Summary
La ghiandola lacrimale (LG) ha due tipi di cellule che esprimono α-liscio muscolo actina (αSMA): cellule miepiteliali (MECs) e pericytes. I MECs sono di origine ectodermica, trovati in molti tessuti ghiandolari, mentre i periciti sono cellule muscolari lisce vascolari di origine endodermica. Questo protocollo isola i MECs e i periciti di murine LGs.
Abstract
La ghiandola lacrimale (LG) è una ghiandola tubuloacinar esocrina che secra uno strato acquoso di pellicola lacrimale. L'albero epiteliale LG è costituito da acinar, epiteliale duttale, e cellule miepiteliali (MECs). MECs Express Alpha liscio muscolo actina (αSMA) e hanno una funzione contrattile. Si trovano in più organi ghiandolari e sono di origine ectodermica. Inoltre, l'LG contiene cellule muscolari lisce vascolari SMA + di origine endodermica chiamate pericytes: cellule contrattili che avvolgono la superficie dei tubi vascolari. Un nuovo protocollo ci permette di isolare sia i MECs che i periciti dal LGs e dalle ghiandole sottomandibolari adulti (SMG). Il protocollo si basa sull'etichettatura genetica dei MECs e dei periciti utilizzando il ceppo del mouse SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL , seguito dalla preparazione della sospensione a singola cellula LG per la selezione delle cellule attivate a fluorescenza (FACS ). Il protocollo consente la separazione di queste due popolazioni di cellule di diversa origine in base all'espressione della molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) da parte di MECs, mentre i periciti non esprimono EpCAM. Le cellule isolate potrebbero essere utilizzate per la coltivazione di cellule o l'analisi dell'espressione genica.
Introduction
Le cellule mioepiteliali (MECs) sono presenti in molte ghiandole esocrine tra cui lacrimali, salivari, harderian, sudore, prostata, e mammaria. I MECs sono un tipo di cellula unico che combina un epiteliale e un fenotipo muscolare liscio. MECS Express α-liscio muscolo actina (SMA) e hanno una funzione contrattile1,2. Oltre ai MECs, la ghiandola lacrimale (LG) e la ghiandola sottomandibolare (SMG) contiene cellule vascolari SMA + chiamate pericytes, che sono cellule di origine endodermica che avvolgono la superficie dei tubi vascolari3. Sebbene MECS e periciti esprimano molti marcatori, SMA è l'unico marcatore che non è espresso in altre celle LG e SMG1,3.
Negli ultimi 40 anni, diversi laboratori hanno riferito saggi per la dissociazione di diversi tessuti della ghiandola esocrina, in cui sono stati applicati approcci non enzimatici ed enzimatici. In una delle prime relazioni pubblicate nel 1980, Fritz e i coautori hanno descritto un protocollo per isolare i parotidi felini utilizzando la digestione sequenziale in una soluzione4di collagenasi/tripsina. In 1989, Hann e coautori hanno regolato questo protocollo per l'isolamento di acini dal ratto LGs usando una miscela di collagenasi, ialuronidasi e DNase5. In 1990, Cripps e colleghi hanno pubblicato il metodo di dissociazione non enzimatica della ghiandola lacrimale acini6. In seguito, nel 1998, Zoukhri e coautori tornarono a un protocollo di dissociazione enzimatica per seguire l'imaging di CA2 +su LG e SMG isolato acini7. Nell'ultimo decennio, i ricercatori hanno rivolto la loro attenzione all'isolamento delle cellule staminali/progenitrici dalle ghiandole esocrine. Pringle e coautori hanno descritto un protocollo in 2011 per l'isolamento delle cellule staminali del topo SMG8. Questo metodo era basato sull'isolamento di salisfere contenenti cellule staminali, che sono state mantenute nella cultura. Gli autori hanno affermato che le cellule proliferanti che esprimono marcatori associati alle cellule staminali potrebbero essere isolate da questi salisfere8. Shatos e coautori hanno pubblicato il protocollo per l'isolamento delle cellule progenitrici da un LGs ratto adulto non infortunato usando la digestione enzimatica e raccogliendo le cellule "liberate"9. In seguito, nel 2015, Ackermann e i coautori regolarono questa procedura per isolare le presettive "cellule staminali della ghiandola lacriale murina" ("mLGSCs") che potevano essere propagate come coltura mono-strato su più passaggi10. Tuttavia, nessuna delle procedure prima menzionate consentiva di distinguere sottotipi cellulari e singole popolazioni di cellule epiteliali isolate. Nel 2016, Gromova e coautori hanno pubblicato una procedura per l'isolamento delle cellule staminali/progenitrici LG da adulti murine LGs utilizzando FACS11. Tuttavia, questo protocollo non intendeva isolare i MECs.
