Este protocolo se utiliza para aislar cardiomiocitos auriculares individuales del corazón adulto del ratón utilizando un enfoque de digestión de trozos. Este enfoque se utiliza para aislar los miocitos auriculares derecho o izquierdo que se pueden utilizar para caracterizar la electrofisiología de miocitos auriculares en estudios de abrazaderas de parches.
Artículo de método
Aislamiento de miocitos auriculares de ratones adultos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las propiedades electrofisiológicas de los miocitos auriculares afectan importantemente la función cardíaca general. Las alteraciones en las corrientes iónicas subyacentes responsables del potencial de acción pueden causar sustratos proarrítmicos que subyacen a las arritmias, como la fibrilación auricular, que son muy frecuentes en muchas condiciones y estados de la enfermedad. El aislamiento de cardiomiocitos auriculares de ratón adulto para su uso en experimentos con abrazaderas de parches ha avanzado en gran medida nuestro conocimiento y comprensión de la electrofisiología celular en el miocardio auricular saludable y en el entorno de la fisiopatología auricular. Además, los estudios que utilizan modelos genéticos de ratón han aclarado el papel de una amplia gama de proteínas en la regulación de la electrofisiología auricular. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de los cardiomiocitos de los apéndices auriculares de ratones adultos utilizando una combinación de digestión enzimática y disociación mecánica de estos tejidos. Este enfoque produce de manera consistente y confiable cardiomiocitos auriculares aislados que luego se pueden utilizar para caracterizar la electrofisiología celular midiendo potenciales de acción y corrientes iónicas en experimentos de abrazadera de parche bajo una serie de experimentales Condiciones.
Introducción
Las aurículas, que son las cámaras delgadas de paredes y baja presión del corazón que reciben sangre de la vena cavae superior e inferior, así como de las venas pulmonares, son integrales en la fisiología cardíaca normal. Al igual que otras regiones del corazón, las arerias contienen una serie de tipos de células, incluyendo cardiomiocitos, fibroblastos, células endoteliales, células musculares lisas vasculares y otros. Los miocitos auriculares son células excitables eléctricamente que desempeñan un papel esencial en la conducción de señales eléctricas a través del corazón, asegurando así una contracción auricular adecuada durante cada latido del corazón1. La disfunción eléctrica en las lirias puede conducir a una serie de arritmias específicas auriculares como el aleteo auricular y la fibrilación auricular2,3. Estas son arritmias auriculares muy frecuentes, pero mal comprendidas, que conducen a una morbilidad y mortalidad significativas. La fibrilación auricular puede ocurrir en asociación con mutaciones genéticas, en asociación con el envejecimiento o en el entorno de formas adquiridas de enfermedades cardíacas, incluyendo hipertensión, insuficiencia cardíaca y diabetes2,4,5 ,6. Estas condiciones pueden alterar las propiedades eléctricas de los miocitos auriculares que puedencrear un sustrato que aumenta la prevalencia de la arritmia1,2.
La función eléctrica normal en las lirias, así como la arritmigénesis auricular, se ven afectadas de manera importante por la morfología del potencial de acción (AP) producido en los miocitos auriculares. El AP auricular se genera a partir de la actividad de una serie de corrientes iónicas, incluyendo la corriente de sodio (INa,transportada por canales NaV1.5), la corriente de calcio tipo L (ICa,L, llevada por Cav1.2 y CaV1.3 canales ), y varias corrientes de potasio, incluida la corriente de potasio rectificador retardada ultrarrápida (IKur, transportada por KV1.5 canales), la corriente transitoria de potasio exterior (Ia, transportada por KV4.2 y KV4.3 canales), una corriente de potasio de estado estacionario (IKss,transportada por canales KV2.1) y la corriente de potasio rectificador interior (IK1, transportada por Kir2.1 canales)1,7, 8. Aunque no juegan un papel importante en las onrias de ratón, los componentes rápidos y lentos del rectificador retardado K+ corriente (IKr e IKs) también contribuyen a la repolarización AP en algunas especies7. Las alteraciones en una o más de estas corrientes iónicas pueden alterar significativamente las propiedades eléctricas de los miocitos auriculares, lo que puede conducir a arritmias auriculares. Por ejemplo, una reducción en INa puede ralentizar la velocidad de conducción a través de las rículas al reducir la velocidad de upstroke AP. Por otro lado, una reducción en la repolarización de las corrientes de potasio o un aumento en ICa,L o el difunto INa puede resultar en el desarrollo de postdespolarizaciones que pueden desencadenar actividad espontánea en las áridos1, 2,9.
