Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

Resumen

Este enfoque molecular para determinar la aptitud bacteriana facilita la detección precisa y precisa de microorganismos utilizando códigos de barras de ADN genómicos únicos que se cuantifican a través de PCR digital. El protocolo describe el cálculo del índice competitivo para las cepas de Salmonella; sin embargo, la tecnología es fácilmente adaptable a los protocolos que requieren la cuantificación absoluta de cualquier organismo genéticamente maleable.

Resumen

Un índice competitivo es un método común utilizado para evaluar la aptitud bacteriana y/o la virulencia. La utilidad de este enfoque se ejemplifica por su facilidad de ejecución y su capacidad para estandarizar la aptitud de muchas cepas a un organismo de tipo salvaje. La técnica está limitada, sin embargo, por los marcadores fenotípicos disponibles y el número de cepas que se pueden evaluar simultáneamente, creando la necesidad de un gran número de experimentos de réplica. Simultáneamente con un gran número de experimentos, los costos de mano de obra y materiales para cuantificar bacterias basadas en marcadores fenotípicos no son insignificantes. Para superar estos aspectos negativos conservando los aspectos positivos, hemos desarrollado un enfoque molecular para cuantificar directamente los microorganismos después de diseñar marcadores genéticos en cromosomas bacterianos. Se insertaron códigos de barras de ADN únicos de 25 pares base en un locus inocuo en el cromosoma de cepas mutantes y de tipo salvaje de Salmonella. Los experimentos de competencia in vitro se realizaron utilizando inocula consistente en cepas agrupadas. Tras la competición, los números absolutos de cada cepa se cuantificaron utilizando PCR digital y los índices competitivos para cada cepa se calcularon a partir de esos valores. Nuestros datos indican que este enfoque para cuantificar la Salmonella es extremadamente sensible, preciso y preciso para detectar microorganismos altamente abundantes (alta aptitud) y raros (baja aptitud). Además, esta técnica es fácilmente adaptable a casi cualquier organismo con cromosomas capaces de modificar, así como a diversos diseños experimentales que requieren la cuantificación absoluta de microorganismos.

Introducción

Evaluar la aptitud y la virulencia de los organismos patógenos es un aspecto fundamental de la investigación en microbiología. Permite realizar comparaciones entre cepas o entre organismos mutados, lo que permite a los investigadores determinar la importancia de ciertos genes en condiciones específicas. Tradicionalmente, la evaluación de la virulencia utiliza un modelo animal de infección utilizando diferentes cepas bacterianas y observando el resultado del animal infectado (por ejemplo, Dosis Infecciosa₅₀, Dosis letal_50,tiempo hasta la muerte, gravedad de los síntomas, falta de síntomas, etc.). Este procedimiento proporciona descripcion....

Protocolo

1. Incorporar códigos de barras de ADN únicos en un plásmido que contiene los componentes necesarios para el intercambio alélico

NOTA: Se creó un nuevo plásmido, denominado pSKAP, con un alto número de copia y una mayor eficiencia de transformación en comparación con el plásmido de intercambio alómico pKD13 existente. Esto se describe en los pasos 1.1-1.12 (Figura1). Los plásmidos finalizados que contienen códigos de barras de ADN únicos y componentes para el intercambio alélico están disponibles a través de un repositorio de plásmidos (Tabla de materiales).

1. Usando un....

Resultados

El uso de esta metodología requiere que se realicen las reacciones de control adecuadas para validar la sensibilidad y especificidad de cada sonda utilizada para identificar el ADN objetivo. En este experimento representativo, validamos ocho códigos de barras de ADN únicos con las ocho sondas correspondientes para su identificación. Las ocho sondas tenían una baja tasa de falsos positivos tanto en NTC como en reacciones de control negativas (Tabla3),destacando su especifi.......

