo durante el inicio (60 min) y después de la conmoción cerebral (diamantes rojos, n a 10) o lesiones falsas (cuadrados azules, n a 11) condiciones (90 min). Las barras de error representan el error estándar de media. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Esta cifra ha sido modificada de IO Masse 2018. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Concentraciones extracelulares de GABA. Concentraciones extracelulares medias de GABA (g/ml) medidas por microdiálisis en el hipocampo durante la línea de base (60 min) y después de la conmoción cerebral (diamantes rojos, n a 10) o lesiones falsas (cuadrados azules, n a 11) condiciones (90 min). Las barras de error representan el error estándar de media. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Esta cifra ha sido modificada de IO Masse 2018. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Pasos críticos en el protocolo
Para la generación de resultados confiables, los pasos críticos en este protocolo requieren una atención particular. Durante la cirugía de implantación de cánulas, evite el uso de más cemento del necesario, especialmente cuando sea muy líquido para evitar derrames sobre el lugar del impacto. Para evitar bloquear el lugar de implantación, utilice un obturador que tenga la misma longitud que la cánula. Durante el procedimiento de microdiálisis, inserte la sonda lentamente en la cánula y asegúrese de que se inserta completamente para el muestreo de dializado. Antes de la inducción de la conmoción cerebral, asegúrese de que la hoja de aluminio esté correctamente ranurada con una cuchilla de afeitar afilada. De lo contrario, el impacto del peso de latón no será suficiente para rasgar la hoja de aluminio y la rata permanecerá en el pecho hacia abajo en lugar de someterse a una rotación de 180o y aterrizar en su espalda. Si este es el caso, las lesiones inducidas resultarán del impacto contundente, no muy diferente de lo que se ve en los modelos de caída de peso de cráneo abierto y serán significativamente más graves. Durante la inducción de la conmoción cerebral, evite impactar la cánula con el peso, ya que esto generaría daño crítico al cráneo de la rata. Es muy recomendable trabajar en equipos de 2 para restringir los errores de manipulación durante el experimento.

Modificaciones y solución de problemas
Durante el procedimiento de microdiálisis, el flujo debe ser constante y producir un volumen adecuado a la velocidad de perfusión, una vez que la sonda está conectada a la bomba. Los volúmenes más bajos pueden indicar la presencia de obstrucción en la membrana de la sonda o burbujas de aire en las líneas. En caso de obstrucción, la sonda debe desecharse y reemplazarse. Sin embargo, las burbujas de aire se pueden expulsar circulando ACSF en las líneas. Si no se observan obstrucciones o burbujas de aire y todavía no hay flujo, se puede cortar una pequeña parte del tubo de salida más cercano al extremo.

Limitaciones del método
Otros estudios que utilizan la caída de peso de la Universidad Estatal de Wayne han evaluado algunos cambios estructurales y moleculares fundamentales¹⁸. Sin embargo, una investigación más amplia mantendría la legitimidad de este procedimiento. La información sobre los cambios biológicos y neuroanatómicos que tienen lugar a nivel epigenético y celular consolidaría aún más el valor fiable y traslacional de nuestro método. Además, la evaluación de la función cognitiva es una medida fiable del resultado relacionado con el mTBI en los modelos de roedores^33. Si bien el tiempo correcto se midió en este protocolo y se retrasó significativamente en los casos lesionados en comparación con los casos falsos, los estudios en el futuro deberían concentrarse en medir metódicamente la función cognitiva después de la inducción del trauma en roedores.

Importancia del método con respecto a los métodos existentes/alternativos.
La importancia principal del método es doble: En primer lugar, permite la inducción exitosa de una conmoción cerebral con el procedimiento de la Universidad Estatal de Wayne, que permite una rápida aceleración y desaceleración de la cabeza y el torso. Con este método, se evitaron los resultados de lesiones graves como detenciones cardiorrespiratorias, fractura de cráneo, alta mortalidad y signos de contusiones cerebrales visibles en el lugar del impacto. En segundo lugar, esta técnica de microdiálisis replicó con éxito la liberación de glutamato extracelular aguda y de corta duración que tuvo lugar dentro de los primeros 10 minutos después de la inducción del trauma^14,16. Además, mantener la sonda insertada durante todo el procedimiento reduce significativamente la probabilidad de inducir daño a la barrera hematoencefálica sensible a mTBI vinculada a la inserción repetida de la sonda de microdiálisis^34.

Aplicaciones futuras o direcciones del método.