Es importante reconocer que hay diferencias en la morfología de la AP en diferentes partes del miocardio auricular que probablemente se deban a diferencias en la expresión o regulación de estos canales iónicos subyacentes. Por ejemplo, las diferencias en la duración de AP entre las atrias derecha e izquierda en asociación con las diferencias en Ia la densidad actual han sido bien descritas10,11,12,13. Además, recientemente hemos demostrado que existen distintos patrones de remodelación eléctrica enlas atrias derecha e izquierda de ratones con hipertensión crónica 6,14. La pared posterior auricular derecha también contiene el nodo sinoauricular, que tiene sus propios patrones distintos de morfología AP y patrones de disparo15. Las propiedades distintivas de los miocitos en cada una de estas diferentes partes de las arículas se pueden investigar en detalle utilizando miocitos aislados de cada una de estas regiones.
Existen diferentes enfoques que se pueden utilizar para aislar los miocitos auriculares para los estudios de electrofisiología de abrazadera de parche16. Una posibilidad es utilizar un enfoque de perfusión retrógrada donde el corazón se cannua a través de la aorta para la administración de enzimas. Si bien este es un enfoque viable, puede producir variabilidad en la calidad de los miocitos auriculares debido a las incoherencias en la perfusión de las rías. Hemos adoptado un enfoque de digestión "chunk" para el aislamiento de los miocitos auriculares que elimina la necesidad de perfusión retrógrada del corazón. Nuestro enfoque utiliza una combinación de digestión enzimática y disociación mecánica del tejido auricular que produce de manera consistente y confiable un gran número de miocitos auriculares aislados que son adecuados para estudios de abrazaderas de parches. Si bien aquí describimos nuestro enfoque utilizando tejido de apéndice auricular, el enfoque se puede utilizar en cualquier región del miocardio auricular (es decir, apéndices auriculares derecho o izquierdo, paredes libres, paredes posteriores) que el investigador elija. Este enfoque es ideal para estudios de electrofisiología de miocitos auriculares en ratones modificados genéticamente, en modelos de ratón de enfermedadcardiovascular, o para estudiar los efectos de los compuestos farmacológicos5,6,17 , 18 , 19.
Protocolo
Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Calgary y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. El aislamiento de miocitos auriculares, las imágenes y los resultados representativos que se describen a continuación se obtuvieron de un ratón de tipo salvaje masculino C57Bl/6 de 15 semanas de edad. Utilizamos rutinariamente este protocolo para aislar miocitos auriculares de ratones de tipo salvaje17,18,ratones portadores de mutaciones genéticas19,20 y modelos de ratón de enfermedad como la hipertensión crónica6, 14. El protocolo se puede utilizar de forma similar para ratones machos o hembras. También utilizamos una versión similar de este procedimiento de aislamiento para aislar los miocitos de nodo sinoauricular del corazón del ratón17,21,22,23. Un diagrama de flujo de este protocolo experimental se encuentra en la Figura1.
1. Preparación de soluciones y equipos de stock
- Prepare 1 plato de disección añadiendo elastómero de silicona de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agregue suficiente compuesto de elastómero de silicona para cubrir la parte inferior de un plato Petri de 10 cm a una profundidad de 1 cm. Deje curar y luego inserte 6 alfileres de insectos en el plato.
NOTA: Este plato de diselación de silicona se puede reutilizar durante meses y almacenar a temperatura ambiente. - Prepare 3 pipetas Pasteur pulidas al fuego con una abertura de 1 mm (diámetro pequeño), 3 mm (diámetro medio) o 5 mm (agujero grande) de diámetro como se muestra en la Figura 2A. Para hacer estas pipetas, anota una pipeta Pasteur y luego ajusta a lo largo de la marca de puntuación para producir una abertura que sea ligeramente más grande que el tamaño de agujero deseado. Utilice un archivo de metal para alisar la superficie y luego pulir esta abertura con una llama abierta.
NOTA: Esto producirá un borde liso, pulido al fuego con una abertura del diámetro deseado. Es importante que la abertura esté libre de grietas y superficies rugosas. Estas pipetas pulidas al fuego se pueden almacenar a temperatura ambiente y reutilizarse durante meses. - Prepare soluciones de stock para la solución pH 6.9 de Tyrode y la solución de pH 7.4 de Tyrode, tal como se indica en la Tabla1. También preparar 10 ml cada uno de 1 M MgCl2, 1 M CaCl2y 100 mM CaCl2. Utilice agua ultrapura para todas las soluciones y guárdela a 4 oC durante un máximo de 2 meses.