Recentemente, abbiamo dimostrato che siamo in grado di isolare le celle SMA + da 3 topi SMA-GFP12settimane. Tuttavia, in questo momento non abbiamo separato diverse popolazioni di cellule SMA +. Qui abbiamo istituito una nuova procedura per l'isolamento diretto di MECS differenziati e periciti da Lgs adulto e SMG.
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Protocol
Tutto il lavoro animale è stato condotto secondo le linee guida dell'Istituto nazionale di salute (NIH) ed è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto di ricerca Scripps. Tutti gli sforzi sono stati fatti per minimizzare il numero di topi e la loro sofferenza. Tutti gli animali sperimentali hanno ricevuto una dieta standard con accesso gratuito all'acqua del rubinetto.
Nota: I passaggi principali per MEC e isolamento pericyte sono delineati schematicamente in Figura 1a-F. Tutti i reagenti e le apparecchiature utilizzati per questa procedura sono descritti nella tabella 1.
1. topi ed etichettatura delle celle SMA
- Utilizzare adulti (2-4 mesi di età) Tamoxifen-inducible, αSMA driven reporter topi SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL.
Nota: Il ceppo SMACreErt2 è stato gentilmente fornito dal Dr. Ivo kalajzic13. Rosa26-TdTomatoFL/FL (B6. CG-gt (ROSA) 26SorTM9 (CAG-tdTomato) hze/j, conosciuto anche come Ai9) strain (# 007909) sono stati acquistati da Jackson Laboratory (Sacramento, CA). Le cellule SMA + sono state etichettate con la somministrazione intraperitoneale del tamoxifene (TM). -
Preparazione della soluzione di tamoxifene
- Preparare l'olio di mais filtrato. Utilizzare il filtro a vuoto 0,22 μm poiché l'olio di mais è viscosi.
- Trasferire 1 g di polvere di TM dalla bottiglia in un tubo da 50 mL. Aggiungere 1 mL di etanolo alla bottiglia, tappo e agitare per risciacquare poi aggiungere a un 50 mL tubo. Ripetere ancora una volta con un altro 1 mL di etanolo.
- Aggiungere olio di mais filtrato per fare 50 mL di una soluzione di 20 mg/mL TM. Agitare il tubo, avvolgerlo in un foglio e metterlo in un bagno d'acqua scuotendo o agitando incubatore a 45 ° c.
- Può richiedere circa 12-24 h per sciogliere la TM. Di tanto in tanto, rimuovere il tubo e controllare eventuali cristalli rimanenti. Una volta che la TM è completamente disciolta, aliquota e conservare a-80 ° c. Un'aliquota scongelato può essere riutilizzata.
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Per etichettare le cellule SMA +, iniettare i topi intraperitoneale (IP) con TM in due giorni sequenziali.
- Iniettare 3-4 settimane di età SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/f qualsiasi topo di sesso con TM a 100 μl/20 g (o 2 mg/20 g) di peso corporeo (Figura 1a). I topi sono pronti per essere utilizzati per l'isolamento delle cellule in 2-3 giorni dopo l'ultima iniezione di TM. Se necessario, i topi iniettati possono essere sacrificati a lunghi periodi di tempo dopo l'iniezione di TM.
