Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

Resumen

Este enfoque molecular para determinar la aptitud bacteriana facilita la detección precisa y precisa de microorganismos utilizando códigos de barras de ADN genómicos únicos que se cuantifican a través de PCR digital. El protocolo describe el cálculo del índice competitivo para las cepas de Salmonella; sin embargo, la tecnología es fácilmente adaptable a los protocolos que requieren la cuantificación absoluta de cualquier organismo genéticamente maleable.

Resumen

Un índice competitivo es un método común utilizado para evaluar la aptitud bacteriana y/o la virulencia. La utilidad de este enfoque se ejemplifica por su facilidad de ejecución y su capacidad para estandarizar la aptitud de muchas cepas a un organismo de tipo salvaje. La técnica está limitada, sin embargo, por los marcadores fenotípicos disponibles y el número de cepas que se pueden evaluar simultáneamente, creando la necesidad de un gran número de experimentos de réplica. Simultáneamente con un gran número de experimentos, los costos de mano de obra y materiales para cuantificar bacterias basadas en marcadores fenotípicos no son insignificantes. Para superar estos aspectos negativos conservando los aspectos positivos, hemos desarrollado un enfoque molecular para cuantificar directamente los microorganismos después de diseñar marcadores genéticos en cromosomas bacterianos. Se insertaron códigos de barras de ADN únicos de 25 pares base en un locus inocuo en el cromosoma de cepas mutantes y de tipo salvaje de Salmonella. Los experimentos de competencia in vitro se realizaron utilizando inocula consistente en cepas agrupadas. Tras la competición, los números absolutos de cada cepa se cuantificaron utilizando PCR digital y los índices competitivos para cada cepa se calcularon a partir de esos valores. Nuestros datos indican que este enfoque para cuantificar la Salmonella es extremadamente sensible, preciso y preciso para detectar microorganismos altamente abundantes (alta aptitud) y raros (baja aptitud). Además, esta técnica es fácilmente adaptable a casi cualquier organismo con cromosomas capaces de modificar, así como a diversos diseños experimentales que requieren la cuantificación absoluta de microorganismos.

Introducción

Evaluar la aptitud y la virulencia de los organismos patógenos es un aspecto fundamental de la investigación en microbiología. Permite realizar comparaciones entre cepas o entre organismos mutados, lo que permite a los investigadores determinar la importancia de ciertos genes en condiciones específicas. Tradicionalmente, la evaluación de la virulencia utiliza un modelo animal de infección utilizando diferentes cepas bacterianas y observando el resultado del animal infectado (por ejemplo, Dosis Infecciosa₅₀, Dosis letal_50,tiempo hasta la muerte, gravedad de los síntomas, falta de síntomas, etc.). Este procedimiento proporciona descripciones valiosas de la virulencia, pero requiere que las cepas causen diferencias considerables en los resultados para detectar variaciones de tipo salvaje. Además, los resultados son semicuantitativos porque mientras que la progresión de la enfermedad y la gravedad de los síntomas se pueden cuantificar subjetivamente con el tiempo, la interpretación de la virulencia en comparación con el tipo salvaje es más cualitativa (es decir, más, menos o igualmente virulenta). Una alternativa común a la realización de ensayos de infectividad animal es generar índices competitivos (CIs), valores que comparan directamente la aptitud o virulencia de una cepa con una contraparte de tipo salvaje en una infección mixta¹. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre un modelo animal tradicional de infección al estandarizar la virulencia a una cepa de tipo salvaje y determinar un valor cuantificable para reflejar el grado de atenuación. Esta técnica también se puede adaptar para analizar las interacciones genéticas en las bacterias mediante la determinación de un índice competitivo cancelado (COI)². El cálculo de un COI para un grupo de organismos mutados permite a los investigadores determinar si dos genes contribuyen de forma independiente a la patogénesis o si están implicados en la misma vía de virulencia y dependen entre sí. Además, el cálculo de un CI requiere la enumeración de bacterias que pueden proporcionar información valiosa sobre la patogénesis de los organismos. Los COI y los COI también permiten a los investigadores assimilar a cepas avirulentas que no causan enfermedades clínicas pero que todavía tienen diferencias en la aptitud física. Esta técnica está limitada por el uso de marcadores tradicionales de resistencia a antibióticos para identificar cepas, limitando así el número de cepas de entrada a sólo una o dos a la vez. Debido a esta limitación, se requiere un gran número de grupos experimentales y réplicas, que además de aumentar los costos de mano de obra y materiales, también aumenta las oportunidades de variabilidad en condiciones experimentales y resultados inexactos. (Para una revisión exhaustiva de los beneficios y aplicaciones del uso de infecciones mixtas para estudiar la virulencia, la aptitud y las interacciones genéticas, véase C.R. Beuzón y D.W. Holden ¹)