Discusión

La capacidad de cuantificar con precisión los microorganismos es de suma importancia para la investigación de microbiología, y la capacidad de enumerar cepas únicas de una población mixta inicial ha demostrado ser una herramienta invaluable para evaluar los rasgos de aptitud y virulencia en gérmenes. Sin embargo, las técnicas para lograrlo no han progresado en el ritmo de los desarrollos modernos en biología molecular. La tecnología para modificar fácilmente los cromosomas de muchas bacterias, incluyendo S. Typh.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	22600028	Adquiera de cualquier fabricante
Tubos de cultivo de 16 mL MidSci		8599	Adquiera de cualquier fabricante
5-200 μ L puntas de pipeta	RAININ	30389241	Adquirir marcas alternativas de puntas con precaución en función de la calidad
de fabricación 5-50 μ L pipeta multicanal	RAININ	17013804	Utilice con precaución pipetas multicanal alternativas
Agarosa ThermoFisher	Scientific	BP160-500	Adquiera de cualquier fabricante
BLAST Analysis	NCBI	N/A	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Termociclador táctil con módulo de reacción de 96 pocillos profundos	Bio Rad	1851197	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Químicamente competente DH5 y alfa;	Invitrogen	18258012	Adquiera de cualquier fabricante o prepare usted mismo
Cloranfenicol	ThermoFisher Scientific	BP904-100	Compre de cualquier fabricante
Cytation5 Lector de microplacas	BioTek	CYT5MF	Adquiera de cualquier fabricante, utilice cualquier sistema capaz de cuantificar con precisión el software de análisis de datos de ADN
(QuantaSoft y QuantaSoft Data Analysis Pro)	Bio Rad	N/A	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Placas de 96 pocillos DDPCR	Bio Rad	12001925	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
ddPCR Supermix para sondas (No dUTP)	Bio Rad	1863024	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Cartuchos DG8 para el generador de gotas QX200/QX100	Bio Rad	1864008	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Juntas DG8 para el generador de gotas QX200/QX100	Bio Rad	1863009	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Aceite de generación de gotas para sondas	Bio Rad	1863005	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Kanamicina	ThermoFisher Scientific	BP906-5	Adquiera de cualquier fabricante
Agar Luria-Bertani	ThermoFisher Scientific	BP1425-2	Adquiéralo de cualquier fabricante o hágalo usted mismo a partir de agar, triptona, digestión de levadura y NaCl
Caldo Luria-Bertani	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	Adquisición de cualquier fabricante o hágalo usted mismo a partir de triptona, digestión de levadura y NaCl
Placa PCR Termosellado, lámina, perforable	Bio Rad	1814040	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Tubos de PCR	Eppendorf 951010022		Adquiera de cualquier fabricante Placas de
Petri	ThermoFisher Scientific		FB0875712 Adquiera de cualquier fabricante
pPCR Script Cam SK+	Stratagene/Agilent	211192	Ya no está disponible comercialmente
Diseño de imprimación/sonda	IDT	N/A	https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP y pSKAP_Barcodes	números	plásmido Addgene 122702-122726	www.addgene.org
Sellador de placas PX1 PCR	Bio Rad	1814000	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Todavía no hay alternativas disponibles.
Generador de gotas QX200	Bio Rad	1864002	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
QX200 Droplet Reader	Bio Rad	1864003	Debe adquirir suministros de ddPCR de Bio Rad. Las alternativas aún no están disponibles.
Salmonella typhimurium cepa ATCC 14028s	ATCC	ATCC 14028s	www.atcc.org
Placa de microvolumen Take3	BioTek	TAKE3	Adquiera de cualquier fabricante, utilice cualquier sistema capaz de cuantificar con precisión el ADN
Thermo Scientific FastDigest BamHI	ThermoFisher Scientific		FERFD0054 Adquiera de cualquier fabricante
Thermo Scientific FastDigest DpnI	ThermoFisher Scientific	FERFD1704	Adquirir de cualquier fabricante
Thermo Scientific FastDigest HindIII	ThermoFisher Scientific		FERFD0504 Adquirir de cualquier fabricante
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0832	Adquirir de cualquier fabricante
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit	ThermoFisher Scientific	FERK0503	Adquiera de cualquier fabricante
Thermo Scientific Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	ThermoFisher Scientific	F534L	Adquiera de cualquier fabricante
Thermo Scientific T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	FEREL0011	Adquiera de cualquier fabricante
Thermocycler	Bio Rad	1861096	Adquiera de cualquier fabricante
Transiluminador UVP Visi-Blue	ThermoFisher Scientific	UV95043301	u otro transiluminador que permita la visualización del ADN Agua
, Biología Molecular Grado	ThermoFisher Scientific	BP28191	Adquirir de cualquier fabricante

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