Presentamos un enfoque para purificar el ARNm ligado al ribosoma a partir de células endoteliales vasculares (OC) directamente en el cerebro del ratón, los pulmones y los tejidos cardíacos a través de la etiqueta genética específica de la CE de la proteína de fluorescencia verde mejorada (EGFP) en ribosomas en combinación con la purificación del ARN .
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Artículo de método
Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Muchos estudios se han limitado al uso de ensayos celulares in vitro y tejidos enteros o el aislamiento de tipos celulares específicos de animales para el análisis in vitro del transcriptoma y la expresión génica mediante la secuenciación de qPCR y ARN. El análisis exhaustivo del transcriptoma y la expresión génica de tipos específicos de células en tejidos y órganos complejos será fundamental para comprender los mecanismos celulares y moleculares mediante los cuales se regulan los genes y su asociación con la homeostasis tisular y el órgano Funciones. En este artículo, demostramos la metodología para el aislamiento del ARN ligado a ribosoma directamente in vivo en la endotelia vascular de los pulmones de animales como ejemplo. Se describirán los materiales y procedimientos específicos para el procesamiento de tejidos y la purificación del ARN, incluida la evaluación de la calidad y el rendimiento del ARN, así como el qPCR en tiempo real para ensayos genéticos arteriogénicos. Este enfoque, conocido como la técnica de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP), se puede utilizar para la caracterización de la expresión génica y el análisis del transcriptoma de ciertos tipos de células directamente in vivo en cualquier tipo específico en tejidos complejos.
Introducción
En tejidos complejos como el cerebro, el corazón y el pulmón de los mamíferos, los altos niveles de heterogeneidad celular complican el análisis de los datos de expresión génica derivados de muestras de tejidos enteros. Para observar perfiles de expresión génica en un tipo de célula en particular in vivo, recientemente se ha desarrollado una nueva metodología, que permite el interrogatorio de todo el complemento de ARNm traducido de cualquier tipo de célula definida genéticamente. Esta metodología se conoce como la técnica de purificación de afinidad ribosoma de traducción (TRAP)1,2. Es una herramienta útil pa....
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Protocolo
Para experimentos con animales, todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Colegio Médico de Wisconsin.
1. Preparar reactivos
- Preparar el tampón de lisis a concentraciones de 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 100 mg/mL cicloheximida, inhibidores de la proteasa e inhibidores de rNase recombinante a las concentraciones como se describe a continuación.
- Añadir los siguientes reactivos a 500 ml de agua desionizada libre de RNase: 1,19 g de HEPES, 5,59 g de KCl, 0,24 g de MgCl2, 35 mg de TDT, 0,5 ml de cicloheximida....
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Resultados
Nuestros estudios anteriores4,7 sugieren que CD36 puede funcionar como un interruptor para la diferenciación arteriolar y la arterial capilar a través de la vía de señalización LPA/PKD-1. Para estudiar si el eje de señalización LPA/PKD-1-CD36 es esencial para la arteriogénesis in vivo, hemos establecido las nuevas líneas TRAP que no sólo tienen deficiencia global cd36 o deficiencia endotelial-específica-cd36- o pkd-1-deficiencia, sino que también permiten el aisl.......
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Discusión
La angiogénesis es un complejo proceso de varios pasos, en el que la transcripción y expresión de genes angiogénicos específicos de la CE desempeñan un papel esencial en la diferenciación EC y la reprogramación angiogénica3,4. Para superar las barreras de la diversidad celular y la complejidad arquitectónica para comprender mejor la función del sistema vascular de mamíferos a nivel molecular in vivo, hemos creado ratones TRAP específicos de la CE, acompañados de .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Agradecimientos
El trabajo del Dr. Ren es apoyado por la Asociación Americana del Corazón (13SDG14800019; BR), la Ann's Hope Foundation (FP00011709; BR), la Sociedad Americana contra el Cáncer (86-004-26; el McW Cancer Center to BR), y el Instituto Nacional de Salud (HL136423; BR); Jordan Palmer cuenta con el apoyo del Programa de Pasantías MCW CTSI 500 Stars 2018; P. Moran cuenta con el apoyo de una Beca de Formación en Investigación Institucional de NHLBI (5T35 HL072483-34).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2100 Bioanalizador de electroforesis con nanochips y picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 y 5067-1513 | |
| Raspadores de células | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogeneizadores | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Dependerá de la escala de purificación; las muestras en tubos de 1,5 ml se pueden concentrar en una |
| minicentrífuga | espectrofotómetro Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf | 5430R | con rotor para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Tubos de |
| microcentrífuga de 1,5 mL sin ARNasa | Applied Biosystems | ||
| Tubos cónicos de 50 ml sin arnanasa | Applied Biosystems | ||
| Libre de RNasa 1000-μ l puntas de filtro | Rainin | RT-1000F RNasa | |
| libre 200-μ l puntas de filtro | Rainin | RT-200F sin | |
| RNasa 20-μ l puntas de filtro | Rainin | RT-20F | |
| Rotor para homogeneizadores | Yamato | LT-400D | |
| Rotor de tubo, marca Labquake | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
Referencias
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al.
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Reimpresiones y permisos