Nota: Come controlli per una corretta compensazione durante FACS, sarebbe necessario un mouse Wild Type (topi C57BL/6) e uno SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse non iniettato con TM (con MECS "non macchiati") della stessa età. Utilizzare gli stessi calcoli forniti per 2 SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse. Non iniettato SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL permetterà la valutazione dello sfondo DsRed. Il mouse topi C57BL/6 servirà come un controllo negativo delle cellule non macchiate.
- Iniettare 3-4 settimane di età SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/f qualsiasi topo di sesso con TM a 100 μl/20 g (o 2 mg/20 g) di peso corporeo (Figura 1a). I topi sono pronti per essere utilizzati per l'isolamento delle cellule in 2-3 giorni dopo l'ultima iniezione di TM. Se necessario, i topi iniettati possono essere sacrificati a lunghi periodi di tempo dopo l'iniezione di TM.
2. soluzioni e buffer
Nota: L'LG è una ghiandola di origine epiteliale che contiene una matrice extracellulare che rende difficile la dissociazione delle cellule. Pertanto, si raccomanda di utilizzare una combinazione speciale di enzimi e un processo di digestione Multistep descritto di seguito.
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Soluzione di stock di tipo II dispase (25x)
- Sciogliere 120 mg di polvere di tipo II in 2 mL di 50 mM HEPES/150 mM di NaCl per preparare una soluzione di stock 25x (la concentrazione finale di dispasi deve essere di 30 unità/mL). Le unità per milligrammo possono variare a seconda del numero di topi e la concentrazione della dispasi deve essere regolata di conseguenza.
- Preparare 200 μL di aliquote e conservarle a-70 ° c per un massimo di 6 mesi o 4 ° c per diversi giorni. Non congelare/scongelare l'aliquota di dispasi più di una volta per prevenire la degradazione enzimatica.
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Soluzione di stock di tipo I DNase
- Sciogliere 5 mg di polvere di tipo I di DNase in una soluzione da 5 mL di 50% glicerolo, tampone Tris da 20 mM (pH 7,5) e 1 mM MgCl2 (la concentrazione di stock dovrebbe essere di circa 2000 unità/ml). Le unità per milligrammo possono variare a seconda del numero di topi e quindi la concentrazione di DNase deve essere regolata di conseguenza.
- Filtrare la soluzione di riserva utilizzando un filtro da 0,22 μm e una siringa da 10 mL.
- Preparare 200 μL di aliquote e conservarle a-70 ° c per un massimo di 6 mesi o 4 ° c per diversi giorni. Non congelare/scongelare più di una volta per prevenire la degradazione enzimatica.
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Digestione media
- Per 10 mL di DMEM a basso contenuto di glucosio senza glutamina, aggiungere 100 μL di integratore di colture cellulari (ad es., Glutamax, vedere tabella dei materiali) per una diluizione di 1:100.
- A 2 mL di DMEM a basso contenuto di glucosio con integratore di coltura cellulare, aggiungere 6 mg di collagenasi di tipo I e miscelare accuratamente mediante pipettaggio (enzima sul ghiaccio umido), 160 μL di soluzione di stock di dispasi (2,4 concentrazione finale di U/mL), 16 μL di soluzione di stock di tipo I di DNase (8 concentrazioni finali di U/mL e 12 μL di 1 M di CaCl2 (6 mm di concentrazione finale).
Nota: Il calcio è necessario per aumentare l'attività enzimatica14,15. Tutti i calcoli sono forniti per l'isolamento delle cellule da quattro ghiandole lacrimali da due topi adulti. Il volume del mezzo di digestione può variare a seconda della quantità di tessuto e del numero di replicati. Non utilizzare più di 4 ghiandole lacrimali da 2-4 mesi di topi di età per 2 mL di media.