Se ha intentado superar esta limitación, como el uso de células etiquetadas fluorescentes cuantificadas a través de la citometría de flujo^3,4,5. Esta técnica cuantifica las células utilizando 1) anticuerpos etiquetados para marcadores fenotípicos o 2) proteínas fluorescentes producidas endógenamente. El uso de anticuerpos etiquetados tiene un límite de detección de 1.000 células/ml, y por lo tanto requiere un alto número de células para analizar³. Las células que expresan proteínas fluorescentes tienen una fisiología alterada y son susceptibles a cambios de aptitud resultantes de la alta expresión proteica⁶. Ambos métodos están limitados por el número de marcadores fluorescentes detectables mediante citometría de flujo. Se logró un avance en la cuantificación molecular mediante el desarrollo de una técnica de microarray que detectó la atenuación en 120 cepas a partir de una infección mixta inicial de más de 1.000 cepas en un modelo murino^7. Esta técnica utilizó un análisis de microarray de ARN a partir de cepas mutadas, lo que condujo a una considerable variabilidad en el resultado.  Sin embargo, estableció que grandes grupos de infecciones mixtas pueden ser una herramienta útil y que mediante la utilización de técnicas de detección sensibles, se pueden identificar diferencias en la virulencia bacteriana. Con el desarrollo de la secuenciación de próxima generación, Tn-seq amplió la utilidad de las mutaciones transposon, permitiendo un poderoso método para cuantificar bacterias que fueron mutadas aleatoriamente^{8,9,10, 11}. Recientemente se desarrolló un protocolo alternativo que elimina la necesidad de transposones y en su lugar utiliza códigos de barras de ADN para identificar y realizar un seguimiento más fácil de los cambios genómicos y su impacto en la aptitud^12. Esta tecnología es un avance importante, pero la inserción de los códigos de barras genómicos sigue siendo un proceso aleatorio. Para superar la aleatoriedad de experimentos anteriores, Yoon y otros desarrollaron un método para calcular los CI de las cepas de Salmonella utilizando códigos de barras de ADN únicos insertados en ubicaciones precisas en los cromosomas de la bacteria^13. Se detectaron cepas únicas de códigos de barras utilizando un método basado en qPCR con verde SYBR y imprimaciones específicas para cada código de barras único. La técnica se vio limitada por las restricciones impuestas por qPCR, incluidas las diferencias en la eficiencia de imprimación y la baja sensibilidad, evidenciadas por la necesidad de PCR anidado antes de qPCR. Sin embargo, este enfoque demostró que las modificaciones genómicas específicas podían ser explotadas para detectar y potencialmente cuantificar los grupos de múltiples cepas bacterianas.

En el siguiente protocolo, describimos una metodología novedosa para realizar experimentos de competencia bacteriana con grandes piscinas de inóculas mixtas seguidas de una cuantificación precisa utilizando una técnica de PCR digital altamente sensible. El protocolo implica cepas bacterianas de etiquetado genética con un código de barras de ADN único insertado en una región inocua del cromosoma. Esta modificación permite cuantificar las cepas de forma rápida y precisa utilizando tecnología molecular moderna en lugar de diluciones seriales tradicionales, replicación y conteo de unidades formadoras de colonias que se basan en marcadores fenotípicos (es decir, resistencia a los antibióticos ). Las modificaciones permiten la evaluación simultánea de muchas cepas en un solo inóculo agrupado, reduciendo sustancialmente la posibilidad de variabilidad experimental porque todas las cepas están expuestas a las mismas condiciones exactas. Además, si bien esta técnica fue desarrollada en Salmonella enterica serovar Typhimurium, es altamente adaptable a cualquier organismo genéticamente maleable y casi cualquier diseño experimental donde se requieran recuentos bacterianos precisos, proporcionando un nuevo para aumentar la precisión y el rendimiento en los laboratorios de microbiología sin las restricciones impuestas por métodos anteriores.

Protocolo

1. Incorporar códigos de barras de ADN únicos en un plásmido que contiene los componentes necesarios para el intercambio alélico

NOTA: Se creó un nuevo plásmido, denominado pSKAP, con un alto número de copia y una mayor eficiencia de transformación en comparación con el plásmido de intercambio alómico pKD13 existente. Esto se describe en los pasos 1.1-1.12 (Figura1). Los plásmidos finalizados que contienen códigos de barras de ADN únicos y componentes para el intercambio alélico están disponibles a través de un repositorio de plásmidos (Tabla de materiales).

