Method Article

Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

DOI:

10.3791/59664

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June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reportamos la electroporación del ARN mensajero (ARNm) como un método que permite la expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en el sistema modelo de embriones de codorniz. Este método se puede utilizar para etiquetar fluorescentes las células y registrar sus movimientos in vivo mediante microscopía de lapso de tiempo poco después de la electroporación.

Abstract

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Informamos que la electroporación de ARNm permite que las proteínas fluorescentes etiqueten las células en embriones de codorniz vivos de forma más rápida y amplia que la electroporación del ADN. La alta eficiencia de la transfección permite que al menos 4 ARNm distintos sean co-transfigurados con una eficiencia del 87 %. La mayoría de los ARNm electroportados se degradan durante las primeras 2 h después de la electroporación, lo que permite realizar experimentos sensibles al tiempo en el embrión en desarrollo. Por último, describimos cómo crear imágenes dinámicas de embriones vivos electroporados con ARNm que codifican varias proteínas fluorescentes subcelulares dirigidas.

Introduction

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La electroporación es un método de transfección física que utiliza un pulso eléctrico para crear poros transitorios en la membrana plasmática, permitiendo que sustancias como ácidos nucleicos o productos químicos pasen al citosol. La electroporación se utiliza ampliamente para suministrar ADN en bacterias, levaduras, plantas y células de mamíferos1,2,3. Se utiliza rutinariamente para introducir cargas útiles genéticas en las células y tejidos diana dentro del embrión aviar en desarrollo para estudiar el control genético del desarrollo o etiquetar las poblaciones migratorias de células4,5,6, 7. Sin embargo, también existen varias limitaciones experimentales con la electroporación de ADN8. Por ejemplo, la electroporación de ADN a menudo introduce números muy variables de vectores de expresión por célula y posteriormente los ARNm y proteínas que codifican. Esta variabilidad puede dar lugar a una considerable heterogeneidad celular quecomplica tanto el análisis de imágenes como la interpretación de datos 9,10. Además, las proteínas de la electroporación del ADN sólo comienzan a expresar 3 h después de la electroporación y no alcanzan la máxima eficiencia en el número de células y la intensidad de la fluorescencia hasta las 12 h, probablemente debido al tiempo necesario para transferirse al núcleo y completar transcripción y traducción in vivo11.

Por el contrario, la transfección de ARNm se ha utilizado eficazmente en una variedad de sistemas de modelos, incluyendo ovocitos De Xenopus laevis por microinyección12,13, reprogramación de células madre humanas por transfección de lipofectamina mRNA14 , y electroporating de células madre neurales recalcitrantes en ratones adultos15. Probamos la capacidad de la electroporación de ARNm para etiquetar eficientemente las células durante el desarrollo embrionario aviar temprano utilizando ARNm sintetizados in vitro que codifican proteínas fluorescentes distintas (FPs). Para nuestros estudios, utilizamos el vector pCS2+, un vector de expresión multipropósito que se utiliza comúnmente para expresar proteínas en embriones de Xenopus y pez cebra. Los promotores de la polimerasa de ARN SP6 y T7 en el pCS2+ permiten la síntesis de ARNm y proteína de cualquier gen clonado cuando se utiliza en un sistema de transcripción/traducción in vitro.

Aquí, demostramos que la electroporación de ARNm permite la expresión rápida y eficiente de proteínas fluorescentes (FP) en embriones de codorniz gastrulantes. Diseñamos y generamos muchos de los vectores de expresión utilizados en estos estudios. Por ejemplo, subclonamos el gen LifeAct-eGFP16 en el vector pCS2+17 para expresarlo desde el promotor cmV y el promotor SP6. El gen insertado se encuentra aguas abajo del promotor SP6 y aguas arriba de la cola SV40 poli(A)18. En embriones coelectroportados con ARNm y ADN, los FP codificados a partir de ARNm transcritos in vitro se detectaron por primera vez en un plazo de 20 minutos de electroporación, mientras que los FP de vectores de expresión de ADN se detectaron sólo después de 3 h. Múltiples ARNm codificados para nuclear, Golgi y proteínas de membrana pueden electroporarse en un embrión simultáneamente, lo que resulta en la expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en células individuales. Finalmente, utilizando una recuperación de fluorescencia in vivo después del ensayo de fotoblanqueo (FRAP), mostramos que la mayoría de los ARNm electroportados se descomponen dentro de 2 h. Por lo tanto, la rápida producción inicial de proteínas combinada con una nueva traslación de proteínas limitada hace que la electroporación de ARNm sea una técnica valiosa cuando es necesario un control temporal de la expresión.

