Artículo de método

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

DOI:

10.3791/59624

⸱

25 de mayo de 2019

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1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un enfoque para purificar el ARNm ligado al ribosoma a partir de células endoteliales vasculares (OC) directamente en el cerebro del ratón, los pulmones y los tejidos cardíacos a través de la etiqueta genética específica de la CE de la proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) en ribosomas en combinación con la purificación del ARN .

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muchos estudios se han limitado al uso de ensayos celulares in vitro y tejidos enteros o el aislamiento de tipos celulares específicos de animales para el análisis in vitro del transcriptoma y la expresión génica mediante la secuenciación de qPCR y ARN. El análisis exhaustivo del transcriptoma y la expresión génica de tipos específicos de células en tejidos y órganos complejos será fundamental para comprender los mecanismos celulares y moleculares mediante los cuales se regulan los genes y su asociación con la homeostasis tisular y el órgano Funciones. En este artículo, demostramos la metodología para el aislamiento del ARN ligado a ribosoma directamente in vivo en la endotelia vascular de los pulmones de animales como ejemplo. Se describirán los materiales y procedimientos específicos para el procesamiento de tejidos y la purificación del ARN, incluida la evaluación de la calidad y el rendimiento del ARN, así como el qPCR en tiempo real para ensayos genéticos arteriogénicos. Este enfoque, conocido como la técnica de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP), se puede utilizar para la caracterización de la expresión génica y el análisis del transcriptoma de ciertos tipos de células directamente in vivo en cualquier tipo específico en tejidos complejos.

Introducción

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En tejidos complejos como el cerebro, el corazón y el pulmón de los mamíferos, los altos niveles de heterogeneidad celular complican el análisis de los datos de expresión génica derivados de muestras de tejidos enteros. Para observar perfiles de expresión génica en un tipo de célula en particular in vivo, recientemente se ha desarrollado una nueva metodología, que permite el interrogatorio de todo el complemento de ARNm traducido de cualquier tipo de célula definida genéticamente. Esta metodología se conoce como la técnica de purificación de afinidad ribosoma de traducción (TRAP)1,2. Es una herramienta útil para estudiar la biología de las células endoteliales y la angiogénesis cuando se combina con la manipulación genética de otros genes asociados a la angiogénesis en animales.

Hemos demostrado que la señalización angiogénica PKD-1 y la transcripción del gen angiogénico CD36 son fundamentales para la diferenciación de células endoteliales (EC) y la angiogénesis funcional3,4,5,6. Para determinar los mecanismos moleculares de señalización angiogénica y metabólica en transcripción de genes y transdiferenciación EC, hemos creado ratones TRAP genéticamente diseñados con genes angiogénicos específicamente eliminados sobre la base de la técnica TRAP1 , 2. Además, en nuestros animales TRAP, no sólo tienen deficiencia de genes pkd-1 o cd36 en la endotelia vascular o deleción global del gen cd36, sino que una proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) también está genéticamente etiquetada en La EC está traduciendo ribosomas. TRAP permite la purificación de afinidad de ARNm ligada a ribosomas directamente de la endotelia vascular de los tejidos específicos, lo que permite el análisis de la expresión génica y la identificación de nuevos transcriptomes asociados con la diferenciación de la CE y angiogénesis directamente en condiciones in vivo. Hemos aislado con éxito el ARN ligado al ribosoma de la endotelia en estos animales genéticamente diseñados. El ARN purificado se puede utilizar para una mayor caracterización de genes angiogénicos o arteriogénicos en la regulación de la diferenciación y las funciones de la CE. Este protocolo proporciona una guía paso a paso para implementar el enfoque TRAP para el aislamiento de arNM en los CE directamente in vivo.

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Protocolo

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Para experimentos con animales, todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Colegio Médico de Wisconsin.