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Mezzo di bloccaggio I
- A 25 mL di DMEM/F-12, aggiungere FBS (15% di concentrazione finale), 250 μL di integratore di colture cellulari (vedere tabella dei materiali) per una diluizione di 1:100 e 50 μL di 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm di concentrazione finale).
Nota: Dei diversi tipi di mezzo che sono stati confrontati per questo protocollo DMEM/F-12 ha dato i migliori risultati. Questo mezzo è stato utilizzato anche da altri ricercatori per isolare/colture cellule epiteliali16,17.
- A 25 mL di DMEM/F-12, aggiungere FBS (15% di concentrazione finale), 250 μL di integratore di colture cellulari (vedere tabella dei materiali) per una diluizione di 1:100 e 50 μL di 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm di concentrazione finale).
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Mezzo di bloccaggio II
- A 25 mL di PBS, aggiungere 50 μL di 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM di concentrazione finale).
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Supporto di recupero
- Per 2 mL di HBSS completati con 5 mM MgCl2, aggiungere 100 μl di soluzione di stock di tipo I di dnase a 100 U per 2 ml di concentrazione finale. Concentrazioni relativamente elevate di DNase-tipo I sono necessarie per ridurre l'aggregazione delle cellule epiteliali.
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Tampone di selezione delle cellule attivate a fluorescenza (FACS)
- Per 486,5 mL di PBS, aggiungere 12,5 mL di siero (2,5% di concentrazione finale) e 1 mL di 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM di concentrazione finale).
Nota: Il tampone può essere conservato a 4 ° c per un massimo di 6 settimane.
- Per 486,5 mL di PBS, aggiungere 12,5 mL di siero (2,5% di concentrazione finale) e 1 mL di 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM di concentrazione finale).
3. Adult mouse lacrimale della ghiandola di raccolta e microdissezione
- Anestetizzare il mouse con l'inalazione di isoflurano (regolare la portata di isoflurano o la concentrazione al 5% o superiore) e sacrificare per lussazione cervicale. Eseguire l'anestesia e l'eutanasia secondo le raccomandazioni istituzionali IACUCs.
- Utilizzando pinze sottili e forbici, rimuovere la pelle tra l'occhio e l'orecchio (Figura 2a).
- Per sezionare un LG, tirare delicatamente LG utilizzando le pinzette e allo stesso tempo graffiare il tessuto connettivo intorno al LG utilizzando la punta affilata di piccole forbici per liberarla (Figura 2B).
- Evitare di tagliare con le forbici, come le ghiandole salivari LG e parotide si trovano molto vicini l'uno all'altro e devono essere separati prima della dissezione. Quando LG e ghiandole parotidi sono separati, tagliare il LG fuori utilizzando le forbici. Posizionare le ghiandole in un piatto da 35 mm con 2 mL di PBS freddo (mantenere il ghiaccio) (Figura 1B).
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Come il LG è coperto da una capsula del tessuto connettivo/busta, tagliare qualsiasi grasso circostante e tessuto connettivo sotto un microscopio dissezione e rimuovere la capsula LG con due pinze.
- Ripetere questo passaggio per tutte le ghiandole.
- Controllare un piccolo pezzo di tessuto sotto microscopio fluorescente per garantire l'etichettatura delle cellule (Figura 1C).
4. preparazione della sospensione a cella singola LG
- Trasferire tutti i LGs in un piatto da 35 mm con 0,5 mL di supporto per la digestione a temperatura ambiente (RT) e un LGs con piccole forbici in pezzi molto piccoli (circa 0,2-1 μm2). Normalmente, ci vogliono circa 3 minuti per mince 4 LGs (Figura 2C).
- Trasferire il tessuto tritato in un tubo inferiore rotondo da 2 mL utilizzando una punta di filtro per pipette a foro largo. Utilizzare una punta di pipetta di dimensioni normali con la punta tagliata (Figura 2D).