- Preparar 1 L de solución modificada de Kraft-Br-he (KB) como se indica en el Cuadro 2. Use agua ultrapura. Divida la solución en alícuotas de 20 ml y guárdela a -20 oC durante un máximo de 2 meses.
2. Preparación de soluciones y configuración de aislamiento para el aislamiento de myocitos auriculares
- Preparar 50 ml de una solución modificada de pH 7.4 de Tyrode como se describe en la Tabla 3 en un matraz Erlenmeyer de 125 ml, utilizando 1 M CaCl2 y 1 M MgCl2 soluciones de stock. Coloque el matraz Erlenmeyer en un baño de agua de 35oC hasta su uso, como se muestra en la Figura 2B.
- Prepare la solución modificada de pH 6.9 de Tyrode como se describe en la Tabla 4 en un tubo de 50 ml, utilizando la solución de stock CaCl2 de 100 mM. Aliquot 2,5 ml de esta solución en cada uno de los tres tubos inferiores redondos de 5 ml. Coloque estos tubos en una rejilla de alambre colocada en un baño de agua de 35 oC hasta su uso, como se muestra en la Figura 2B.
- Prepare la solución enzimática como se describe en la Tabla 5 en un tubo inferior redondo de 14 ml. Para hacer la solución de proteasa, añadir 1 mg de proteasa por cada 100 ml de agua ultrapura. Coloque el tubo que contiene esta solución enzimática en el estante de alambre e incubar en un baño de agua de 35oC hasta su uso.
- Descongelar una alícuota de solución de KB modificada en un baño de agua de 35 oC. Aliquot 2,5 ml de solución de KB en cada uno de los tres tubos inferiores redondos de 5 ml y 2,5 ml en un tubo inferior redondo de 14 ml. Coloque estos tubos en la rejilla de alambre e incubar en un baño de agua de 35 oC hasta su uso, como se muestra en la Figura 2B.
- Exponer la placa de diselación, las herramientas de diselación, una pipeta Pasteur y las pipetas pulidas al fuego como se muestra en la Figura 2B.
3. Disección de Los apéndices auriculares del ratón
- Inyectar el ratón con 0,2 ml de heparina (10 000 USP U/10 ml) mediante inyección intraperitoneal y esperar 5 minutos para la absorción.
- Colocar el ratón en una cámara de inducción y anestesiar por inhalación de isoflurano (3-4%). El isoflurano y el oxígeno se suministran utilizando una máquina anestésica y se elimina el gas anestésico residual. Una vez que el ratón es anestesiado, y no exhibe un reflejo de pellizcar del dedo del dedo del dedo del tiempo, eutanasia el ratón por rápida luxación cervical. Coloque el ratón sobre una toalla de papel o una tabla de corcho y pegue las patas hacia abajo para mantener el ratón en su lugar.
- Humedezca el pecho del ratón con un 70% de etanol. Retire el pelaje y la piel que cubre el pecho con tijeras curvas. A continuación, utilice fórceps de dientes de rata para levantar el esternón y luego corte el diafragma a lo largo del borde de las costillas. Retire toda la caja torácica con tijeras curvas para exponer el corazón.
- Para retirar el apéndice auricular (derecha o izquierda), levante suavemente el apéndice con fórceps de diseción fina y córtelo con tijeras de resorte. Transfiera inmediatamente el apéndice auricular a un plato de diselación recubierto de silicona que contenga 20 ml de la solución de pH 7.4 modificada calentada de Tyrode descrita en el paso 2.1.
- Coloque un pasador de diselación en la parte superior y un pasador en la parte inferior de la abertura del apéndice auricular. Con una pipeta de pasto, enjuague las aférias con la solución de pH 7.4 modificada calentada de Tyrode para eliminar la sangre. Abra el apéndice auricular cortando a lo largo del borde superior e inferior del apéndice auricular. A continuación, ancle las esquinas del apéndice auricular para crear una pieza plana y rectangular de tejido, como se muestra en la Figura 3A.
4. Aislamiento de miocitos auriculares
NOTA: Los pasos de esta sección se realizan a 35oC, con tubos sumergidos en un baño de agua de 35oC. Tenga cuidado al transferir tiras de tejido entre tubos inferiores redondos para asegurarse de que sólo el tejido (y no la solución) se transfiere entre los tubos.
- Corte el apéndice auricular en aproximadamente 8-10 tiras de igual tamaño (aproximadamente 0,7 mm de ancho) utilizando tijeras de resorte y fórceps finos. Un ejemplo de las tiras de tejido auricular se muestra en la Figura 3B. Tenga en cuenta que las tiras se contraen una vez que se cortan libres de la pieza principal de tejido. Usando la pipeta pulida al fuego de diámetro pequeño, transfiera las tiras de tejido en el primer tubo que contiene la solución de pH 6.9 de Tyrode modificada calentada descrita en el paso 2.2. Espere 5 minutos.