1. Usando un kit de miniprep de plásmido comercial, purificar pKD13¹⁴ y pPCR Script Cam SK⁺ de cultivos bacterianos nocturnos cultivados en caldo Luria-Bertani (LB) complementado con 50 g/ml de kanamicina o 25 g/mL de cloranfenicol (para pKD13 y pPCR Script Cam SK+, respectivamente) (Tabla 1).
2. Realizar digestiones de restricción en ambos plásmidos utilizando enzimas de restricción comercial HindIII y BamHI de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
3. Elimine las enzimas de restricción y el ADN extirpado de la pPCR Script Cam SK⁺ reacción y purifique la columna vertebral de plásmido de par de 3.370 bases (bp) utilizando un kit de limpieza de ADN disponible comercialmente de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
4. Separe los fragmentos de la digestión de restricción pKD13 en un gel de agarosa del 1% utilizando una cámara de electroforesis.
5. Visualice las bandas utilizando un transiluminador de luz azul e exboce el fragmento de 1.333 bp del gel (Figura1C).
   NOTA: Este fragmento contiene el gen de resistencia a la kanamicina flanqueado por FRT necesario para el reemplazo alélico cromosómico.
6. Purificar el ADN extirpado del paso 1.5 utilizando un kit de extracción de gel comercial.
7. Para crear pSKAP, ligar el fragmento purificado de pKD13 (del paso 1.6) a pPCR Script Cam SK⁺ (del paso 1.3) utilizando una ligadura de ADN T4 comercial de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
8. Transforme las células DH5 , químicamente competentes, con el plásmido pSKAP ligado siguiendo el protocolo del fabricante (Tabla 1).
9. Esparza los transformadores en placas de agar LB suplementadas con kanamicina de 50 g/ml e incubar a 37oC durante la noche.
10. Escoge una colonia de la placa y arrehazla en una nueva placa de agar LB suplementada con kanamicina de 50 g/ml e incuba a 37oC durante la noche. Escoge una colonia de este plato y úsalo para inocular el caldo LB complementado con kanamicina de 50 g/ml. Incubar el cultivo durante la noche a 37oC con agitación constante.
11. Utilice un kit de minipreparación de plásmido comercial para purificar el pSKAP del cultivo bacteriano nocturno.
12. Realizar una digestión de restricción diagnóstica del plásmido del paso 1.11 utilizando Hind III y Bam HI de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Visualice fragmentos en un gel de agarosa del 1% como en los pasos 1.4-1.5.
    NOTA: El tamaño total de pSKAP debe ser de 4.703 bp. Los fragmentos después del paso 1.12 deben ser 3.370 y 1.333 bp.
13. Diseñar imprimadores PCR para mutagénesis insercional dirigida por el sitio (SDM) (Tabla2 y S1) de manera que se inserte una secuencia de ADN única de 25 bases en la posición 725 de pSKAP (Figura2).
    NOTA: El ADN del código de barras se inserta en el plásmido justo fuera del gen de resistencia a la kanamicina flanqueada por FRT, por lo que el código de barras no se pierde durante la eliminación posterior del casete de resistencia a la kanamicina. Si genera nuevas secuencias de códigos de barras, utilice herramientas en línea para asegurarse de que las sondas PCR específicas de destino etiquetadas fluorescentmente (en lo sucesivo, simplemente denominadas "sondas") se enlazarán eficientemente a la nueva secuencia. Las secuencias de inserción diseñadas hasta la fecha, junto con los cebantes necesarios para crearlas, se proporcionan en las Tablas 2 y S1.
14. Prepare las reacciones SDM utilizando una polimerasa deADN de alta fidelidad comercial, los pares de imprimación deseados (Tabla 2) y la plantilla pSKAP. Ajuste el termociclador para que realice lo siguiente: 1) 98 oC para 30 s, 2) 98 oC para 10 s, 56 oC durante 15 s, 72 oC durante 2 min, 3) repita los pasos 2, 24 veces, 4) 72 oC durante 5 min, 5) mantenga a 4 oC.
15. Después de completar la PCR, agote la plantilla pSKAP añadiendo la enzima de restricción Dpn I a la reacción. Incubar a 37oC durante 20 min.
    NOTA: Los productos de PCR deben visualizarse en un gel de agarosa para verificar el tamaño y la pureza del producto. Se puede realizar y utilizar una digestión Dpn I de control que consiste en la plantilla pSKAP sin modificar en pasos posteriores para garantizar que el ADN de la plantilla esté completamente digerido.
16. Utilice 5 l del producto a partir del paso 1.15 para transformar 100 l de células DH5TM químicamente competentes comercialmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
17. Esparza los transformadores en placas de agar LB suplementadas con 25 g/ml de cloramphenicol e incuban a 37oC durante la noche.
18. Seleccione una colonia (o colonias) a partir de placas de pernoctación y fíjese sobre placas de agar LB individuales complementadas con 25 g/ml de cloramphenicol e incubar a 37 oC durante la noche. Seleccione una colonia a partir de placas durante la noche y úsela para inocular 5 ml de caldo LB complementado con 25 g/ml de cloramphenicol. Incubar cultivos durante la noche a 37oC con agitación constante.
19. Utilice un kit de minipreparación de plásmido comercial para purificar los plásmidos de los cultivos nocturnos.
20. Plásmidos purificados de secuencia de sanger utilizando la imprimación de secuenciación directa M13 (Tabla 2). Compare la región mutada con el plásmido original y evalúe la precisión de inserción del SDM.
21. Después de confirmar la inserción y precisión del código de barras, asigne un nombre a cada código de barras y plásmido.
    NOTA: A los códigos de barras generados hasta la fecha se les ha asignado una designación de dos letras: AA, AB, AC, ..., BA, BB, BC, etc. Los plásmidos con código de barras se indican como pSKAP_AA, pSKAP_AB, pSKAP_AC, ..., pSKAP_BA, pSKAP_BB, pSKAP_BC, etc.
22. Repita los pasos 1.14-1.21 para generar el número deseado de códigos de barras de ADN.