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Protocol

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Todos los procedimientos de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas del Children's Hospital Los Angeles y los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de California.

1. Generación de vectores de expresión basados en pCS2

  1. Para clonar pCS2.Lifeact-eGFP, prepare la columna vertebral vectorial digiriendo 2 g de pCS2.CycB1-GFP (una construcción que contenga un inserto diferente) con BamHI (10 U) y BsrGI (10 U) en el búfer de digestión adecuado (ver Tabla de Materiales) diluido a 1o en una reacción total volumen de 50 oL durante 1 h a 37 oC (véase la figura 1 para el esquema del procedimiento de clonación).
    1. Defosforilalos los extremos libres 3'OH de la columna vertebral vectorial de la reacción enzimática de restricción mediante la adición de fosfatasa alcalina de camarón (1 U). Incubar durante 30 min a 37oC.
    2. Ejecuta toda la mezcla en un tampón EDTA (TAE) de gel de agarosa al 1%/1x Tris Acetate edTA a 90 V durante 50 min y luego mancha el gel en una solución de 0,5 g/ml de bromuro de etidio en 1x tampón TAE durante 15 minutos con balanceo suave. Además, asegúrese de cargar marcadores de peso molecular en un carril libre para ayudar a determinar los tamaños de ADN.
    3. Usando un Transiluminador UV seguro para el ADN para evitar el abusar de los ADN, corte rápidamente la columna vertebral vectorial (tamaño de banda esperado de 4 kb) del gel de agarosa y aísle el fragmento de ADN de la pieza de gel utilizando las instrucciones del fabricante.
  2. Simultáneamente con el paso 1.1, prepare el inserto digiriendo 2 g de pEGFP-N1-Lifeact con BglII (10 U) y BsrGI (10 U) en el tampón de digestión adecuado diluido a 1x en un volumen de reacción total de 50 oL durante 1 h a 37 oC. Ejecuta toda la mezcla en un gel de agarosa del 1% para aislar la banda de 800 bp como se explicó anteriormente en el paso 1.1.2-1.1.3.
  3. Después de que tanto el vector como el inserto se purifiquen y cuantifiquen en el espectrofotómetro, combine 50 ng del vector y 38 ng del inserto (1:3 proporción molar de vector a insertar) en el tampón de ligasa de ADN T4 antes de añadir la ligasa de ADN T4 para catalizar la reacción de ligación. Además, configure un control sin ADN, un control de solo vector y un control de solo inserción. Incubar todas las reacciones a temperatura ambiente durante 30 min.
    1. Transformar 1 l de la(s) mezcla(s) de ligadura(s) en E. coli DH10 competente. Además, transforme el control negativo del agua y 20 pg de control positivo pUC19. Esparza las bacterias en las placas de agar de Luria (LB) que contienen ampicilina de 50 g/ml e incubadurante durante la noche a 37oC.
    2. A la mañana siguiente, cuenta las colonias en cada plato.
      NOTA: Idealmente, no debe haber colonias en las placas de control negativas, >100 colonias en las placas de ligadura vector+insert, y menos colonias en la placa de solo vectores.
    3. Escoge al menos 8 colonias bacterianas de la placa de agar transformadas con la mezcla de ligadura vector+insert e inocularlas usando palillos de dientes estériles o puntas de pipeta en 2 ml de caldo líquido LB que contenga 50 g/ml de ampicilina.
    4. Extrae ADN de cada uno de los clones utilizando kits de miniprep de plásmido comercial.
    5. Ejecuta un resumen de restricción diagnóstica usando 500 ng de ADN de cada clon usando NotI (10 U) y BamHI (10 U) en el tampón de digestión adecuado diluido a 1x durante 1 h a 37oC y ejecuta el ADN digerido en un gel de agarosa del 1% en 1 tampón TAE. Los tamaños de banda esperados para clones positivos pCS2.Lifeact-eGFP son de 3,9 kb y 978 bp.
    6. Transforma 1 pg-100 ng de ADN del clon positivo en E. coli DH10 competente, y prepara 3-4 reacciones miniprep como se detalla en pasos anteriores para obtener una cantidad suficiente de ADN para la reacción de transcripción in vitro (10 g como mínimo).