- Aggiungere fino a 2 mL di mezzo di digestione e mescolare invertendo il tubo.
- Posizionare il tubo in un incubatore scuotitore (o agitare il bagno d'acqua), a 37 ° c, 100-120 rpm per 90 min.
- Ogni 30 min pipettare lentamente i pezzi della ghiandola 20-30 volte utilizzando una punta filtrante da 1.000 μL con la dimensione del foro decrescente (Figura 2D). Dopo l'incubazione/triturazione, prendere un'aliquota di 10 μL e ispezionare sotto un microscopio per i grappoli. Se i cluster persistono, continuare la digestione.
- Dopo 90 minuti, passare il campione 2-3 volte attraverso un ago per siringa per insulina (31G) per liberare ulteriormente le cellule in sospensione.
Nota: Non devono rimanere nella soluzione una volta completata la digestione (Figura 1D). - Trasferire la sospensione della cella a un tubo da 15 mL e aggiungere il supporto di blocco di tipo I a un totale di 5 mL. Invertire il tubo 2-3 volte per mescolare.
- Passare la sospensione cellulare attraverso un filtro a cellule 70 μm collocato su un tubo da 50 mL. Lavare il filtro con 1 mL di supporto di bloccaggio tipo I. Ripetere il passaggio 4,8 di nuovo.
- Centrifugare campioni a 0,4 x g per 5 min a RT.
- Aspirate il surnatante. Risospendere le cellule in 2 mL di mezzo di bloccaggio di tipo II utilizzando una punta di pipetta da 1 mL e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 2 mL.
- Centrifugare le celle a 0,4 x g (rotore 24 x 1,5/2,0 ml; vedere la tabella dei materiali) per 3 minuti a RT.
- Aspirare le cellule supernatanti e risospendere in 1 mL di soluzione di distacco delle cellule (vedere tabella dei materiali).
Nota: Qui, la soluzione di distacco delle cellule è Accutase, un enzima di origine marina con attività proteolitica e collagenolitica che distacca/dissocia le cellule per l'analisi dei marcatori di superficie cellulare. - Incubare le cellule a 37 ° c, a 100-120 rpm per 2-3 min. la digestione eccessiva con soluzione di distacco cellulare può danneggiare le membrane cellulari.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL e sommare 10 mL di mezzo di bloccaggio di tipo I. tubo centrifugo a 0,4 x g (rotore 24 x 1,5/2,0 ml; vedere tabella dei materiali) per 5 min.
- Eliminare le cellule supernatanti e risospendere in 6 mL di mezzi di recupero e incubare le cellule per 30 minuti a RT.
- Controllare 10 μL di sospensione cellulare sotto il microscopio per garantire la completa dissociazione delle cellule (Figura 3).
- Contare le celle usando un contatore di cellule e Trypan blu. Normalmente, ci aspettiamo 4 x 105-6 x 106 cellule da quattro LGS (un campione).
- Celle centrifughe a 0,4 x g (rotore 24 x 1,5/2,0 ml; vedere tabella dei materiali) per 3 minuti a RT e procedere alla colorazione anticorpale.
5. colorazione anticorpale
- Aggiungere fino a 5 cellule X105 a un tubo da 2 ml contenente 400 μl di tampone FACS. Aggiungere 5 μL di brillante viola 421 anti-topo CD326 (EpCAM) e 0,5 μL di Ghost Red 780 (colorante vitalità).
- In parallelo, preparare i controlli per regolare la compensazione FACS:
Controllo negativo-1 (celle da mouse Wild Type)
Controllo sfondo celle non colorate da SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL
Cy7-780 cellule colorate (cellule del topo di tipo selvaggio macchiate con il colorante vitalità Ghost Red 780)
EpCAM-Brilliant Violet 421 (cellule dal topo di tipo selvaggio macchiate con l'anticorpo EpCAM-Brilliant Violet 421).
