Summary
Her beskrives protokoller for isolering af Cyanobakterielle frigivne kulhydratpolymerer og isolering af deres exoproteomer. Begge procedurer legemliggøre vigtige skridt til at opnå polymerer eller proteiner med høj renhed grader, der kan anvendes til yderligere analyse eller applikationer. De kan også nemt tilpasses efter specifikke brugerbehov.
Abstract
Cyanobakterier kan aktivt udskilte en bred vifte af biomolekyler i det ekstracellulære miljø, såsom heteropolysaccharider og proteiner. Identifikationen og karakteriseringen af disse biomolekyler kan forbedre kendskabet til deres udskillelsesveje og medvirke til at manipulere dem. Desuden er nogle af disse biomolekyler også interessante med hensyn til bioteknologiske anvendelser. Beskrevet her er to protokoller for nem og hurtig isolering af cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og proteiner. Metoden til isolering af frigivne kulhydratpolymerer er baseret på konventionelle udfældnings teknikker af polysaccharider i vandige opløsninger med organiske opløsningsmidler. Denne metode bevarer polymerens egenskaber og undgår samtidig tilstedeværelsen af forurenende stoffer fra cellerester og kulturmedium. Ved afslutningen af processen er den frysetørrede polymer klar til at blive brugt eller karakteriseret eller kan underkastes yderligere oprensnings runder afhængigt af den endelige tilsigtede anvendelse. Med hensyn til isolationen af cyanobakterial exoproteom er teknikken baseret på koncentrationen af det celle frie medium efter fjernelse af de vigtigste forurenende stoffer ved centrifugering og filtration. Denne strategi giver mulighed for pålidelig isolering af proteiner, der når frem til det ekstracellulære miljø via membran transportører eller ydre membran vesikler. Disse proteiner kan efterfølgende identificeres ved hjælp af standard massespektrometri teknikker. De protokoller, der præsenteres her, kan anvendes ikke kun til en bred vifte af cyanobakterier, men også til andre bakteriestammer. Desuden, disse procedurer kan let skræddersys i henhold til den endelige anvendelse af de produkter, renhedsgrad kræves, og bakteriel stamme.
Introduction
Cyanobakterier er bredt anerkendt som produktive kilder til naturlige produkter med lovende bioteknologiske/biomedicinske applikationer. Derfor er forståelse cyanobakteriale sekretions mekanismer og optimering af udvinding/nyttiggørelse metoder afgørende for at gennemføre cyanobakterier som effektive mikrobielle cellefabrikker.
Mange cyanobakteriale stammer er i stand til at producere ekstracellulære polymere stoffer (EPS), hovedsagelig dannet af heteropolysaccharider, der forbliver forbundet til cellens overflade eller frigives til mediet1. Disse frigivne kulhydratpolymerer har forskellige egenskaber sammenlignet med dem fra andre bakterier, som gør dem egnede til en bred vifte af anvendelser (f. eks. antivirale2, immunostimulatorisk3, antioxidant4, metal-chelating5, emulgerende6, og Drug levering agenter7,8). Metode til isolering af disse polymerer bidrager i høj grad ikke kun til bedre udbytte, men også til øget renhed og de specifikke fysiske egenskaber af polymer opnået9. Et stort flertal af disse metoder til isolering af polymerer er afhængige af udfældnings strategier fra det dyrkningsmedium, der let opnås på grund af polymerens stærke anioniske natur9,10. Desuden kan fjernelse af opløsningsmidler, der anvendes i udfældnings trinnet, hurtigt opnås ved fordampning og/eller lyofilisering. Afhængigt af den planlagte applikation kan forskellige trin kobles enten efter eller før polymer nedbør for at skræddersy det endelige produkt, som omfatter behandling af trichloreddikesyre (TCA), filtrering eller størrelses ekskluderings kromatografi (SEC) kolonne rensning10.