2. Preparación de ARNm mediante transcripción in vitro

  1. Linealizar 10 g de pCS2.LifeAct-eGFP en el extremo de 3' de la plaquita con NotI (10 U) en un tampón de digestión adecuado diluido a 1x en un volumen de reacción total de 50 oC a 37 oC durante la noche.
    NOTA: Para evitar la contaminación por RNase y reducir la degradación del ARNm, use guantes mientras manipula muestras de ARNm.
  2. Purificar el ADN utilizando una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamilo (25:24:1, v/v).
    1. Añadir 150 l de agua libre de RNase para que el volumen total de la reacción de digestión sea igual a 200 l. A continuación, añadir 200 l de fenol: cloroformo: alcohol isoamilo y vórtice la mezcla durante 20 s.
    2. Centrífuga en un microfúcteo a velocidad máxima (18.400 x g) durante 2 min. Retire cuidadosamente la fase acuosa superior que contiene el ADN linealizado. Repita este paso para eliminar impurezas adicionales y tenga cuidado de no interrumpir el precipitado blanco que se puede formar entre las fases líquidas inferior y superior.
  3. Precipita el ADN linealizado añadiendo 1/10 volumen de acetato de sodio 3M (sin RNase) y 2,5 volúmenes de etanol 100%. Dejar la mezcla a -20 oC durante >30 min, luego peletizar el ADN centrifugando a velocidad máxima (18.400 x g).
    1. Lavar el pellet de ADN con 70% de etanol, luego secar al aire el pellet durante >5 min.
    2. Disolver el pellet de ADN en 5 l de agua libre de RNase. Cuantificar el ADN por espectrofotómetro.
      NOTA: La concentración de ADN esperada es de 0,5-1 g/L con una relación A260/A280 entre 1,7 y 2,0.
  4. Utilice 1 g del ADN linealizado pCS2.LifeAct-eGFP para la transcripción in vitro (IVT). Siga las instrucciones del fabricante en el kit comercial (ver Tabla de Materiales) para incluir 10 l de tapa analógica (concentración final 0,8 mM) y NTP (concentración final 1 mM para ATP, CTP y TTP; 0,2 mM para GTP), 2 l de reacción de 10x (concentración final 1x), 2 l de ARN polimerasa SP6 y agua libre de RNase de hasta 20 l.
    1. Incubar la mezcla de IVT durante aproximadamente 2 h o más, dependiendo del tamaño de la transcripción.
      NOTA: La incubación de 2 h funciona bien para una transcripción de 3 kb, pero la incubación durante la noche funciona mejor para transcripciones que son mayores de 5 kb.
    2. Para eliminar los nucleótidos libres de la reacción de transcripción, agregue 30 ml de solución de precipitación de ARN LiCl (cloruro de litio de 7,5 M, EDTA de 50 mM) para precipitar el ARNm. Vortex la mezcla brevemente y almacenar a -20 oC durante 30 min. Gire el ARNm hacia abajo durante 15 minutos en un microfuo a velocidad máxima (18.400 x g)y enjuague con 70% de etanol (sin RNase).
  5. Disolver el ARNm sintetizado en 15 ml de agua libre de RNase. Dispensar el ARNm sintetizado a 5 l/tubo (3 tubos en total) y colocar a -80 oC para el almacenamiento a largo plazo. Cuantitativa el ARNm con un espectrofotómetro.
    NOTA: El rendimiento previsto es de 15-20 g de arnm (1 g/L). 1 l (1 g/l) es suficiente para un experimento con 10 embriones, suponiendo que el ARNm se diluya de 1 g/l a 500 ng/L y que cada embrión se inyecta con 200 nL. Por lo tanto, cada tubo debe contener suficiente ARNm para los experimentos de 5.
  6. Ejecutar 300 ng de ARNm en un gel de agarosa del 1% en 1 tampón TAE después de limpiar todos los equipos de gel con la solución de descontaminación RNase (por ejemplo, RNase Away) y asegurarse de que el ARNm aparece como una banda (pueden estar presentes varias bandas si se forman estructuras secundarias) y que no se mancha un frotis un frotis ppears en el carril de gel, que indica la degradación del ARN.