2. Introducir código de barras de ADN en el cromosoma de S. Typhimurium

NOTA: Inserción de códigos de barras de ADN en la S. El cromosoma Typhimurium se logra mediante el uso de un método de intercambio alélico descrito por Datsenko y Wanner¹⁴ que ha sido modificado para su uso en S. Typhimurium.

1. Determinar el locus en la S. Genoma de Typhimurium en el que insertar el código de barras de ADN (Figura 3).
   NOTA: Seleccione una región grande e intergénica del cromosoma. Evite las regiones que producen ARN que no son codificantes. Este estudio utilizó un locus aguas abajo de la colocación P entre los residuos 1.213.840 y 1.213.861 (determinado a partir del ensamblaje del genoma GCA_000022165.1). Esta región ha sido previamente manipulada genéticamente para la complementación trans de genes^15. Alternativamente, se podría introducir un código de barras de ADN al mismo tiempo que se interrumpe un gen de interés. Hacerlo requeriría alteraciones mínimas en este protocolo y agilizaría la creación de mutantes.
2. Diseñe imprimadores PCR para amplificar el código de barras único y el gen de resistencia a la kanamicina flanqueado por FRT del plásmido pSKAP que contiene código de barras deseado del paso 1.21 (Tabla 2). Agregue extensiones de 40 nucleótidos que sean homólogas a la región seleccionada en el paso 2.1 hasta el extremo 5 de cada imprimación (Tabla 2).
3. Realice la amplificación utilizando una polimerasa comercial de alta fidelidad, las imprimaciones del paso 2.2 y el plásmido que contiene código de barras pSKAP deseado como plantilla. Ajuste el termociclador para que realice lo siguiente: 1) 98 oC para 30 s, 2) 98 oC para 10 s, 3) 56 oC para 15 s, 4) 72 oC para 60 s, repita los pasos 2-4 29 veces, 5) 72 oC durante 5 min, 6) mantener a 4 oC.
4. Después de completar la PCR, agote el ADN de la plantilla usando DpnI como se describe en el paso 1.15. Purificar y concentrar el ADN utilizando un kit comercial de limpieza de ADN de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
5. Consulte el protocolo publicado anteriormente para generar mutantes en S. Variedad Typhimurium 14028s de productos PCR^14,16,17,18.
   NOTA: No es esencial que el gen de resistencia a la kanamicina se exhala del cromosoma. Sin embargo, la escisión del gen es mínimamente perjudicial para el cromosoma bacteriano, ya que resulta en una cicatriz de 129 bp que dejaría los genes potenciales aguas abajo en el marco. Se recomienda que la cepa que contiene el gen de resistencia a la kanamicina se conserve, ya que se puede utilizar para mover códigos de barras entre cepas a través de la transducción mediada por P22.
6. Repita los pasos 2.3 – 2.5 para crear las cepas deseadas con los códigos de barras adecuados.
   NOTA: Los códigos de barras se pueden introducir en el tipo salvaje S. Typhimurium que puede ser sometido a una mayor manipulación genética, o códigos de barras pueden ser introducidos en cepas que han sido alteradas genéticamente previamente.