Cyanobakterier kan også udskille en lang række proteiner gennem veje, der er afhængige af membran transportører (klassisk)11 eller medieret af vesikler (ikke-klassisk)12. Derfor er analyse af cyanobakteriel exoproteom et vigtigt redskab, både til at forstå/manipulere cyanobakteriale protein sekretions mekanismer og forstå den specifikke ekstracellulære funktion af disse proteiner. Pålidelig isolation og analyse af exoproteomer kræver koncentrationen af det ekstracellulære miljø, da forekomsten af udskilte proteiner er relativt lav. Desuden kan andre fysiske eller kemiske trin (f. eks. centrifugering, filtrering eller protein fældning) optimere kvaliteten af det opnåede exoproteome, berige proteinindholdet13og undgå tilstedeværelsen af forurenende stoffer (f. eks. pigmenter, kulhydrater osv.) 14 , 15 eller over vægten af intracellulære proteiner i prøverne. Men nogle af disse trin kan også begrænse det sæt af proteiner, der kan påvises, hvilket fører til en partisk analyse.
Dette arbejde beskriver effektive protokoller for isolering af frigivne kulhydratpolymerer og exoproteomer fra cyanobakterier kultur medier. Disse protokoller kan let tilpasses undersøgelsens specifikke mål og brugernes behov, samtidig med at de grundlæggende trin, der præsenteres her, bevares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cyanobakterial frigivet kulhydrat polymer isolation
-
Polymer isolering og fjernelse af forurenende stoffer
- Den cyanobakteriale stamme dyrkes under standardbetingelser [f. eks. 30 °C under et 12 timer lys (50 μE m− 2s− 1)/12 h mørkt regime, med omrystning ved 150 rpm]. Mål vækst ved hjælp af standardprotokoller [f. eks. optisk tæthed ved 730 nm (OD730nm), klorofyl a, tørvægt osv.], og mål derefter produktionen af frigivne polysaccharider i henhold til phenol-svovlsyre-metoden16.
- Kulturen overføres til dialyse membraner (12-14 kDa af molekylvægt cut-off) og dialysere mod mindst 10 volumener af deioniseret vand i 24 timer med kontinuerlig omrøring.
Bemærk: afhængigt af mængden af kultur for at dialysere og medium sammensætning, kan det være nødvendigt at ændre dialyse vand. - Centrifugér kulturen ved 15.000 x g i 15 minutter ved 4 °c. Supernatanten overføres til et nyt hætteglas, og pelleten (cellerne) kasseres.
- Centrifugeres igen ved 20.000 x g i 15 minutter ved 4 °c for at fjerne kontaminanter såsom cellevægrester eller lipopolysaccharider (LPS).
- Overfør supernatanten til et glasbæger, og kassér pellet.
-
Udfældning af polymer
- Tilsæt 2 volumen 96% ethanol til supernatanten.
- Suspensionen inkubates ved 4 °C, mindst natten over.
- Polymer opsving
- For små eller ikke synlige mængder af fældet polymer: centrifuger suspensionen ved 13.000 x g i 25 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres, og pelleten opslæmmes i 1 ml eller 2 ml autoklaveres deioniseret vand. Overfør den vandige suspension til et hætteglas.
Forsigtig: supernatanten skal kasseres forsigtigt, da det let kan blive resuspenderet. - For synlige/store mængder af fældet polymer: Saml den udfældede polymer med sterile metal pincet til et hætteglas. Klem polymer og kassere overskydende ethanol.
- For små eller ikke synlige mængder af fældet polymer: centrifuger suspensionen ved 13.000 x g i 25 minutter ved 4 °c. Supernatanten kasseres, og pelleten opslæmmes i 1 ml eller 2 ml autoklaveres deioniseret vand. Overfør den vandige suspension til et hætteglas.
- Valgfrit: afhængigt af graden af polymer rensning kræves, gentages udfældnings trinnet med 96% ethanol efter opblanding af polymerer i deioniseret vand.
-
Lyofilisering af polymeren
- Opbevar hætteglassene med den udfældede polymer ved-80 °C, mindst natten over.
- Frysetørret (lyophilize) polymeren i mindst 48 h (Lad ikke suspensionen afrimning før frysetørring).