- Lave las tiras de tejido transfiriéndolas al segundo y luego el tercer tubo inferior redondo que contiene la solución modificada de pH 6.9 de Tyrode preparada en el paso 2.2 utilizando la pipeta de perforación de diámetro medio pulida al fuego.
- Para lavar las tiras de tejido, tapa el tubo inferior redondo de 5 ml e invierta suavemente el tubo 3 veces. Deje que las tiras de tejido se asienten en la parte inferior del tubo antes de transferir las tiras de tejido al siguiente tubo utilizando la pipeta pulida por fuego de diámetro medio.
- Transfiera las tiras de tejido a la solución enzimática descrita en el paso 2.3 utilizando una pipeta de diámetro medio pulida por fuego e incubar durante 30 minutos. Gire el tubo cada 3-5 minutos para evitar que las tiras de tejido se adhieran.
NOTA: Al comienzo de la digestión enzimática, las tiras de tejido se asientan rápidamente después de agitarse. A aproximadamente 20 minutos de digestión, las tiras de tejido comienzan a flotar en la solución enzimática después de agitarse. Durante este tiempo, las tiras de tejido auricular también cambian en apariencia de rosa pálido a blanco a medida que se digieren. - Después de la digestión enzimática, realice tres lavados utilizando 2,5 ml de solución de KB en los tubos inferiores redondos de 5 ml preparados en el paso 2.4. Para cada lavado, invierta suavemente el tubo 3 veces antes de mover el tejido al siguiente tubo utilizando la pipeta pulida al fuego de diámetro medio. Después del lavado final, transfiera las tiras al tubo inferior redondo de 14 ml que contiene 2,5 ml de solución de KB. Espere 5 minutos.
- Triturar suavemente el tejido durante 7,5 minutos con la pipeta pulida al fuego de diámetro ancho. Esto disociará mecánicamente las tiras de tejido y producirá una solución turbia llena de miocitos auriculares individuales.
NOTA: Durante la trituración, el tejido se vuelve blanco y la solución se vuelve turbia. La fuerza de la trituración, lograda alterando tanto la frecuencia como la velocidad de expulsión de las tiras de tejido de la pipeta pulida por fuego de diámetro ancho, debe adaptarse al aislamiento individual. Si la trituración es demasiado suave, el rendimiento celular será bajo, mientras que la trituración que es demasiado dura producirá muchas células muertas. Evite las burbujas mientras tritura. - Llene el tubo inferior redondo de 14 ml que contiene las tiras de tejido triturado con solución KB a un volumen final de 7-10 ml dependiendo de la densidad deseada de las células para uso experimental. Coloque este tubo a temperatura ambiente durante 1 h. Después de este período de incubación, las células se pueden utilizar para una variedad de experimentos de hasta 7 h. Las células también se pueden almacenar a 4 oC para hasta 7 h.
Resultados
Los miocitos auriculares aislados mediante este protocolo se pueden utilizar para caracterizar las propiedades electrofisiológicas de estas células utilizando la técnica de abrazadera de parche. Las alícuotas de los miocitos auriculares en la solución KB se pueden añadir a la cámara de grabación de un aparato de abrazadera de parche estándar y superfusionarse con soluciones adecuadas para el tipo de grabación que el experimentalista desea realizar. Los miocitos auriculares aislados utilizando este protocolo se utilizan mejor para estudios electrofisiológicos dentro de 6-7 h de aislamiento. A continuación se presentan los datos representativos de la abrazadera de parche de nuestro laboratorio.
La Figura 4 ilustra ejemplos de miocitos auriculares aislados de ratones normales preparados utilizando el protocolo anterior. Los miocitos auriculares aislados son típicamente del orden de 100 m de longitud y 10 m de ancho con estrías claras. La capacitancia de los miocitos auriculares aislados es típicamente 40-70 pF.
La Figura 5A ilustra un ejemplo de un AP de miocitos auriculares grabado utilizando latécnica perforada de abrazadera de parche en modo de abrazadera de corriente, como hemos descrito anteriormente 6,19,20. En la Tabla 6se proporcionan datos resumisos que ilustran los parámetros típicos de los myocitos atriales AP. Específicamente, presentamos datos resumidos para mediciones del potencial demembrana en reposo (RMP), velocidad máxima de upstroke (V max), repolarización de rebasamiento (OS) y AP al 50% (APD50),70% (APD70) y 90% (APD90) repolarización tiempo (Tabla 6). Los AP también se pueden registrar en toda la configuración de la célula14. Las soluciones de superfusión y pipeta para la grabación de puntos de acceso están disponibles en el Cuadro 7 y en la Tabla8.