Dados los aspectos fáciles de usar del procedimiento de caída de peso de la Universidad Estatal de Wayne y los cambios agudos del nivel de neurotransmisores extracelulares medidos por microdiálisis, nuestro modelo de rata que combina microdiálisis y conmoción cerebral proporciona a los investigadores una herramienta para reproducir fielmente la biomecánica del trauma craneocerebral humano y caracterizalongitudinalmente los efectos moleculares de las conmociones cerebrales. Nuestro modelo de rata también podría ser utilizado en una amplia variedad de estudios terapéuticos, ya que ofrece una valiosa oportunidad para estudiar el mecanismo y la eficacia de los agentes farmacológicos in vivo, de forma continua y sin tener que sacrificar al animal. Además, la disponibilidad de un modelo de rata como el que se presenta aquí podría facilitar en gran medida la mejor comprensión de la relación entre los desequilibrios de neurotransmisores y las consecuencias conductuales de las conmociones cerebrales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Animal Preparación
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS 40
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Guía de microdiálisis Implantación de cánulas Cirugía
Clorhidrato de ketamina (100 mg/ml)
(100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solución de gluconato de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 2%	Carefusion	260100C
Clorhidrato de lidocaína	Alveda Pharma	0122AG01
Clorhidrato de bupivacaína	Hospira	1559
Pomada oftálmica	Baussh and Lomb inc.
marco estereotáxico	Stoelting	51600
Brazo de soporte de cánula estereotáxica	Aparato Harvard	72-4837
Taladro	Dremel	8050-N/18
Hilo de sutura recubierto Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Cemento acrílico dental	Harvard Apparatus	72-6906
Tornillos	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurano	Baxter	CA2L9100
Cánula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Maniquí-Cánula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
Procedimiento de microdiálisis
CMA 402 Bomba de jeringa	Apparatus Canada	CMA-8003110
Microjeringa 2.5ml Vidrio Harvard	Apparatus Canada	CMA-8309021
Clip de jeringa medio para 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Giratorio revestido de cuarzo de doble canal de bajo par	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Soporte de anillo de soporte de hierro fundido	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Abrazaderas de ángulo ajustable	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich Canadá	S5761-500G	para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
MgCl2 Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich Canadá	M8266-100G	Para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
NaCl Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich Canadá	S7653-1KG	Para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich Canadá	A5960-25G	Para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
KCl Cloruro de	Sigma-Aldrich Canadá	P9333-500G	Para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
NaH2PO4 Fosfato de Sodio Monobásico	Sigma-Aldrich Canadá	S0751-1KG	Para Líquido Cefalorraquídeo Artificial (aCSF)
CaCl2 Cloruro de Calcio	Sigma-Aldrich Canadá	383147-100G	Para Líquido Cefalorraquídeo Artificial (aCSF)
Neumático		más ligero	para sondas construidas en laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
Pegamento epoxi	Neumático		canadiensePara sondas construidas en laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
Super Glue Gel	Neumático		para sondas construidas en laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
Tubo termorretráctil de 0,063" de diámetro interior Neumático			para sondas construidas en laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
Discos de corte Dremel #409	Neumático canadiense		Para sondas de laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
BD Aguja 26 Calibre 0.5 pulgadas PrecisionGlide Estéril 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	Para Sondas Construidas en Laboratorio
BD Aguja 21 Calibre 1.5 pulgadas PrecisionGlide Estéril 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	Para Sondas
26G Tubo de Acero Inoxidable de un Pie	HRS Scientific	SST-26/FT	para sondas de laboratorio
Tubo de polietileno PE/20 .024" OD x .015" ID	HRS Scientific	C315CT	Para sondas de laboratorio
Tubo de polietileno PE/10 .024" OD x .011" ID	HRS Scientific	C314CT	Para sondas construidas en laboratorio
Tubo de polietileno PE/50 .038" OD x .023" ID	HRS Scientific	C313CT	para sondas de laboratorio
30S WIRE ST. ST 0.008X 1' Largo	HRS Scientific	008BSH/30S	para sondas construidas en laboratorio
Polymicro Technologies Tubo capilar de sílice fundida flexible Diámetro interior 50µ m, diámetro exterior 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	para sondas construidas en laboratorio
Spectra Por 132294 Membranas de fibra hueca de microdiálisis 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	para sondas construidas en laboratorio
Collar de acero inoxidable	Sirnay In.c	304	para sondas construidas en laboratorio / Hecho a medida
Name	Compañía	Número de catálogo	Comentarios
>Aparato de conmoción cerebral
Brass Peso	Rapido Mé tal Inc.		Fije el lazo de metal a la base
Lazo de metal	Rona Inc.		Disponible en la mayoría de las ferreterías
Tubo guía de PVC	Rona Inc.		Disponible en la mayoría de las ferreterías
Papel de aluminio	Alcan		Disponible en la mayoría de las tiendas de comestibles
Cinta			disponible comercialmente
GSC Soporte de anillo de hierro fundido	Fisher Scientifique	S13748
Marco de plexiglás en forma de U	Pré sentoirs PlexiPlus Inc.		Cojín
de espuma	a medida Mousse D& R Espuma Inc.