3. Condiciones de crecimiento bacteriano y ensayos de competencia in vitro

1. De las bacterias, la raya deseada S. Typhimurium tensa que cada uno alberga un código de barras de ADN único en las placas de agar LB. Incubar placas durante la noche a 37oC.
2. Seleccione una sola colonia de cada cepa e inocular 5 ml de caldo LB. Incubar durante 20 h a 37oC con agitación constante.
   NOTA: Usando el cultivo nocturno, proceda al paso 3.5 para recoger ADN genómico puro (GDNA) de cada cepa con código de barras. Esto es necesario para los experimentos de validación y control posteriores en la sección 6.
3. Para cada ensayo de competición, transfiera un volumen igual de cada cultivo nocturno a un tubo estéril de tamaño adecuado. Mezcle bien las cepas vórtinas vigorosamente durante al menos 5 s.
   NOTA: El volumen de cada cultivo nocturno que se va a transferir debe ser suficiente para cada condición y réplica, así como para aislar el ADNr para cuantificar la entrada. Si bien no es totalmente necesario medir las densidades ópticas de los cultivos porque el número absoluto de microorganismos de entrada se cuantificará utilizando PCR digital, el número de bacterias de entrada para cada cepa debe ser aproximadamente igual para evitar cuellos de botella o competencia desigual al principio del experimento. Los ensayos representativos de competencia en este protocolo compararon simultáneamente las tasas de crecimiento de 8 cepas. Pueden ser necesarias o menos cepas adicionales para diseños experimentales individuales.
4. Transfiera 100 l del inóculo mezclado a un caldo LB estéril de 4,9 ml. Incubar a 37oC durante el tiempo deseado o a una densidad óptica deseada.
5. Cosecha 500 l del inóculo por centrifugación a >12.000 x g durante 1 min. Retire y deseche el sobrenadante. Proceda inmediatamente a la sección 4 con las células.
6. En los puntos de tiempo deseados, retire las alícuotas de 500 ol de las células de cultivo y cosecha por centrifugación a >12.000 x g durante 1 min. Retire y deseche el sobrenadante.
   NOTA: Si recoge alícuotas en múltiples puntos de tiempo, congele los pellets a -20 oC o proceda inmediatamente al paso 4.1 después de cada recolección.

4. Recogida y cuantificación de gDNA de S. Typhimurium (de los pasos 3.5 y 3.6)

1. Cosecha el ADN gde de las células usando un kit comercial de purificación de ADNa. Si está disponible, realice el paso de agotamiento de ARN opcional.
   NOTA: El agotamiento del ARN no es necesario; sin embargo, la presencia de ARN aumentará artificialmente la concentración de ADN, lo que dará lugar a cálculos aberrantes en pasos posteriores. Si utiliza un kit comercial de purificación de ADNc, siga las recomendaciones del fabricante para asegurarse de que la columna no está sobrecargada con ADN. No se requiere una concentración mínima de ADN si la muestra es cuantificable en pasos posteriores.
2. Utilice un espectrofotómetro para cuantificar el ADN en cada muestra.
   NOTA: El ADN se puede cuantificar utilizando cualquier método confiable.
3. Calcular el número de copia de ADNg basado en el tamaño del genoma bacteriano utilizando la siguiente ecuación donde: X es la cantidad de ADN en ng y N es la longitud de una molécula de ADN de doble cadena (el tamaño del genoma).
   
   NOTA: 660 g/mole se utiliza como la masa media de 1 ADN bp. Pueden existir pequeñas variaciones dependiendo de la composición de nucleótidos del organismo. Numerosas calculadoras están disponibles en línea para realizar el cálculo.

5. Imprima imprimadores y sondas para la detección cuantitativa de códigos de barras de ADN a través de dDigital PCR

1. Diseñar imprimaciones para amplificar la región de códigos de barras de la S. Cromosoma Typhimurium aguas abajo de putP (Figura3C y Tabla 2).
   NOTA: Los diseños de imprimación y sonda pueden ser facilitados por numerosos programas en línea (Tablade Materiales). Si todos los códigos de barras se insertan en el mismo loci, un solo conjunto de imprimaciones de amplificación es universal para todos los códigos de barras.
2. Diseñar sondas basadas en 6 carboxifluoresceínas (FAM) y/o hexaclorofluoresceína (HEX) específicas para cada código de barras (Tabla2 y S1).
   NOTA: El lector de gotas utilizado en este experimento es capaz de detectar sondas basadas en FAM y HEX simultáneamente en una reacción multiplex. Diseño 1/2 de las sondas para utilizar FAM y 1/2 para utilizar HEX. Este no es un paso necesario, pero reducirá el uso de reactivos y los costos experimentales si se implementa.
3. Hacer mezclas maestras de imprimación-sonda 20x que contengan 1) 20 mM de cada imprimación de amplificación hacia adelante y hacia atrás, 2) 10 mM de una sola sonda FAM y 3) 10 mM de una sola sonda HEX (si se multiplexa).

6. Validar la sensibilidad y especificidad de cada conjunto de pprimer-sonda para cada código de barras genómico utilizando PCR digital

NOTA: Este protocolo utiliza la validación de ocho códigos de barras únicos con ocho sondas únicas como ejemplo. El número de códigos de barras utilizados se puede aumentar o disminuir para adaptarse a varios diseños experimentales.