La Figura 5B ilustra una familia representativa de Corrientes Na+ (INa)registradas en toda la configuración celular de la técnica patch-clamp. Estas corrientes se registraron utilizando pasos de abrazadera de voltaje de 50 ms entre -100 y +10 mV desde un potencial de retención de -120 mV. Hemos descrito enfoques y protocolos para la grabación INa anteriormente6,14,20. Un resumen IRelación Na IV también se presenta en la Figura 5B. Las soluciones utilizadas para registrar INa se presentan en el Cuadro 7 y en el Cuadro8.
La Figura 5C ilustra una familia representativa de corrientes Ca2+ (ICa,L)registradas en toda la configuración de celda de la técnica patch-clamp. Estas corrientes se registraron utilizando pasos de abrazadera de voltaje de 250 ms entre -60 y +80 mV desde un potencial de retención de -70 mV. Las condiciones experimentales que se pueden utilizar para medir ICa,L se han descrito previamente17,18,20. Un resumenI Ca,L IV relación también se presenta en la Figura 5C. Las soluciones utilizadas para grabar ICa,L están disponibles en el Cuadro 7 y en el Cuadro8.
La Figura 5D ilustra una familia representativa de corrientes K+ (IK) registradas en toda la configuración de celda de la técnica de abrazadera de parche. Estas corrientes se registraron a partir de un potencial de retención de -80 mV utilizando pasos de abrazaderade voltaje de 500 ms entre -120 mV y +80 mV, como hemos descrito anteriormente 6,14. La relación sumaria IV para el total IK también se presenta en la Figura 5D. Las soluciones utilizadas para grabar IK están disponibles en el Cuadro 7 y en el Cuadro 8.
El uso de estos enfoques para registrar los puntos de acceso y las principales familias de corrientes iónicas, incluyendo Na+, Ca2+ y K+ corrientes (como se ilustra arriba), permite al investigador interrogar rigurosamente la electrofisiología de miocitos auriculares en un plétora de condiciones experimentales. Nuestro laboratorio ha empleado rutinariamente estas técnicas para estudiar la electrofisiología de miocitos auriculares en ratones normales, en modelos de ratón de enfermedades del corazón, y en ratones modificados genéticamente6,14,17,18 ,19,20.
Figura 1: Diagrama de flujo para el protocolo de aislamiento de myocitos auriculares. Resumen de los pasos utilizados para aislar los miocitos auriculares utilizando este protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Herramientas experimentales de configuración y disección para el aislamiento de miocitos auriculares. (A). Se utiliza una pipeta de diámetro pequeño pulido al fuego con una abertura de 1 mm de diámetro (izquierda) para la transferencia de tejido después de la disección, se utiliza una pipeta de diámetro medio pulida por fuego con una abertura de 3 mm de diámetro (medio) para transferir tiras de tejido durante el aislamiento, y una pipeta de gran diámetro pulido contra incendios con una abertura de 5 mm de diámetro (derecha) se utiliza para la trituración de tejido auricular digerido. (B). Configuración experimental para aislamiento de miocitos auriculares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen de la disección del apéndice auricular. (A). Imagen de campo brillante representativa de un apéndice auricular extirpado cortado y anclado. (B). Representa la imagen de campo brillante del apéndice auricular cortado en tiras de tejido de aproximadamente 0,7 mm de ancho. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes de miocitos auriculares aislados. (A). Imagen de Brightfield de miocitos auriculares aislados inmediatamente después del aislamiento. Barra de escala a 50 m. (B). imagen de Brightfield de un único miocito auricular aislado. Barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Datos representativos de abrazaderas de parche sortea obtenidos de miocitos auriculares aislados. (A). Representante estimuló la grabación AP de un miocito auricular aislado. El resumen de los parámetros AP se presenta en el cuadro6. Se añadió anfotericina B (200 g/ml) a la solución de pipeta para permeabilizar la membrana celular. (B). Representación INa grabaciones (izquierda) y resumen ICurva Na IV (derecha) de un miocito auricular aislado. Nifedipino (10 m) se ha añadido a la solución modificada de Tyrode para bloquear ICa,L al grabar INa. C. Registros De Representante ICa,L (izquierda) y resumen ICa,L IV curva (derecha) de un miocito auricular aislado. (D). Representación IK grabaciones (izquierda) y resumen IK IV curva (derecha) de un miocyte auricular aislado. Las soluciones utilizadas para registrar cada una de estas corrientes se enumeran en el Cuadro 7 y en el Cuadro8. Las curvas sumarias IV son mediciones promediadas de 10 miocitos auriculares aislados de un ratón de tipo salvaje macho C57Bl/6 de 15 semanas de edad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Stock Tyrode's pH 6.9 | Stock Tyrode's pH 7.4 | |
| Química | en mM | en mM |
| Nacl | 140 | 140 |
| Kcl | 5.4 | 5.4 |
| KH2PO4 | 1.2 | 1.2 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Volumen final | 500 mL | 1 L |
| PH final con NaOH | 6.9 | 7.4 |
Tabla 1: Stock Tyrode's pH 7.4 y stock Tyrode's pH 6.9 soluciones. Composición de las soluciones de Stock Tyrode (pH 7.4 y pH 6.9) que se pueden hacer con antelación y almacenar a 4oC durante un máximo de 2 meses.