Nota: Per ogni campione di controllo utilizzare un minimo di 1 x 105 celle per 400 μl di tampone FACS. - Dopo aver aggiunto accuratamente ogni cella di miscelazione del reagente mediante pipettaggio.
- Avvolgere il tubo (i) con un foglio e ruotare i tubi per 45 min a 4 ° c.
- Campioni centrifughe a 0,4 x g (rotore 24 x 1,5/2,0 ml; vedere tabella dei materiali) per 3 minuti a 4 ° c.
- Risospendere le celle in 1 mL del buffer FACS. È importante lavare le celle per diminuire lo sfondo durante la compensazione.
6. selezione delle cellule attivate a fluorescenza
- Trasferire la sospensione cellulare in provette FACS da 5 mL e procedere con l'analisi FACS. Mantenere le cellule sul ghiaccio.
- Regolare la compensazione utilizzando controlli a colori singoli.
- Ordinare le celle a 20 psi attraverso un ugello da 100 μm utilizzando un citometro di flusso appropriato (vedere tabella dei materiali). Gating strategy18 è mostrato nella Figura 1e e nella Figura 4.
- Raccogli le celle ordinate in media, RNA-later, FACS o buffer di Lisi a seconda delle procedure a valle (Figura 1e, F).
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Representative Results
Modello di mouse per isolare SMA + MECS e periciti
Il protocollo stabilito consente l'isolamento di due popolazioni pure: MECS e periciti da Lgs e SMG (vedere tabella 1). Questi due tipi di celle hanno una dimensione e un aspetto diversi. I periciti microvascolari, si sviluppano intorno alle pareti dei capillari (Figura 5a) e hanno una forma quadrata (Figura 5b), mentre i mecs circondano gli ACINI secretori LG, hanno lunghi processi e occupano un'area relativamente ampia (Figura 5a, B ). La procedura descritta si basa sull'etichettatura delle cellule genetiche di SMA + nel ceppo del mouse TM-inducible SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL . Additonally, gli anticorpi EpCAM consentono ai ricercatori di distinguere l'epitelio SMA+: EpCAM+ cellule di origine ectodermica (MECS) e SMA+EpCAM- cellule di origine endodermica (pericytes).
Preparazione della sospensione monocellula
L'LG contiene una matrice extracellulare filamentosa che deve essere digerita accuratamente. Il protocollo fornito consente la preparazione di una soluzione a singola cella per l'analisi FACS e ulteriori applicazioni. L'esempio delle celle dissociate è illustrato nella Figura 3.
MEC e isolamento pericyte di FACS
Per distinguere i MECs dai periciti, le singole cellule sono state macchiate con l'anticorpo EpCAM, che rileva solo le cellule epiteliali. La principale popolazione di cellule è stata determinata dal gating dell'area di dispersione in avanti e laterale (Figura 4a). I doppietti sono stati esclusi tracciando l'area di dispersione in avanti rispetto alla larghezza e con l'area di dispersione laterale rispetto alla larghezza (Figura 4B). L'esclusione delle cellule morte è stata fatta tramite Ghost Red 780 (colorante vitalità) (Figura 4c). Un controllo senza etichetta (Figura 4e), controllo dello sfondo e controllo degli anticorpi etichettati con un singolo anticorpo primario sono stati utilizzati per determinare il rumore di fondo (legame anticorpale non specifico) e per stabilire una corretta compensazione per una separazione ottimale segnali (Figura 4D). Le analisi dei dati sono state eseguite utilizzando il software FlowJo.
MECS e periciti sono stati recintati da DsRed etichettatura. Sono state rilevate le celle DsRed+ Dim (non mostrate) e DsRed+ Bright all'interno delle popolazioni di MEC e di cellule pericyte (Figura 4D). La luminosità delle celle etichettate può dipendere dal livello di espressione SMA o dal grado di attivazione del reporter su TM Injection19. Solo DS Red+ Bright popolazione cellulare sono stati raccolti poiché sono state richieste solo cellule completamente differenziate. Le popolazioni DS Red+ Dim Cell richiedono ulteriori indagini.