3. Preparación de la mezcla de electroporación de ARNm

  1. Descongelar y diluir el ARNm a la concentración deseada (250-500 ng/L en agua libre de RNase funciona bien para todos los ARNm probados en este trabajo). Añadir 1/10 volumen de tinte coloreado (ver Tabla de Materiales, Libre de ARNI, 0.1% concentración final) para ayudar a visualizar el sitio de inyección de ARNm y colocar correctamente los electrodos.
    NOTA:     Si el ADN y el ARN se combinan para realizar una coelectroporación, asegúrese de que el ADN esté libre de Arqueos contaminantes mediante la extracción de fenol-cloroformo y la precipitación de etanol antes de la mezcla de ARNm y ADN.
    1. Asegúrese de preparar un control negativo utilizando una solución de electroporación simulada (sin ARN añadido). Si es posible, prepare un control positivo utilizando mRNA prevalidado (arNM que se ha demostrado que produce FP con éxito en experimentos anteriores).
      NOTA: El control negativo es esencial para que todos los experimentos de imágenes establezcan niveles de fluorescencia en segundo plano para la normalización de los datos. El control positivo es especialmente importante cuando se trabaja con mRNA recién transcrita al ayudar a confirmar que los ajustes de electroporación funcionaron.
  2. Almacene la solución de electroporación de ARNm en una suspensión de hielo para evitar la degradación hasta que esté lista para proceder con la electroporación.