| Química | en mM |
| K-glutamato | 100 |
| K-aspartato | 10 |
| Kcl | 25 |
| KH2PO4 | 10 |
| MgSO4 | 2 |
| Taurina | 20 |
| Creatina | 5 |
| Egta | 0.5 |
| Glucosa | 20 |
| HEPES | 5 |
| Bsa | 0,10% |
| Volumen final | 1 L |
| PH final con KOH | 7.2 |
Tabla 2: Solución de KB modificada. Receta para la solución de KB modificada que se puede hacer con antelación, alícuota y almacenar a -20 oC durante un máximo de 2 meses.
| Química | Cantidad |
| Glucosa | 5,55 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 1,8 mM |
| Stock Tyrode's pH 7.4 | 50 mL |
| Heparina | 250 l |
Tabla 3: Modificación de la solución de pH 7.4 de Tyrode con glucosa, magnesio, calcio y heparina. Composición de la solución modificada de pH 7.4 de Tyrode utilizada para la disección de tejido auricular. Esta solución debe hacerse fresca y mantenerse en un baño de agua de 35 oC hasta su uso.
| Química | Cantidad |
| Glucosa | 18,5 mM |
| Taurina | 49,96 mM |
| Bsa | 15 mg |
| CaCl2 | 0.066 mM |
| Stock Tyrode's pH 6.9 | 15 ml |
Tabla 4: Se ha modificado la solución de pH 6.9 de Tyrode que contiene glucosa, taurina, BSA y bajo nivel de calcio. Composición de la solución modificada de pH 6.9 de Tyrode utilizada para el aislamiento de miocitos auriculares. Esta solución debe hacerse fresca y mantenerse en un baño de agua de 35 oC hasta su uso.
| Química | Cantidad |
| Colagenasa | 1.064 U |
| Elastasa | 9 U |
| Solución de proteasa | 65,2 l |
| Modificado pH de Tyrode 6.9 | 5 mL |
Tabla 5: Solución enzimática. Composición de la solución enzimática utilizada para digerir enzimáticamente tiras de tejido auricular. Esta solución debe hacerse fresca y mantenerse en un baño de agua de 35 oC hasta su uso.
| Parámetro | Promedio |
| RMP (mV) | -74,2 á 0,7 |
| Vmax (V/s) | 144,6 a 5,8 |
| Sistema operativo (mV) | 71,9 a 3,0 |
| APD50 (ms) | 11,1 a 1,7 |
| APD70 (ms) | 23,0 a 4,6 |
| APD90 (ms) | 54,7 a 7,8 |
Tabla 6: Resumen de los parámetros AP de los miocitos auriculares aislados. Los datos se presentan como medias de SEM, n a 10 miocitos auriculares aislados de un ratón de 15 semanas de tipo salvaje masculino C57Bl/6.
| Corrientes de potasio y AP | Corrientes de sodio | Corrientes de calcio | |
| Química | en mM | en mM | en mM |
| Nacl | 140 | 5 | |
| Kcl | 5.4 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 1 | 1 | 2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| Glucosa | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| Cscl | 130 | ||
| TEA-Cl | 5.4 | 145.5 | |
| Ph | 7.4 con NaOH | 7.4 con CsOH | 7.4 con CsOH |
Tabla 7: Composición de las soluciones de Tyrode utilizadas durante los experimentos con abrazaderas de parches. Composición de las soluciones de Tyrode utilizadas para grabar AP, INa,ICa,L, yI K de miocitos auriculares aislados.