Applicazioni a valle
È ben noto che i MECs svolgono un'importante funzione contrattile nelle ghiandole esocrine. Inoltre, sono cellule molto plastiche e hanno caratteristiche delle cellule staminali. Pertanto, i MECs isolati potrebbero essere utilizzati in più applicazioni. Ad esempio, le cellule possono essere coltivate, utilizzate per l'isolamento dell'RNA o il trapianto (Figura 1F)12,20,21,22.
| parametro | Ghiandola lacrimale | Ghiandola sottomandibolare |
| Numero di topi per campione | 2 | 1 |
| Numero di ghiandole per campione | 4 | 2 |
| Ghiandole di dissezione | Separato dalla ghiandola parotide | Separato dalla ghiandola sublinguale |
| Concentrazione di collagenasi per campione | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Numero approssimativo di cellule dopo dissociazione enzimatica | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 X106 |
| Fase di recupero (vedere la sezione "dissociazione a singola cellula della ghiandola lacrimale del topo adulto", punto 15) | Risospendere le cellule in 6 ml di supporti di recupero | Risospendere le celle in 12 mL di supporti di ripristino |
| Volume del tampone FACS durante la colorazione degli anticorpi | 400 μL di microlitro | 2 tubi da 400 μL; è meglio dividere le cellule in due o tre tubi che ogni tubo non ha più di 6x105 |
Tabella 1: modifiche del protocollo per l'isolamento delle cellule dalla ghiandola sottomandibolare (SMG). La tabella descrive le principali modifiche necessarie per isolare MECS e periciti da murine SMG in confronto con la procedura per murine LG.
Figura 1: rappresentazione schematica dell'esperimento. A) iniezioni IP del mouse SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FLcon TM. B) l'isolamento e la macinazione dell'LG o del SMG. (C) analisi dell'etichettatura cellulare mediante microscopio a fluorescenza. D) digestione enzimatica multifase per preparare una soluzione a cellula singola. È fondamentale controllare le fasi di digestione sotto un microscopio leggero per garantire che le cellule vengano rilasciate dai cluster. (E) esempio di gating che mostra SMA + Bright DS Red +/EpCAM + (MECS) e DS rosso + Bright/EpCAM-(pericyte). F) i mecs e i periciti raccolti potrebbero essere sottoposti a diverse procedure a valle, tra cui la coltivazione cellulare, l'isolamento dell'RNA e l'analisi dell'espressione genica e il trapianto cellulare. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: passaggi critici di LG isolamento/macinazione. (A) rimozione della pelle tra l'occhio e l'orecchio per dissezionare LG. il cerchio giallo tratteggiato indica la posizione LG. (B) LG dissezione. La punta di freccia gialla indica l'area tra le ghiandole lacrimali e parotidi. (C) LG macinazione in mezzo di digestione utilizzando forbici con curve, estremità smussate. (D) trasferimento di tessuti tritati in provetta da 2 ml. La freccia gialla raffigura una punta larga da 1 ml richiesta per il trasferimento. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: confocale e contrasto di interferenza differenziale (dic) Immagini che illustrano le singole cellule dissociate da murine LG. (A-C) singole celle isolate da due Lgs di un 4 mese di età SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse. I nuclei sono macchiati con DAPI (blu). Le punte di freccia bianche denotano le cellule SMA + (DS Red): MECs o pericytes. Barra di scala = 15 μm. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: identificazione di murine LG MECS e periciti utilizzando FACS. (A) determinazione della popolazione principale di cellule LG da avanti e lato dispersione zona gating. B) esclusione delle doppiette tramite l'area di dispersione in avanti rispetto alla larghezza. (C) esclusione delle cellule morte tramite Ghost Red 780 (colorante vitalità). D) le popolazioni MEC (SMA+ Bright/EpCAM+) e pericyte (SMA+ Bright/EpCAM-) si distinguono in base alla colorazione con l'anticorpo EpCAM. (E) controllo senza etichetta (celle di tipo Wild mouse). Su ogni trama viene fornita la% delle celle recintate. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5: immagini confocale che mostrano differenza nella distribuzione e nella forma tra MECS e periciti isolati da murine LG. (A) montaggio intero preparazione di LG con le cellule etichettate mostrando differenza nella distribuzione tra MEC e pericytes. B) la forma del MEC e del pericyte è diversa. Il pericyte è relativamente piccolo e ha una forma squired, mentre MEC è grande e ha una forma irregolare e diversi processi lunghi. Punte di freccia = MECs e pericytes. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
Questo manoscritto descrisse un protocollo di MEC e di isolamento pericyte da LG e SMG. Questa procedura è stata basata sull'etichettatura genetica di SMA, l'unico biomarcatore affidabile di MECs e pericytes.