1. Cree un grupo de gDNA que contenga todos los códigos de barras excepto uno. Utilice esta piscina como diluyente para realizar una serie de dilución con adNM gDNA que contenga el único código de barras restante (el esquema de dilución de muestrase se proporciona en la Figura 4).
   NOTA: El uso de gDNA agrupado como diluyente garantiza un fondo consistente mientras se determina la sensibilidad. Usando los números de copia determinados en el paso 4.3, diluya el ADNr a un número de copia dentro del rango de PCR digital recomendado (1-100.000 copias por reacción de 20 l). Tenga en cuenta que el rango está establecido para cada objetivo único (código de barras), no el adNM total.
2. Preparar las reacciones para pcR digital por duplicado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el uso de una supermezcla digital de PCR diseñada para la química basada en sondas. Utilice las mezclas del paso 6.1 como ADN de plantilla. Utilice la mezcla maestra de imprimación-sonda 20x del paso 5.3 que contiene la sonda para el código de barras diluido en el paso 6.1.
3. Preparar reacciones de control de réplica para PCR digital de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el uso de una supermezcla pcR digital diseñada para la química basada en sondas. Las reacciones de control para cada mezcla de sonda deben consistir en 1) sin controles de plantilla (NT), 2) controles negativos y 3) controles positivos.
   NOTA: El número mínimo de reacciones de control de réplica es de dos. Este protocolo de ejemplo utiliza cuatro NTTM, seis controles negativos y seis controles positivos para cada código de barras. Los controles negativos deben contener gDNA con cada código de barras, excepto el código de barras correspondiente a la sonda que se está probando. Esto validará la especificidad de cada sonda.
4. Repita los pasos 6.1-6.3 para crear reacciones de PCR digitales para cada muestra de ADNes gDNA con código. En la Figura 5se presenta una disposición de placa de muestra.
   NOTA: Este y los pasos subsiguientes se describen en función de una plataforma de PCR digital específica que utiliza gotas y tecnología basada en flujo. Las plataformas PCR digitales alternativas que utilizan tecnología basada en chips se pueden sustituir fácilmente con ligeras modificaciones a este protocolo. El paso 6.4 puede requerir más de una placa de 96 pocillos para validar todos los conjuntos de imprimación. A diferencia de qPCR, las placas separadas analizadas por la PCR digital se pueden comparar fácilmente sin necesidad de pozos de referencia estandarizados entre placas.
5. Genere gotas para cada condición de reacción utilizando un generador de gotas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
6. Transfiera las gotas recién creadas a la placa de 96 pocillos apropiada. Utilice puntas de pipeta de 200 ml en una pipeta multicanal de 5-50 l.
   NOTA: Al pipetear gotas, pipetear lentamente y suavemente! El fabricante de equipos PCR digitales recomienda utilizar únicamente pipetas y puntas de pipeta de un fabricante en particular (por ejemplo, Ranin). Estas puntas de pipeta tienen una abertura suave sin fragmentos de plástico microscópicos que pueden destruir gotas o dañar los microfluidos del lector de gotas. Numerosas marcas de consejos fueron examinados y observados para tener un espectro de calidad de fabricación. Se han logrado resultados equivalentes utilizando alternativas de punta de pipeta; sin embargo, se debe tener precaución al desviarse de las recomendaciones del fabricante.
7. Después de que todas las gotas se han generado y transferido, sellar la placa con un sellador de placa de papel de aluminio.
8. Utilice el termociclador recomendado por el fabricante para realizar las siguientes condiciones de ciclo: 1) 94 oC durante 10 min; 2) 94 oC durante 1 min, velocidad de rampa establecida en 1 oC/s; 3) 55 oC durante 2 min, velocidad de rampa establecida en 1 oC/s; 4) repita los pasos 2 y 3 49 veces; 5) 98 oC durante 10 min; 6) sostener a 4oC hasta 24 h.
   NOTA: La transferencia térmica en una reacción de gotas no es lo mismo que la PCR estándar. Las condiciones de reacción pueden requerir modificaciones.
9. Mientras se realiza el termocycling, programe el software de análisis de datos con la información de configuración de la placa, como el nombre de la muestra, el tipo de experimento (cuantificación absoluta), la supermezcla utilizada, el nombre de la meta 1 (nombre del código de barras FAM), el tipo de objetivo 1 (NTC, control positivo, control negativo, o desconocido), nombre de destino 2 (nombre del código de barras HEX), tipo de destino 2 (en blanco, control positivo, control negativo o desconocido). La información final de configuración de la placa se muestra en la Figura5.
10. Una vez completado el termocycling, transfiera las reacciones completadas al lector de gotas e inicie el proceso de lectura de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Cuantificar el número de bacterias en un experimento de índice competitivo

1. Diluir el ADNr aislado y cuantificado de la sección 4 a una concentración adecuada como se ha descrito anteriormente.
2. Preparar reacciones para PCR digital de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para el uso de la supermezcla adecuada. Utilice el ADN del paso 7.1 como plantilla. Utilice una mezcla maestra de imprimación-sonda 20x que contenga la sonda (o sondas si detecta FAM y HEX) para posibles códigos de barras presentes en el experimento.
3. Prepare reacciones de PCR digitales adicionales como en el paso 7.2 utilizando diferentes mezclas maestras de imprimación-sonda 20x hasta que se puedan detectar todos los códigos de barras utilizados en el diseño experimental.
4. Incluya controles para cada condición como se describe en 6.3. Esto incluye 1) sin controles de plantilla (NTC), 2) controles negativos y 3) controles positivos.
5. Continúe con el protocolo como se describe en los pasos 6.5-6.10.