| Corrientes de potasio y AP | Corrientes de sodio | Corrientes de calcio | |
| Química | en mM | en mM | en mM |
| Nacl | 5 | 5 | 5 |
| Kcl | 140 | ||
| MgCl2 | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| Egta | 5 | 5 | |
| Mg-ATP | 4 | 5 | 4 |
| Na-GTP | 0.3 | 0.3 | 0.3 |
| Na-fosfocreatina | 6.6 | 6.6 | |
| Cscl | 130 | 135 | |
| BAPTA | 5 | ||
| Ph | 7.2 con KOH | 7.2 con CsOH | 7.2 con CsOH |
Tabla 8: Composición de la solución de pipeta interna utilizada durante los experimentos con abrazaderas de parches. Composición de las soluciones de llenado de pipetas utilizadas para registrar AP, INa,ICa,L,yI K de miocitos auriculares aislados.
Discusión
Nuestro laboratorio utiliza rutinariamente este protocolo para aislar los miocitos auriculares del ratón para su uso en experimentos con abrazaderas de parches con el fin de investigar los efectos de diferentes formas de enfermedad cardiovascular, mutaciones genéticas o compuestos farmacológicos en miocitos auriculares Electrofisiología. Aunque altamente reproducible, la calidad de los datos obtenidos de los miocitos auriculares aislados depende de la calidad del aislamiento. Además, la reintroducción de calcio tras el aislamiento de miocitos auriculares dará lugar a la muerte celular de una población de miocitos aislados debido a la paradoja del calcio16. En consecuencia, aislar los miocitos auriculares viables y de alta calidad utilizando este enfoque requiere práctica y optimización en múltiples puntos a lo largo del aislamiento. Una vez optimizado, se estima que entre el 70-90% del total de miocitos auriculares aislados utilizando este enfoque será tolerante al calcio y en forma de varilla. Los pasos que requieren la mayor cantidad de práctica y optimización se describen a continuación.
La velocidad y la eficiencia de la disección tendrán efectos aguas abajo en la calidad de las células aisladas. Es importante tomar tiempo para asegurarse de que toda la sangre se extrae del tejido auricular y que las tiras de tejido se cortan a un tamaño similar. Debe tomar aproximadamente 5 minutos para extraer el apéndice auricular, cortar el tejido en tiras, y transferir las tiras de tejido en el primer tubo de la solución modificada de pH 6.9 de Tyrode. Sin embargo, si este paso toma demasiado tiempo, la calidad del tejido puede verse comprometida.
También es importante que las tiras de tejido se corten a un tamaño uniforme dentro de un aislamiento y entre los corazones. Si las tiras de tejido son demasiado grandes o demasiado pequeñas, o si no son uniformes dentro de un aislamiento, esto puede causar problemas durante la digestión enzimática y la trituración. Esto se debe a que las tiras pequeñas se digerirán más a fondo y las tiras grandes se irán debajo de la digestión. Es igualmente importante considerar el genotipo y el entorno de la enfermedad que se está estudiando, ya que el tamaño del apéndice auricular puede variar entre los animales. Por ejemplo, los corazones hipertróficos tienen apéndices auriculares más grandes en comparación con los corazones sanos, y por lo tanto el experimentador puede cortar más tiras en corazones hipertróficos en comparación con los corazones de tamaño normal. En consecuencia, optimizar el tamaño de las tiras de tejido cortado y aplicar estas dimensiones a cada apéndice auricular individual mejorará en gran medida la reproducibilidad de los aislamientos de miocitos entre condiciones experimentales.
El delicado equilibrio entre la digestión enzimática y la disociación mecánica es clave para un aislamiento exitoso de miocitos auriculares utilizando este protocolo. Si el tejido no se arremolina adecuadamente durante la digestión enzimática, las tiras de tejido individuales tenderán a aglutinarse y pegarse juntas, lo que limitará la eficacia de la digestión enzimática. Si se agita con demasiada frecuencia o vigorosamente, esto puede dañar el tejido auricular, lo que resultará en el aislamiento de células no viables. La disociación mecánica de los miocitos auriculares aislados de las tiras tisulares durante la trituración es el paso más crítico para practicar y optimizar el uso de este enfoque para aislar los miocitos auriculares. Si la trituración es demasiado suave, el rendimiento celular será bajo. Por otro lado, si la trituración es demasiado dura, entonces se aislará una abundancia de miocitos inviables, y se pondrá en peligro la calidad de los datos obtenidos durante los experimentos de abrazadera de parche. Además, la composición de las arículas puede afectar al aislamiento. Por ejemplo, si el tejido es fibroso, es posible que sea necesario modificar la digestión enzimática y los pasos de trituración. Por lo tanto, es importante tomarse el tiempo para desarrollar las habilidades necesarias para obtener células de alta calidad durante la trituración que se pueden utilizar para experimentos con abrazaderas de parches.