L'urgenza di sviluppare questo protocollo è stata motivata dalla quasi totale assenza di letteratura che evidenzia l'isolamento dei MECs da parte del LGs e dell'SMG murino. Anche se l'etichettatura genetica è stata utilizzata in precedenza, utilizzando i topi SMA-GFP per isolare le cellule SMA + dal giovane LGs12di tre settimane, non ha permesso l'uso di questi topi più anziani per l'isolamento delle cellule a causa della perdita parziale del segnale nei topi adulti. Inoltre, le celle con etichetta GFP forniscono un background relativamente elevato nelle applicazioni FACS23 e richiedono compensazioni aggiuntive. Al contrario, la linea SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse Mostra no o uno sfondo basso e alti livelli di attivazione dell'etichettatura SMA durante lo sviluppo postnatale del mouse, l'età adulta e l'invecchiamento. L'utilizzo di SMACreErt2/+: Rosa26-tdtomatoFL/FL mouse è particolarmente importante per gli studi incentrati sulla progressione della malattia o l'invecchiamento, poiché le cellule SMA + in questi topi potrebbero essere etichettati prima dello sviluppo della malattia e studiati in seguito quando progressione della malattia/invecchiamento. Un altro passo critico del protocollo è la macinazione LG accurata e la seguente digestione. Questo passaggio può ridurre il numero di cella ottenuto durante l'analisi FACS. Nel complesso, l'isolamento e l'analisi immediata delle cellule primarie sono importanti anche a causa di cambiamenti significativi nei profili trascrizionali delle cellule mantenute nella cultura24.
Inoltre, il protocollo descritto per l'isolamento di MEC e pericyte da murine LGs consente diverse procedure a valle. Sono possibili estrazioni di proteine, RNA e DNA da entrambe le popolazioni a cellule singole, anche se diversi topi/campioni devono essere elaborati in parallelo o in sequenza per aumentare il numero di cellule. Nel loro insieme, i risultati ottenuti dimostrano un modo efficace e relativamente semplice per l'isolamento di MEC e pericyte da diversi tessuti ghiandolari murini.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti né conflitti di altri interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo il dottor Ivo kalajzic per averci fornito il ceppo di mouse SMACreErt2 , Takeshi umazume per la coda del mouse e la genotipizzazione, Mark Shelley per l'acquisizione di immagini professionali per la figura 2. Ringraziamo anche Scripps Consiglio degli editori scientifici e Mark Shelley per l'editing scientifico inglese. Siamo grati al nucleo di citometria a flusso di Scripps Research Institute per l'assistenza con la cernita delle cellule e per il Dr. Robin Willenbring per più discussioni/consigli sull'analisi dei dati FACS.
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di salute, National Eye Institute Grants 5 R01 EY026202 e 1 R01 EY028983 a H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
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