4. Electroporate arNM en embriones de codorniz viviente

  1. Recoger los huevos de codorniz fertilizados recién puestos todos los días y almacenar a 13 oC en un refrigerador humidificado durante no más de 1 semana. Incubar los huevos de codorniz a 38oC hasta las etapas de desarrollo embrionario deseadas19,20,21.
    NOTA: HH3 a HH5 se utilizaron en este estudio para imágenes estáticas y dinámicas. Para los embriones HH3, dejar los óvulos a temperatura ambiente durante 2 h antes de la cosecha hace que el proceso de aislamiento sea mucho más fácil, ya que los embriones son generalmente más resistentes a las manipulaciones físicas cuando se enfrían.
  2. Aislar y preparar embriones según el sistema de cultivo de la CE22. Recoger al menos 5 embriones por condición, incluyendo al menos uno para servir como un control negativo (no electroporado).
    1. Rompe suavemente y vierte el huevo en un plato Petri de 10 cm. Retire la mayor parte de la albúmina gruesa con una pipeta de transferencia y retire la albúmina gruesa restante alrededor del embrión limpiando suavemente la superficie de la yema con una toallita de tejido para asegurarse de que el embrión se pegue firmemente al anillo de papel.
    2. Poner papel de filtro precortado (ver Tabla de Materiales)sobre el embrión y utilizar tijeras para cortar suavemente alrededor del perímetro del embrión.
    3. Utilice una pipeta Pasteur para subyficar el embrión con PBS, utilizando corrientes suaves para desalojar cualquier yema que se pegue al embrión.
      NOTA: Este paso es fundamental cuando se trabaja con embriones más jóvenes (
    4. Tire lentamente del anillo de embrión/papel en un ángulo oblicuo hacia arriba y hacia fuera de la yema en una placa Petri llena de PBS para su posterior limpieza. Una vez que se haya eliminado la mayor parte de la yema, coloque el lado ventral embrionario hacia arriba en una placa Petri de 35 mm cubierta con una mezcla semisólida de agar/albúmina.
  3. Preparar microcapilares de vidrio de seis a ocho de 10 cm de largo (D.O. a 1,2 mm) utilizando un instrumento de tirador de micropipeta de vidrio.
  4. Coloque el lado ventral embrionario hacia arriba en la cámara de electroporación llena de PBS. Usando un microcapilar de vidrio, inyectar un bolo de 200 nL de la mezcla de ARNm o electroporación de ADN/mRNA en la cavidad entre la membrana epiblasto y vitelina que cubre la región deseada.
    NOTA: Toda el área anterior para pellucida y alguna zona para opaca fue electroporada en la mayoría de los experimentos mostrados en este manuscrito.
  5. Coloque los electrodos positivos y negativos (electrodo cuadrado plano platino; longitud lateral de 5 mm) en la parte superior e inferior del embrión respectivamente y el electroporato utilizando la siguiente secuencia de pulsos: cinco pulsos eléctricos cuadrados de 5 V, 50 ms de duración con intervalos de 100 ms usando un electroporator in vivo. Asegúrese de que la distancia entre los electrodos es de 5 mm.
    NOTA: Optimizar los parámetros de electroporación es crucial para evitar condiciones que puedan matar las células embrionarias frágiles. Se deben considerar los parámetros de voltaje, longitud de pulso, intervalos de pulso según el número de pulsos para el ADN y el ARNm para varios dispositivos de electroporación.
  6. Incubar los embriones electroportados a 38oC a la etapa de desarrollo deseada.
    NOTA: Un estereoscopio de disección fluorescente (ver Tabla de Materiales)ayuda a examinar embriones transinfectados frente a embriones no transinfectados.
  7. Si los embriones deben ser investigados estáticamente, fijarlos en 4% paraformaldehído en PBS durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 oC.
    1. Retire los embriones de la membrana vitelina cortando suavemente alrededor del perímetro del papel filtrante con tijeras y despegando la membrana brillante en la superficie dorsal con fórceps afilados suavemente.
    2. Lavar los embriones fijos en PBS/Triton (0,1%) 2x durante 5 min y continuar con hibridación in situ o inmunomanchasi si se desea.
    3. Por último, manchar el embrión en 0,5 g/L de DAPI en PBS/Triton (0,1%) durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Lavar los embriones en PBS/Triton 2x durante 5 min y limpiar el embrión en la solución SCALE-U223 durante la noche.
  8. Para analizar la eficiencia de la electroporación (véase la figura2), utilice la herramienta de análisis binario y de partículas y el canal DAPI en ImageJ para obtener contornos nucleares de todas las celdas de la imagen.
    1. Para utilizar la herramienta binaria en ImageJ, utilice un único sector z en el canal DAPI que contenga la mayoría de las celdas y haga clic en Proceso > Binario > Crear binario. Para separar celdas cercanas, haga clic en Proceso > Binario > Cuenca hidrográfica. Para obtener contornos de celda, haga clic en Analizar > Analizar partículas, tamaño establecido en 100-500 (m2).
    2. Asegúrese de que la mayoría de las celdas se describen en el canal DAPI y guarde los contornos de celda haciendo clic más > Guardar en la ventana emergente Administrador de ROI.
    3. Utilice estos contornos para obtener valores de intensidad de fluorescencia para el ARNm y el canal de ADN abriendo el archivo guardado previamente en un solo corte z en el ARNm o canal de ADN y, a continuación, haga clic en Medir en el gestor de ROI.
    4. Por último, filtre estos valores de intensidad, contando las células con <6.000 de intensidad de fluorescencia como no transtrampetes y las células con >6.000 de intensidad de fluorescencia transinfectadas.