1. Preparar reactivos

  1. Preparar el tampón de lisis a concentraciones de 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 100 mg/mL cicloheximida, inhibidores de la proteasa e inhibidores de rNase recombinante a las concentraciones como se describe a continuación.
    1. Añadir los siguientes reactivos a 500 ml de agua desionizada libre de RNase: 1,19 g de HEPES, 5,59 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 35 mg de TDT, 0,5 ml de cicloheximida y NaOH según sea necesario hasta pH 7,4, inhibidores de la proteasa libre de EDTA (un mini comprimido por 10 ml) e inhibidor de la rnalosa (1 0 L/ml).
    2. Conservar en nevera de 4oC durante un máximo de 1 mes.
  2. Preparar un tampón de lavado de polisome de alta sal a concentraciones de 10 mM HEPES, pH 7.4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% vol/vol CA-630, 0.5 mM DTT, y 100 mg/mL cicloheximida.
    1. Añadir los siguientes reactivos a 500 ml de agua desionizada libre de RNase: 1,19 g de HEPES, 13,05 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 5 ml de detergente no iónico y no desnaturalizante, 5 de 7,7 mg de tubos de TDT y 0,5 ml de cicloximida y NaOH según sea necesario pH 7.4.
    2. Conservar en nevera de 4oC durante un máximo de 1 mes.
  3. Enlazar anticuerpoanti-GFP a las perlas magnéticas de la proteína G antes de iniciar el experimento.
    1. Añadir 10 mg de anticuerpo anti-GFP diluido en 200 ml de PBS a cuentas de proteína G.
    2. Incubar con rotación final sobre extremo durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    3. Coloque las perlas en un bastidor magnético y retire el sobrenadante.
    4. Suspenda las perlas en 200 ml de PBS y guárdelas en nevera de 4 oC durante un máximo de 1 semana.
  4. Preparar PBS helado con 100 mg/ml de cicloheximida.
    1. Añadir 1 volumen de solución de cicloheximida (100 mg/ml) a 99 volúmenes de PBS helado.

2. Aísle y lise los tejidos deseados

  1. Euantalice ratones mediante inyección IP de ketamina (500 mg/kg/peso corporal) y xilazina (10 mg/kg/peso corporal) y aísle los tejidos deseados (es decir, corazón, pulmón). Proceda inmediatamente al siguiente paso.
  2. Coloque los tejidos deseados en 500 ml de PBS helado con 100 mg/ml de cicloheximida.
  3. Tejido de picado en una suspensión celular con un homogeneizador motorizado o un homogeneizador de vidrio de pequeño espacio libre. Si utiliza un homogeneizador motorizado, limite la homogeneización a menos de 1 minuto a baja frecuencia (<15.000 Hz) para evitar la desnaturalización del ARN.
  4. Suspenda el gránulos celulares en 200 ml de tampón de lisis pipeteando y redibujando el tampón varias veces. Homogeneizar aún más la suspensión celular con 10 golpes en un homogeneizador de vidrio de separación pequeña o durante 15 segundos a baja frecuencia (<15.000 Hz) en un homogeneizador accionado por motor.
  5. La centrifugadora homogeneiza durante 10 min a 2.000 x g a 4 oC a núcleos de pellets y residuos de células grandes, y mantener el sobrenadante.
  6. Agregue detergente no iónico y no desnaturalizante a 1% vol/vol y DHPC a 30 mM al sobrenadante. Incubar sobre hielo durante 5 min.
  7. Lisato de centrífuga durante 10 min a 16.000 x g para pellets de material insoluble. Transfiera y mantenga el 15% de lisado claro como entrada para pasos futuros.

3. Aislar los complejos ribosoma/arnm

  1. Añadir 50 ml de perlas ligadas a anticuerpos al sobrenadante de lisado celular e incubar la mezcla a 4 oC con rotación de extremo sobre extremo durante 30 min. Aquí es donde los anticuerpos anti-GFP unirán los ribosomas etiquetados por gFP, lo que nos permite aislar aún más el ARN de estos ribosomas.
  2. Recoger las perlas en un estante magnético y lavar 5 veces con tampón de lavado de polisome de alta sal.
    1. Elaborar y desechar el líquido una vez que las perlas se hayan acumulado en el lado del tubo. A continuación, pipetear y volver a dibujar 200 ml de tampón de lavado de polisome de alta sal varias veces. Repita este paso 5 veces y descarte todo el búfer después de la repetición final. Proceda inmediatamente al siguiente paso.

