Aquí describimos una inmunocaptura indirecta de sándwich ELISA para determinar el contenido de glicoproteína inmunogénica en las vacunas contra la rabia. Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal neutralizante (mAb-D1) que reconoce los recortadores de glicoproteína. Es una alternativa a la prueba in vivo de NIH para seguir la consistencia de la potencia de la vacuna durante la producción.
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Artículo de método
Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia
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Resumen
Resumen
La creciente preocupación mundial por el bienestar animal está alentando a los fabricantes y a los Laboratorios Nacionales de Control (OMCL) a seguir la estrategia 3R s para la sustitución, reducción y refinamiento de las pruebas en animales de laboratorio. Se recomienda el desarrollo de enfoques in vitro a nivel de la OMS y europa como alternativas a la prueba de NIH para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia. En la superficie de la partícula del virus de la rabia (RABV), los recortadores de glicoproteína constituyen el principal inmunogen para inducir anticuerpos neutralizantes virales (VNAbs). Se ha desarrollado una prueba ELISA, en la que los anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAb-D1) reconocen la forma trimérica de la glicoproteína, para determinar el contenido de la glicoproteína trimérica plegada nativa junto con la producción de los lotes de vacunas. Esta prueba de potencia in vitro demostró una buena concordancia con la prueba de NIH y se ha encontrado adecuada en ensayos colaborativos por fabricantes de vacunas RABV y CLUFs. Evitar el uso animal es un objetivo alcanzable en un futuro próximo.
El método presentado se basa en una inmunocaptura de sándwich ELISA indirecta utilizando el mAb-D1 que reconoce los sitios antigénicos III (aa 330 a 338) de la glicoproteína RABV trimérica, es decir, el antígeno RABV inmunogénico. mAb-D1 se utiliza tanto para el recubrimiento como para la detección de recortadores de glicoproteína presentes en el lote de vacunas. Dado que el epítopo es reconocido debido a sus propiedades conformacionales, la glicoproteína potencialmente desnaturalizada (menos inmunogénica) no puede ser capturada y detectada por el mAb-D1. La vacuna a probar se incuba en una placa sensificada con el mAb-D1. Las glicoproteínas RABV recortadas enlazadas se identifican añadiendo el mAb-D1 de nuevo, etiquetado con peroxidasa y luego revelado en presencia de sustrato y cromógeno. La comparación de la absorbancia medida para la vacuna probada y la vacuna de referencia permite la determinación del contenido de glicoproteína inmunogénica.
Introducción
Desde hace más de 50 años, la prueba1 de NIH se utiliza como método estándar de oro para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia antes de la liberación por lotes. Esta prueba consiste en una inmunización intraperitoneal de grupos de ratones con la vacuna que se va a probar seguida de un desafío intracerebral (IC) 14 días después con la cepa del virus Challenge (CVS) del virus de la rabia (RABV). La potencia se evalúa a partir de la proporción de ratones que sobreviven al desafío IC. Aunque la OMS2 y la Farmacopea Europea3 todavía requieren la prueba de NIH para evaluar la potencia de la v....
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Protocolo
1. Precauciones de seguridad
NOTA: Este método es aplicable tanto a rabV vivo como a la vacuna inactivada.
- Utilice buenos procedimientos de práctica de laboratorio y seguridad.
- Use el equipo de protección personal (PPE) adecuado, incluyendo abrigo desechable, guantes, máscara, gafas, etc.
- Cuando el virus vivo esté valorado, utilice un armario de seguridad biológica de clase II.
- Considere cualquier material en contacto con las muestras (reactivos, soluciones de lavado, etc.) como material infeccioso.
- Tratar el material contaminado sumergiendo en la solución de lejía (2,5% de hipoclorito de sod....
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Resultados
En el siguiente ejemplo se utiliza la vacuna de referencia Lote 09, que consiste en partículas purificadas del virus de la rabia inactivadas (cepa de vacuna PV). El contenido de los recortadores de glicoproteína (10 g/ml) en esto se ha establecido después de la determinación de la cantidad total de proteínas virales (prueba BCA) y la evaluación del porcentaje de la glicoproteína por electroforesis de gel de sDS-poliacrilamida. Alternativamente, se puede utilizar una vacuna de referencia c.......
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Discusión
El epítopo reconocido por el mAb-D1 se encuentra en el sitio antigénico III de la glicoproteína RABV, que no sólo es inmunodominante para la inducción de VNAbs, sino que también participa en neurovirulencia, patogenicidad40,,41 y reconocimiento de receptores42. Hay otro sitio antigénico importante a lo largo de la glicoproteína, sitio II43, contra el cual se han aislado varios MAbs como mAb-WI-1112.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La Dra. Sylvie Morgeaux y la Dra. Jean-Michel Chapsal deben ser reconocidas por su participación clave para establecer el ensayo ELISA sobre lotes de vacunas y para organizar talleres internacionales y estudios colaborativos. Agradecemos a Sabrina Kali por la lectura crítica del manuscrito. El Dr. Pierre Perrin fue responsable del aislamiento y caracterización de mAb-D1. Este trabajo ha sido apoyado principalmente por la financiación del Instituto Pasteur.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cabina de seguridad biológica de clase II | ThermoFisher Scientific | 10445753 | si se valora virus vivos |
| Placas transparentes de fondo plano inmuno no estériles de 96 pocillos, 400 y micro; L, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | bueno para unirse al anticuerpo cargado |
| Equip Labo Campana de gases de laboratorio de polipropileno | ThermoFisher Scientific | 12576606 | para la preparación de ácido sulfúrico |
| Placa de inmunología Strong Adsorción MAXISORP Pozo < fondo planobr/> F96 | Dutscher | 55303 | bueno para unirse al anticuerpo cargado |
| Sellado de microplacas Cinta (100 hojas) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate lector monomodo Sunrise | TECAN | ||
| Agitador-incubador de microplacas | Dutscher | 441504 | |
| Lavadora de microplacas Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Pipeta multicanal (30-300 y micro; L) Pipetas | monocanal ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μ L micro, 2-20 μ L, 20-200 μ L & 100-1000 μ L) | ThermoFisher Scientific 4700880 |
Referencias
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
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Reimpresiones y permisos