8. Analizar datos de PCR digitaly calcular números de copia absoluta

1. Cuando todos los pozos se hayan leído y la ejecución se haya completado, abra el archivo de datos .qlp utilizando el software de análisis de datos.
   NOTA: Los tipos de archivos y los procedimientos de análisis de datos descritos aquí son específicos de un fabricante de PCR digital. Si se utilizan plataformas de PCR digitales alternativas, los tipos de archivos y los procedimientos de análisis de datos serán específicos de la plataforma utilizada y se realizarán de acuerdo con las especificaciones recomendadas por el fabricante.
2. Seleccione todos los pozos que utilizan la misma mezcla maestra de imprimación-sonda.
3. En la pestaña Droplets, examine el número de gotas analizadas en cada pozo (gotas positivas y negativas). Excluir del análisis cualquier pozo que tenga menos de 10.000 gotas totales.
4. Vaya a la pestaña Amplitud 1D y examine las amplitudes de gotas positivas y negativas. Asegúrese de que comprenden dos poblaciones distintas.
5. Dentro del software, utilice la característica de umbral para hacer un corte entre lasgotas positivas y negativas para cada sonda que se utilizó (Figura 6).
   NOTA: Todos los pozos que utilizan la misma mezcla maestra de imprimación-sonda del paso 5.3 deben tener los mismos umbrales.
6. Una vez que se han aplicado los umbrales apropiados a todos los pozos, el software calculará el número de copias de ADN en cada reacción. Exporte datos a una hoja de cálculo para facilitar el análisis posterior.
   NOTA: El software de análisis de datos utiliza el número de gotas positivas y negativas que se ajustan a una distribución de Poisson para determinar el número de copia.
7. Utilizando los valores del paso 8.6, calcule el número de copia inicial de cada código de barras genómico único en la muestra. Determinar la tasa media de falsopositivo de las reacciones de control negativas y restar este valor de los valores obtenidos en las reacciones experimentales. Multiplique los valores según sea necesario en función de las diluciones que se realizaron al configurar cada experimento (Tabla 3).

9. Determinar la aptitud relativa de un organismo calculando el CI o COI a partir de la cuantificación digital basada en PCR de las cepas de código de barras

1. Calcular el CI de una cepa de código sin barras utilizando las siguientes fórmulas donde: Una_salida es la cuantificación absoluta de la cepa de código sin código en un momento dado, WT_Output es la cuantificación absoluta de bacterias de tipo salvaje con código de barras al mismo tiempo punto de tiempo, una_entrada es la cuantificación absoluta del inóculo de entrada de la cepa de código de barras, WT_Input es la cuantificación absoluta del inóculo de entrada de bacterias de tipo salvaje con código de barras, X_Output es la suma de todas las cepas en el mismo punto de tiempo, X_Input es la suma del inóculo de entrada total de todas las cepas con códigodeo.

NOTA: Consulte la discusión para conocer las ventajas, desventajas y el uso más adecuado de cada fórmula.

2. Repita el paso 9.1 para cada cepa con códigos de barras en todos los puntos de tiempo.
3. Si procede, calcule el COI utilizando las siguientes fórmulas donde: Una_salida es la cuantificación absoluta de una cepa de código de barras con gen mutado A en un momento dado, AB_Output es la cuantificación absoluta de una cepa de código de barras con genes mutados A y B al mismo punto de tiempo, A_Input es la cuantificación absoluta del inóculo de entrada de la cepa de código de barras con el gen mutado A,AB_Input es la cuantificación absoluta del inóculo de entrada de cepa de códigos de barras con genes mutados A y B, la_salida B es la cuantificación absoluta de una cepa de código de barras con gen mutado B en un momento dado, y la_entrada B es la cuantificación absoluta de la entrada inóculo de la cepa de códigos de barras con el gen mutado B.

Y/O

Resultados

El uso de esta metodología requiere que se realicen las reacciones de control adecuadas para validar la sensibilidad y especificidad de cada sonda utilizada para identificar el ADN objetivo. En este experimento representativo, validamos ocho códigos de barras de ADN únicos con las ocho sondas correspondientes para su identificación. Las ocho sondas tenían una baja tasa de falsos positivos tanto en NTC como en reacciones de control negativas (Tabla3),destacando su especifi...