Al igual que con todas las técnicas experimentales hay limitaciones. Esta técnica requiere práctica para aislar reproduciblemente miocitos viables y de alta calidad, lo que a su vez afectará la viabilidad de cualquier experimento a realizar utilizando estos miocitos. Este enfoque también es terminal y los miocitos auriculares aislados utilizando este enfoque solo se pueden utilizar el día del aislamiento. Nuestro laboratorio utiliza las células dentro de 6-7 h de aislamiento.
Este enfoque de aislar los cardiomiocitos auriculares tiene varias aplicaciones. Por ejemplo, este enfoque se puede modificar para aislar los miocitos auriculares (así como los fibroblastos cardíacos) de otras especies, incluidas las biopsias de tejido auricular humano. Además, un beneficio del uso de este método de fragmento según el aislamiento de miocitos auriculares (en contraste con la perfusión retrógrada del corazón) es que se puede modificar para aislar a los cardiomiocitos de otras regiones del corazón, como el nodo sinoauricular u otras regiones específicas del miocardio auricular, o abarcar toda la región supraventricular del corazón. Nuestro laboratorio utiliza cardiomiocitos auriculares para experimentos con abrazaderas de parches para medir los potenciales de acción y las corrientes iónicas, aunque este enfoque no tiene por qué limitarse a esta técnica. Por ejemplo, los miocitos aislados se pueden utilizar para investigar alteraciones en los transitorios de calcio y contractilidad en una variedad de entornos experimentales. Los cardiomiocitos auriculares también se pueden utilizar en estudios de inmunofluorescencia para estudiar la ubicación de proteínas o estructuras de interés. En consecuencia, este enfoque es muy versátil con muchas aplicaciones posibles.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (MOP 93718, 142486) y la Fundación Corazón y Accidente Cerebrovascular de Canadá a R.A. Rose. H.J. Jansen es el receptor de una beca postdoctoral Killam.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1, 2-Bis(2-aminofenoxi)etano-N, N, N'-ácido tetraacético 98% | Sigma | A4926-1G | |
| Adenosina 5'-trifosfato sal disódica hidrato BioXtra, > 99%, de microbiano | Sigma | A7699-1G | |
| Adenosina 5'-trifosfato sal de magnesio > 95%, bacteriana | Sigma | A9187-1G | |
| Anfocetericina B de Streptomyces sp. ~80% (HPLC), polvo | Sigma | A4888-500 MG | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A3059-50G | |
| Cloruro de calcio dihidratado | Sigma | 223506-500G | |
| Cloruro de cesio ReactivoPlus, 99,9% | Sigma | 289329-100G | |
| Hidróxido de cesio monohidratado > 99,5% base de metales traza | Sigma | 562505-1KG | |
| Colagenasa Tipo 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatina anhidra | Sigma | C0780 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma | G7021-1KG | |
| DL-Ácido aspártico sal de potasio | Sigma | A2025-100G | |
| Suspensión de elastasa | Worthington Biochemical Corporation | ||
| Ácido etilenglicol-bis(2-amino-etiléter)-N,N,N',N'-tetraacético >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
| Guanosina 5'-trifosfato sodio sal hidratada > 95% (HPLC), polvo | Sigma | G8877-250MG | |
| Heparina 10 000 USP U/10 mL | SANDOZ | 10750 | |
| HEPES > 99,5% (valoración) | Sigma | H3375-500G | |
| Ácido L-glutámico sal potásica monohidratado > 99% (HPLC), polvo | Sigma | G1501-500G | |
| Sulfato de magnesio | Sigma | M2643-500G | |
| Nifedipino > 98% (HPLC), polvo | Sigma | N7634-1G | |
| Sal disódica de fosfocreatina hidratada enzimática, aprox. 98% | Sigma | P7936-5G | |
| Cloruro de potasio ACS reactivo, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
| Hidróxido de potasio | EM Science | PX1480-1 | |
| Fosfato de potasio monobásico | EMD | PX1565-1 | |
| Proteasa de Streptomyces griseus, tipo XIV, >3.5 unidades/mg sólido, polvo | Sigma | P5147-1G | |
| Reactivo de cloruro de sodio ACS, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
| Hidróxido de sodio, pellets, 97+%, reactivo A.C.S. | Sigma | 221465-500G | |
| Sylgard 184 kit de elastómero de silicona | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
| Taurina | Sigma | T0625-100G | |
| Cloruro de tetraetilamonio > 98% (valoración) | Sigma | T2265-100G |
Referencias
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