Hojas de afeitar	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb. Neumático canadiense Berkley	Disponible		en la mayoría de las ferreterías
Isoflurano	Baxter	CA2L9100
Cronómetro			Disponible en la mayoría de los minoristas de
artículos deportivosAnimal Preparación
Sprague Dawley Ratas	Charles River Laboratories	SAS 40
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
Guía de Microdiálisis Cirugía de implantación de cánulas
Clorhidrato de ketamina (100 mg/ml)
(100 mg/ml)	Bimeda	8XYL004C
Solución de gluconato de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 2%	Carefusion	260100C
Clorhidrato de lidocaína	Alveda Pharma	0122AG01
Bupivacaína Clorhidrato	Hospira	1559
Pomada oftálmica	Baussh and Lomb inc.
marco estereotáxico	Stoelting	51600
Brazo de soporte de cánula estereotáxica	Aparato Harvard	72-4837
Taladro	Dremel	8050-N/18
Hilo de sutura recubierto Vicryl Rapide 4-0	Ethicon	VR2297
Cemento acrílico dental	Harvard Apparatus	72-6906
Tornillos	JI Morris Company	P0090CE125
Isoflurano	Baxter	CA2L9100
Cánula Gauge 20 10.55mm	HRS Scientific	C311G/SPC
Maniquí-Cánula 10.55mm	HRS Scientific	C311DC/1/SPC
Nombre	Company	Número de catálogo	Comentarios
Procedimiento de microdiálisis
CMA 402 Bomba de jeringa	Apparatus Canada	CMA-8003110
Microjeringa 2.5ml Vidrio Harvard	Apparatus Canada	CMA-8309021
Clip de jeringa medio para 1-2.5ml	Harvard Apparatus Canada	CMA-3408310
Giratorio revestido de cuarzo de doble canal de bajo par	Instech Laboratories Inc.	375/D/22QM
GSC Soporte de anillo de soporte de hierro fundido	Fisher Scientifique	S13748
Fisherbrand Castaloy Abrazaderas de ángulo ajustable	Fisher Scientifique	05769Q
NaHCO3 Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich Canadá	S5761-500G	para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
MgCl2 Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich Canadá	M8266-100G	Para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
NaCl Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich Canadá	S7653-1KG	Para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich Canadá	A5960-25G	Para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
KCl Cloruro de	Sigma-Aldrich Canadá	P9333-500G	Para líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
NaH2PO4 Fosfato de Sodio Monobásico	Sigma-Aldrich Canadá	S0751-1KG	Para Líquido Cefalorraquídeo Artificial (aCSF)
CaCl2 Cloruro de Calcio	Sigma-Aldrich Canadá	383147-100G	Para Líquido Cefalorraquídeo Artificial (aCSF)
Neumático		más ligero	para sondas construidas en laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
Pegamento epoxi	Neumático		canadiensePara sondas construidas en laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
Super Glue Gel	Neumático		para sondas construidas en laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
Tubo termorretráctil de 0,063" de diámetro interior Neumático			para sondas construidas en laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
Discos de corte Dremel #409	Neumático canadiense		Para sondas de laboratorio / Disponible en la mayoría de las ferreterías
BD Aguja 26 Calibre 0.5 pulgadas PrecisionGlide Estéril 305111	Fisher Scientifique	14-826-15	Para Sondas Construidas en Laboratorio
BD Aguja 21 Calibre 1.5 pulgadas PrecisionGlide Estéril 305167	Fisher Scientifique	14-826-5B	Para Sondas
26G Tubo de Acero Inoxidable de un Pie	HRS Scientific	SST-26/FT	para sondas de laboratorio
Tubo de polietileno PE/20 .024" OD x .015" ID	HRS Scientific	C315CT	Para sondas de laboratorio
Tubo de polietileno PE/10 .024" OD x .011" ID	HRS Scientific	C314CT	Para sondas construidas en laboratorio
Tubo de polietileno PE/50 .038" OD x .023" ID	HRS Scientific	C313CT	para sondas de laboratorio
30S WIRE ST. ST 0.008X 1' Largo	HRS Scientific	008BSH/30S	para sondas construidas en laboratorio
Polymicro Technologies Tubo capilar de sílice fundida flexible Diámetro interior 50µ m, diámetro exterior 150µ m	Molex LLC Polymicro Technologies	106815-0015	para sondas construidas en laboratorio
Spectra Por 132294 Membranas de fibra hueca de microdiálisis 13 kD MWCO	Spectrum Labs	FSSP9778671	para sondas construidas en laboratorio
Collar de acero inoxidable	Sirnay In.c	304	para sondas construidas en laboratorio / Hecho a medida
Name	Compañía	Número de catálogo	Comentarios
>Aparato de conmoción cerebral
Brass Peso	Rapido Mé tal Inc.		Fije el lazo de metal a la base
Lazo de metal	Rona Inc.		Disponible en la mayoría de las ferreterías
Tubo guía de PVC	Rona Inc.		Disponible en la mayoría de las ferreterías
Papel de aluminio	Alcan		Disponible en la mayoría de las tiendas de comestibles
Cinta			disponible comercialmente
GSC Soporte de anillo de hierro fundido	Fisher Scientifique	S13748
Marco de plexiglás en forma de U	Pré sentoirs PlexiPlus Inc.		Cojín
de espuma	a medida Mousse D& R Espuma Inc.
Hojas de afeitar	VWR International	55411-055
Super Strong Trilene XT 20 lb.	Neumático canadiense		en la mayoría de las ferreterías
Isoflurano	Baxter	CA2L9100
Cronómetro			Disponible en la mayoría de los minoristas de artículos deportivos