- Opbevar den tørrede polymer ved stuetemperatur (RT) indtil videre brug.
Bemærk: det tilrådes at opbevare polymeren i en ekssikkator, da den kan absorbere vand over tid.
2. cyanobakterial exoproteome isolation
-
Medium koncentration
- At dyrke cyanobakterier under standardbetingelser [f. eks. 30 °C under en 12 h lys (50 μE m− 2s− 1)/12 h mørkt regime, med orbital omrystning ved 150 rpm]. Overvåge cyanobacterium-væksten ved hjælp af standardprocedurer (f. eks. OD730nm, klorofyl a, tørvægt osv.).
- Centrifuger kulturerne ved 4.000 x g, i 10 minutter ved rt.
- Supernatanten overføres til en kolbe, og celle pellet kasseres.
- Filtrer det deanterede medium gennem et 0,2 μm pore størrelses filter.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her i et kort tidsrum, hvis mediet holdes på 4 °C. - Koncentratet koncentreres omkring 500x (i betragtning af den oprindelige volumen af filtreret medium), ved hjælp af centrifugal koncentratorer med en nominel molekylvægt cut-off af 3 kDa. Centrifugering skal anvendes ved 4.000 x g (højst 1 t pr. Centrifugerings runde) ved 15 °c.
Forsigtig: for de fleste koncentratorbrands skal filter anordningen skylles ved centrifugering med ultrarent vand før brug. Når filteret er vådt, lad det ikke tørre ud. Efterlad nok væske på reservoiret, når enheden ikke er i brug.
Bemærk: det kan være nyttigt at reducere Centrifugerings temperaturen til 4 °C, hvis målet er at studere protein aktivitet, selv om det vil øge den tid, der er nødvendig for prøve koncentrationen. Protokollen kan sættes på pause mellem Centrifugerings trinene i korte perioder, hvis mediet holdes på 4 °C. - Skyl væggene på filter enhedens prøve reservoir med den koncentrerede prøve, og Overfør indholdet til et mikrocentrifuge glas.
- Udfør et ekstra vaske trin af filter enhedens prøve reservoir med autoklaveres-kulturmedium for at sikre maksimal exoproteome restitution.
Bemærk: for at kvantificere procentdelen af genfinding skal du følge producentens anvisninger. - Exoproteome-prøverne opbevares ved-20 °C indtil videre anvendelse.
Bemærk: tilsætning af proteasehæmmere anbefales til langtidsopbevaring.
-
Analyse af exoproteomet
- Kvantificere proteinindholdet ved BCA protein assay i 96-brønd plade i henhold til producentens anvisninger.
- Adskil proteinerne med natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side) ved hjælp af standard farvningsprotokoller (f. eks. Coomassie Blue, sølvfarvning).
- Skær de bands/gel områder af interesse og indsamle dem i forskellige mikrocentrifuge glas, der indeholder passende mængder af ultra-rent vand.
- Fortsæt med identifikation og analyse af proteinerne ved massespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1afbilder en skematisk gengivelse af den beskrevne metode til udpakning af frigivne kulhydratpolymerer fra cyanobakteriale kulturer. Udfældede polymerer fra den moderate EPS-producent cyanobacterium Synechocystis Sp. pcc 6803 og den effektive EPS-producent cyanothece sp. CCY 0110 er vist i figur 2. I figur 3vises lyofiliserede polymerer med forskellige grader af kontaminering, som fremhæver betydningen af Centrifugerings trinnene for den endelige vares renhed. Figur 4 viser isolations metoden for cyanobakterial exoproteome. I figur 5vises særskilte celle frie medium koncentrerede prøver (dvs. fremstillet af kulturer i forskellige vækstfaser og fra en cyanobakterial stamme med lavere carotenoid-produktion). Exoproteom prøver fra to morfologisk adskilte cyanobakteriale stammer, de unicellulære cyanobakterier synechocystis Sp. PCC 6803 og filamentøse cyanobakterier anabaena Sp. PCC 7120, adskilt af SDS-Page, er vist i Figur 6.