Discusión

La capacidad de cuantificar con precisión los microorganismos es de suma importancia para la investigación de microbiología, y la capacidad de enumerar cepas únicas de una población mixta inicial ha demostrado ser una herramienta invaluable para evaluar los rasgos de aptitud y virulencia en gérmenes. Sin embargo, las técnicas para lograrlo no han progresado en el ritmo de los desarrollos modernos en biología molecular. La tecnología para modificar fácilmente los cromosomas de muchas bacterias, incluyendo S. Typh...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	22600028	Adquiera de cualquier fabricante
Tubos de cultivo de 16 mL MidSci		8599	Adquiera de cualquier fabricante
5-200 μ L puntas de pipeta	RAININ	30389241	Adquirir marcas alternativas de puntas con precaución en función de la calidad
de fabricación 5-50 μ L pipeta multicanal	RAININ	17013804	Utilice con precaución pipetas multicanal alternativas
Agarosa ThermoFisher	Scientific	BP160-500	Adquiera de cualquier fabricante
BLAST Analysis	NCBI	N/A	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Termociclador táctil con módulo de reacción de 96 pocillos profundos	Bio Rad	1851197	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Químicamente competente DH5 y alfa;	Invitrogen	18258012	Adquiera de cualquier fabricante o prepare usted mismo
Cloranfenicol	ThermoFisher Scientific	BP904-100	Compre de cualquier fabricante
Cytation5 Lector de microplacas	BioTek	CYT5MF	Adquiera de cualquier fabricante, utilice cualquier sistema capaz de cuantificar con precisión el software de análisis de datos de ADN
(QuantaSoft y QuantaSoft Data Analysis Pro)	Bio Rad	N/A	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Placas de 96 pocillos DDPCR	Bio Rad	12001925	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
ddPCR Supermix para sondas (No dUTP)	Bio Rad	1863024	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Cartuchos DG8 para el generador de gotas QX200/QX100	Bio Rad	1864008	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Juntas DG8 para el generador de gotas QX200/QX100	Bio Rad	1863009	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Aceite de generación de gotas para sondas	Bio Rad	1863005	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Kanamicina	ThermoFisher Scientific	BP906-5	Adquiera de cualquier fabricante
Agar Luria-Bertani	ThermoFisher Scientific	BP1425-2	Adquiéralo de cualquier fabricante o hágalo usted mismo a partir de agar, triptona, digestión de levadura y NaCl
Caldo Luria-Bertani	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	Adquisición de cualquier fabricante o hágalo usted mismo a partir de triptona, digestión de levadura y NaCl
Placa PCR Termosellado, lámina, perforable	Bio Rad	1814040	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Tubos de PCR	Eppendorf 951010022		Adquiera de cualquier fabricante Placas de
Petri	ThermoFisher Scientific		FB0875712 Adquiera de cualquier fabricante
pPCR Script Cam SK+	Stratagene/Agilent	211192	Ya no está disponible comercialmente
Diseño de imprimación/sonda	IDT	N/A	https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP y pSKAP_Barcodes	números	plásmido Addgene 122702-122726	www.addgene.org
Sellador de placas PX1 PCR	Bio Rad	1814000	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Todavía no hay alternativas disponibles.
Generador de gotas QX200	Bio Rad	1864002	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
QX200 Droplet Reader	Bio Rad	1864003	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Salmonella typhimurium cepa ATCC 14028s	ATCC	ATCC 14028s	www.atcc.org
Placa de microvolumen Take3	BioTek	TAKE3	Adquiera de cualquier fabricante, utilice cualquier sistema capaz de cuantificar con precisión el ADN
Thermo Scientific FastDigest BamHI	ThermoFisher Scientific		FERFD0054 Adquiera de cualquier fabricante
Thermo Scientific FastDigest DpnI	ThermoFisher Scientific	FERFD1704	Adquirir de cualquier fabricante
Thermo Scientific FastDigest HindIII	ThermoFisher Scientific		FERFD0504 Adquirir de cualquier fabricante
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0832	Adquirir de cualquier fabricante
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0503	Adquiera de cualquier fabricante
Thermo Scientific Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	ThermoFisher Scientific	F534L	Adquiera de cualquier fabricante
Thermo Scientific T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	FEREL0011	Adquiera de cualquier fabricante
Thermocycler	Bio Rad	1861096	Adquiera de cualquier fabricante
Transiluminador UVP Visi-Blue	ThermoFisher Scientific	UV95043301	u otro transiluminador que permita la visualización del ADN Agua
, Biología Molecular Grado	ThermoFisher Scientific	BP28191	Adquirir de cualquier fabricante