4. Aislar el ARNm

  1. Coloque los cordones en el búfer RLT. Los siguientes pasos se toman directamente desde el protocolo RNeasy mini kit y no se ampliaron de ninguna manera.
    ADVERTENCIA: El tampón RLT contiene sales de guanidina; NO mezcle con lejía.
  2. Lisato de centrífuga durante 3 min a velocidad máxima 13.000 rpm o 16.000 g a 4oC. Retire con cuidado el sobrenadante de 350 ml pipeteando y transfieralo a un nuevo tubo de microfófuga. Utilice sólo este sobrenadante (lysate) en los pasossiguientes.
  3. Agregue un volumen igual de etanol al 70% en el tubo de microfusión.
  4. Transfiera hasta 700 ml de la muestra, incluyendo cualquier precipitado que pueda haberse formado, a una columna de espín colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de espín. Deseche el flujo.
  5. Agregue 350 ml de búfer RW1 a la columna de giro. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de espín. Deseche el flujo y reutilice el tubo de recogida en el siguiente paso.
    ADVERTENCIA: Buffer RW1 contiene sales de guanidina; NO mezcle con lejía.
  6. Agregue 350 ml de búfer RW1 a la columna de giro. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el flujo.
  7. Agregue 500 mL de buffer RPE a la columna de giro. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de espín. Deseche el flujo.
  8. Agregue 500 mL de buffer RPE a la columna de giro. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 2 minutos a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de espín. A continuación, retire cuidadosamente la columna de giro del tubo de recogida, asegurándose de que la columna no entre en contacto con el flujo a través.
  9. Coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de recogida de 2 ml y deseche el tubo viejo con el flujo. Cierre la tapa suavemente y centrifugar a toda velocidad durante 1 min para eliminar el tampón residual.
  10. Coloque la columna de giro en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. Agregue 30-50 ml de agua libre de RNase directamente a la membrana de la columna de centrifugado. Cierre suavemente la tapa y centrifugar durante 1 min a 8.000 x g para eluir el ARN.
  11. Si el rendimiento esperado del ARN es >30 mg, repita el paso 4.10 con otros 30-50 ml de agua libre de RNase, o utilizando eluido del paso 4.10 (si se requiere un alto [ARN]). Reutilice el tubo de recogida del paso 4.10.
  12. Utilice ARN purificado para análisis aguas abajo, incluyendo la secuenciación de ARN o PCR cuantitativo en tiempo real o arn disuelto en H2O libre de RNase a -80 oC durante un máximo de 1 año.

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Resultados

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Nuestros estudios anteriores4,7 sugieren que CD36 puede funcionar como un interruptor para la diferenciación arteriolar y la arterial capilar a través de la vía de señalización LPA/PKD-1. Para estudiar si el eje de señalización LPA/PKD-1-CD36 es esencial para la arteriogénesis in vivo, hemos establecido las nuevas líneas TRAP que no sólo tienen deficiencia global cd36 o deficiencia endotelial-específica-cd36- o pkd-1-deficiencia, sino que también permiten el aisl...

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Discusión

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La angiogénesis es un complejo proceso de varios pasos, en el que la transcripción y expresión de genes angiogénicos específicos de la CE desempeñan un papel esencial en la diferenciación EC y la reprogramación angiogénica3,4. Para superar las barreras de la diversidad celular y la complejidad arquitectónica para comprender mejor la función del sistema vascular de mamíferos a nivel molecular in vivo, hemos creado ratones TRAP específicos de la CE, acompañados de ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

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El trabajo del Dr. Ren es apoyado por la Asociación Americana del Corazón (13SDG14800019; BR), la Ann's Hope Foundation (FP00011709; BR), la Sociedad Americana contra el Cáncer (86-004-26; el McW Cancer Center to BR), y el Instituto Nacional de Salud (HL136423; BR); Jordan Palmer cuenta con el apoyo del Programa de Pasantías MCW CTSI 500 Stars 2018; P. Moran cuenta con el apoyo de una Beca de Formación en Investigación Institucional de NHLBI (5T35 HL072483-34).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2100 Bioanalizador de electroforesis con nanochips y picochipsAgilentG2939AA, 5067-1511 y 5067-1513
Raspadores de célulasSarstedt83.1832
HomogeneizadoresFisher ScientificK8855100020
Magnet (Dynamag-2)Invitrogen123-21DDependerá de la escala de purificación; las muestras en tubos de 1,5 ml se pueden concentrar en una
minicentrífugaespectrofotómetro Fisher Scientific05-090-100
NanoDrop 2000CThermo Scientific ND-2000C
Centrífuga refrigeradaEppendorf5430Rcon rotor para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Tubos de
microcentrífuga de 1,5 mL sin ARNasaApplied Biosystems 
Tubos cónicos de 50 ml sin arnanasaApplied Biosystems 
Libre de RNasa 1000-μ l puntas de filtroRaininRT-1000F RNasa
libre 200-μ l puntas de filtroRainin  RT-200F sin
RNasa 20-μ l puntas de filtroRainin  RT-20F
Rotor para homogeneizadoresYamato LT-400D
Rotor de tubo, marca LabquakeThermo Fisher13-687-12Q
DynaMag-2 AM12450AM12501

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

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