Figur 1 : Arbejdsgang for isolering af cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer. Startende fra cyanobakteriel kulturen og fjernelse af forurenende stoffer og slutter med polymer isolation og lyofilisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Cyanobakteriale polymerer efter udfældning. A) polymer fra den moderate EPS-producent Synechocystis Sp. PCC 6803 på centrifuge kolbens væg efter udfældning og centrifugering (pile). B) polymer klumper fra den effektive EPS-producent cyanothece sp. CCY 0110 svævende i glas bægerglasset efter udfældning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Lyofiliserede cyanobakteriale polymerer. A) tre uafhængige partier af polymerer isoleret fra Synechocystis Sp. PCC 6803: uden synlig kontaminering (AI)og med pigmentering, der indikerer kontaminering med carotenoider (AII) eller cellerester (AIII) . B) lyofiliseret polymer fra cyanothece sp. CCY 0110. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Arbejdsproces for cyanobakterial exoproteome isolation. Fra cyanobakterial kultur til medium adskillelse og koncentration, slutter med exoproteome analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Mikrocentrifuge glas med koncentrerede celle frie medium prøver. A) koncentrerede medium prøver fra Synechocystis Sp. PCC 6803 Wild-type, indsamlet ved forskellige OD730nm (0,5, 1 og 2). B) koncentreret middel prøve fra Synechocystis ∆sigf, en mutant med nedsat produktion af carotenoider15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Coomassie med blåt BEJDSET SDS-side geler, der viser proteinerne akkumuleret i cyanobakteriel-frit, koncentreret medium. A) exoproteome fra unicellulære cyanobakterier Synechocystis sp. PCC 6803 Wild-type og ∆sigf mutant. B) exoproteom fra Synechocystis ∆sigf , som er forurenet med høje niveauer af polysaccharider. C) exoproteome fra den filamentøse cyanobacterium anabaena sp. PCC 7120. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For bedre at forstå bakterielle sekretions mekanismer og studere de frigivne produkter er det af yderste vigtighed at påvise effektiv isolation og analyse af de biomolekyler, der findes i det ekstracellulære bakterie miljø (f. eks. frigivet carbohydratpolymerer og proteiner).
Cyanobakteriale ekstracellulære kulhydratpolymerer er ekstremt komplekse, hovedsagelig på grund af antallet og andelen af forskellige monosaccharider, der udgør deres sammensætning1. De konventionelle metoder, der anvendes til isolering af disse polymere stoffer, er afhængige af det enkle koncept, at disse sukker rige stoffer er opløselige i vandige opløsninger og kan udfældede ved tilsætning af organiske opløsningsmidler (såsom acetone eller ethanol)9 ,17,18. Dette sker på grund af udvinding af vandmolekyler fra polymerer ' hydrering skaller, og effektiviteten af processen afhænger uløseligt på polymerens molekylvægt (mere effektiv ved højere molekylvægt fraktioner), kemisk struktur, og koncentration9,18. Ud over udfældnings trinnet omfatter den beskrevne metode de kritiske trin i dialyse og centrifugering. Dialyse vil effektivt fjerne salte og andre forbindelser fra mediet, som kan forekomme efter lyofilisering som pulverlignende strukturer, mens Centrifugerings trinnene vil fjerne større forurenende stoffer og cellerester.
