Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

Summary

Reportamos la electroporación del ARN mensajero (ARNm) como un método que permite la expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en el sistema modelo de embriones de codorniz. Este método se puede utilizar para etiquetar fluorescentes las células y registrar sus movimientos in vivo mediante microscopía de lapso de tiempo poco después de la electroporación.

Abstract

Informamos que la electroporación de ARNm permite que las proteínas fluorescentes etiqueten las células en embriones de codorniz vivos de forma más rápida y amplia que la electroporación del ADN. La alta eficiencia de la transfección permite que al menos 4 ARNm distintos sean co-transfigurados con una eficiencia del 87 %. La mayoría de los ARNm electroportados se degradan durante las primeras 2 h después de la electroporación, lo que permite realizar experimentos sensibles al tiempo en el embrión en desarrollo. Por último, describimos cómo crear imágenes dinámicas de embriones vivos electroporados con ARNm que codifican varias proteínas fluorescentes subcelulares dirigidas.

Introduction

La electroporación es un método de transfección física que utiliza un pulso eléctrico para crear poros transitorios en la membrana plasmática, permitiendo que sustancias como ácidos nucleicos o productos químicos pasen al citosol. La electroporación se utiliza ampliamente para suministrar ADN en bacterias, levaduras, plantas y células de mamíferos^1,2,3. Se utiliza rutinariamente para introducir cargas útiles genéticas en las células y tejidos diana dentro del embrión aviar en desarrollo para estudiar el control genético del desarrollo o etiquetar las poblaciones migratorias d....

Protocol

Todos los procedimientos de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas del Children's Hospital Los Angeles y los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de California.

1. Generación de vectores de expresión basados en pCS2

1. Para clonar pCS2.Lifeact-eGFP, prepare la columna vertebral vectorial digiriendo 2 g de pCS2.CycB1-GFP (una construcción que contenga un inserto diferente) con BamHI (10 U) y BsrGI (10 U) en el búfer de digestión adecuado (ver Tabla de Materiales) diluido a 1o en una reacción total volumen de 50 oL durante 1 h a 37 oC (véase

Results

La electroporación de ARNm es más eficiente que la electroporación de ADN

Usamos pCS2+. H2B-Citrine para preparar mRNA transcrito in vitro. Dado que la electroporación de ADN se realiza generalmente a 1-2 g/L, utilizamos una concentración equimolar de ARNm (calculada en torno a 0,25-0,5 g/L para H2B-Citrine) para la electroporación de ARNm. Primero probamos la eficiencia de electroporación de pCS2+. ADN H2B-Citr.......

Discussion

En este protocolo, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo microinyectar y electroporar con precisión el ARNm en las células de los embriones de codorniz gastrulantes. Demostramos que la electroporación de ARNm sintetizada in vitro permite la expresión rápida y eficiente de proteínas fluorescentes (FP) en embriones de codorniz gastrulantes (Figura2 y 3). La fluorescencia de la proteína H2B-citrine traducida a partir de ARNm electroportados podría detectarse media.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI-HF	New England Biolabs	R3136L
BglII	New England Biolabs	R0144S
BsrG1-HF	New England Biolabs	R3575S
NotI-HF	New England Biolabs	R3189L
SalI-HF	New England Biolabs	R3138L
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico	Thermo Fisher
SP6 mMessage Machine kit de transcripción in vitro	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol, t-octilfenoxipolietoxietanol, Éter de polietilenglicol tert-octilfenilo
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	2-(4-Amidinofenil)-6-indolcarbamidina diclorhidrato, 4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato, DAPI diclorhidrato Whatman
No.1 papel de filtro	Sigma Aldrich	WHA1001125
glicerol	Sigma	Aldrich G9012
Urea	Sigma Aldrich	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi fue un regalo de Dorus Gadella (Plásmido Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Methods 2008;5:605-7. ID de PubMed:
18536722 pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		Este documento
pCS.H2B-citrino	Addgene	53752	pCS-H2B-citrino fue un regalo de Sean Megason (Plásmido Addgene # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry fue un regalo de Sean Megason (Plásmido Addgene # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; Microscopio invertido RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780	Carl Zeiss Microscopy GmbH		El LSM-780 es un microscopio confocal y multifotónico que ofrece la sensibilidad necesaria para el trabajo de imagen vital. Equipado con una platina motorizada, un dispositivo de enfoque automático y una incubadora oscurecida de etapa completa, el 780 es un microscopio excelente para la obtención de imágenes de células vivas/embriones de alta gama. El detector Quasar de 32 canales de alta sensibilidad permite la obtención de imágenes espectrales, la no mezcla lineal y la adquisición de imágenes de alto recuento de colores (>4). La excitación se puede realizar con láseres de fotón único de 6 líneas (405, 458, 488, 514, 564 y 633 nm), láser de 2 fotones Chameleon (Coherent) (rango de 690 nm a 1000 nm) y se puede ejecutar con el software del sistema ZEN 2011 SP7 (Black).
CUY-21 EDIT electroporador in vivo	Bex Co., Ltd.
Electrodo cuadrado plano de platino, longitud lateral 5 mm	Bex Co., Ltd.
Microscopio estereoscópico Olympus MVX10 FL Cámara monocromática	Olympus LifeScience
XM10 Olympus	LifeScience
con fosfato (PBS) para HCR (10 veces, pH 7,4)			Para preparar 1 L de una solución madre de 10 veces, combine 80 g de NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g de KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g de Na2HPO4 (anhidro; Sigma-Aldrich S3264), y 2,7 g de KH2PO4 (anhidro; Sigma-Aldrich P9791). Ajuste el pH a 7,4 con HCl y lleve el volumen final a 1 L con H2O ultrapuro. Evite el uso de CaCl2 y MgCl2 en PBS para HCR. Es importante que el PBS para HCR se prepare como una solución libre de RNasa (por ejemplo, mediante tratamiento con dietilpirocarbonato [DEPC]).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			Agregue 1 mL de Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) y 100 mL de 10× PBS a 890 mL de H2O destilado ultrapuro. Filtre la solución a través de un 0.2 μ m filtrar y almacenarlo a 4 ? C hasta su uso.
1 & veces; solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tratada con DEPC; pH 7.4)
0.1% Triton X-100