Svigt i disse trin kan føre til polymerer med høje kontamineringsniveauer og forskellige egenskaber, afhængigt af isolations partiet. Nogle forureninger kan let detekteres makroskopisk efter polymer lyofilisering, da de vil ændre polymer pigmentering (normalt hvid eller lys brun). For eksempel er lyofiliserede polymerer, der er grønne eller orange, generelt meget forurenet med celleaffald/klorofyl eller carotenoider. Dette er relateret til utilstrækkelig tid eller g kraft i Centrifugerings trinene. Men nogle cyanobakteriale stammer kan frigive pigmenter og udskiller proteiner, der forbliver naturligt forbundet med polymerer, og dette skal tages i betragtning ved analyse af det endelige produkt19. Yderligere trin kan tilføjes for yderligere at rense polymerer (f. eks TCA behandlinger)10. Ikke desto mindre kan disse rensningstrin også have en negativ indvirkning på det endelige produkt, da fjernelse af proteiner og andre komponenter kan ændre polymer egenskaberne (f. eks. viskositet, hydrofobiby osv.) 1 , 20. selv gentage nedbør/lyophilization trin kan negativt påvirke polymerer, hovedsagelig på grund af fryse-optøning cyklusser, der nemt ændre deres fysisk-kemiske egenskaber21. For at forbedre polymer udbyttet, kan varmebehandlinger anvendes til hele kulturer før udfældning. Dette ekstra trin frigiver polymer forbundet med cellens overflade, men det kan også føre til depolymerisering18,20. Sammenfattende er det vigtigt at bemærke, at valget af protokol vil påvirke både mængden og kvaliteten af isolerede polymerer9,20.
Med hensyn til de cyanobakteriale proteiner, der er identificeret i det ekstracellulære miljø, udviser de en bred vifte af molekylære vægte og isoelektriske punkter og kan enten være opløselige eller membran-associerede. Denne mangfoldighed af fysisk-kemiske egenskaber er et problem for udvælgelsen af den mest velegnede metode til exoproteome isolation. Den metode, der fremlægges her, afhænger i høj grad af koncentrationen af biomolekyler i det ekstracellulære miljø. Denne metode isolerer ikke kun proteiner, der udskilles i mediet, men også proteiner til stede i ydre membran vesikler (OMVs) og afledt af cellelyse. Derfor skal Centrifugerings trinene udføres forsigtigt for at undgå celle forstyrrelser, men samtidig indsamle OMVs. I cyanobakteriale stammer, der er effektive omvs producenter, er exoproteome præparater sædvanligvis orange på grund af tilstedeværelsen af carotenoider forbundet med disse lipidiske strukturer14,15. Denne funktion kan dog variere betydeligt afhængigt af den cyanobakteriale stamme og vækstfasen. For at vurdere proteiners bidrag ved OMVs bør der tilføjes ultracentrifugering trin til proceduren22. Desuden kan proteiner, der når frem til det ekstracellulære rum på grund af cellelyse, påvises ved at indsamle prøver i forskellige vækstfaser og øge antallet af replikater.
Som førnævnte, da mange cyanobakteriale stammer producerer ekstracellulære kulhydratpolymerer (EPS), kan exoproteome præparater også have EPS i deres sammensætning. Filtrerings trinnet skal bevare mere komplekse og store EPS, men enklere EPS-brøker kan i sidste ende passere igennem. Derfor kan kontaminering med store mængder kulhydrater interferere med exoproteome analyse. For eksempel kan denne kontaminering forårsage en forsinkelse i protein separation i polyacrylamid geler, samt maske mindre rigelige proteiner. Der er foreslået alternative protokoller for exoproteome isolation med henblik på at fjerne kontaminerende biomolekyler, som findes i det ekstracellulære medium, men de har vist sig at være meget selektive, hvilket kan føre til partiske exoproteome profiler13. På den anden side kan en vis mængde proteiner være fanget i mere komplekse EPS fraktioner, hvis de sidder fast i filteret. I dette tilfælde kan analyse af exoproteome præparater fra forskellige vækstfaser/eksperimentelle betingelser samt analyser af proteinerne i EPS-fraktioner hjælpe med at identificere de indesluttede proteiner.
Samlet set er de protokoller, der er beskrevet her, legemliggøre de afgørende skridt til effektiv isolering af cyanobakteriale frigivne kulhydratpolymerer og exoproteomer. Vigtigst af alt, de kan nemt skræddersys efter specifikke brugerbehov og omfatter andre bakteriestammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) midler gennem konkurrence 2020-Operacional programmet for konkurrenceevne og internationalisering (POCI), Portugal 2020, og af portugisiske fonde gennem FCT-Fundação para a Ciência e a tecnologia/Ministério da Ciência, tecnologia e ensino Superior inden for rammerne af projektet POCI-01-0145-FEDER-028779 og Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