5. FPs de imagen codificados por ARNm electroportados

  1. Elija el embrión electroporado más saludable y mejor para los experimentos de imágenes dinámicas después de examinar todos los embriones electroporados bajo el estereoscopio de disuadeción fluorescente.
    1. Continúe incubando los otros embriones electroporados y el embrión no electroporado (el control negativo) en una incubadora separada mientras toma imágenes del embrión elegido en caso de que este embrión muera durante el experimento.
  2. Para la toma de imágenes dinámicas, utilice el cultivo de embriones ex ovo aviar de montaje completo como se describió anteriormente24,25,26 con un microscopio confocal invertido.
    NOTA:     El microscopio está equipado con una incubadora en el escenario (ver Tabla de Materiales)que mantiene la temperatura a 36oC durante la toma de imágenes. Durante la configuración del microscopio se observó que los embriones incubados a 36 oC sobreviven más tiempo que a temperaturas más altas, posiblemente porque el láser puede causar calentamiento local en el embrión. Los lectores deben determinar la temperatura óptima de incubación en el escenario para su propia configuración del microscopio.
    1. Para visualizar dinámicamente la embriogénesis, limpie brevemente el embrión electroporado con PBS para eliminar cualquier burbuja que pueda formarse en el lado dorsal del embrión durante el proceso de electroporación moviendo el embrión usando fórceps en una limpieza de PBS Solución.
    2. Coloque el embrión limpio directamente sobre una placa de imágenes que contenga una fina capa de albúto-agar (150 l) asegurándose de no generar ninguna burbuja en la superficie dorsal del embrión22.
    3. Para garantizar la supervivencia de las imágenes a largo plazo, agregue un pequeño trozo de papel tisú humeante en los bordes interiores de la placa de imágenes y selle el plato con película de parafina para minimizar la evaporación durante la toma de imágenes y la incubación.
    4. Mueva este plato rápidamente a la etapa precalentada de un microscopio confocal y localice el tinte de color en el embrión utilizando el canal de campo brillante (láser PMT 20%), que identifica la región inyectada y electroporada.
  3. Ajuste el software de imagen al objetivo deseado (10 o 20x), espejo dicroro (488 nm para GFP nm, 561 para RFP), espectros de emisión (499-562 nm para GFP, 570-695 nm para RFP) y encienda un láser adecuado (488 nm para GFP, 561 nm para RFP).
    NOTA:     El ARNm electroportado se tradujo en proteínas que se observaron en 20 min (ver Figura 3). Los metadatos de imagen utilizados para la mayoría de las imágenes de este documento fueron: un microscopio confocal invertido con un objetivo de 20x (ver Tabla de Materiales); tiempo de permanencia de píxeles, 1,5 euros; media de escaneos de 4 líneas.
    1. Haga clic en Live en el software de imágenes y ajuste la potencia del láser a un ajuste que sea adecuado para la intensidad de la fluorescencia dependiendo de cada potencia láser del microscopio. Comience por tomar imágenes del embrión usando 1% de potencia láser, 800 ganancias, y aumente la potencia del láser lentamente en un 1% de incrementos hasta que se ven píxeles saturados.
    2. Siga esto disminuyendo ligeramente la potencia del láser hasta que ya no se ven píxeles saturados.
      NOTA: La potencia láser elegida para el comienzo de una sesión de imágenes de un embrión puede ser buena para puntos de tiempo más tempranos, pero no es ideal en momentos posteriores si la fluorescencia de las células se vuelve mucho más brillante o más tenue con el tiempo. Para abordar esto, idee el embrión con ajustes de potencia ligeramente más bajos inicialmente, ya que las células electroporadas generalmente se vuelven más brillantes durante las primeras 6 horas después de la electroporación (ver Figura 3A-E para la cuantificación del aumento de la señal). Si las imágenes posteriores están saturadas, continúe con la imagen con la configuración de imágenes original, pero tome una imagen adicional inmediatamente después con ajustes de imagen más débiles (agujero más pequeño o potencia láser más débil).
    3. Imagen del embrión cada 3-5 minutos con el fin de realizar un seguimiento de la migración celular individual a través de diferentes puntos de tiempo. Para este trabajo, las imágenes eran pilas z (50 m de espesor) de toda el área electroporada, además de un poco de espacio adicional hacia la parte inferior de la pila z en caso de que el embrión se hunde en el lecho de agarosa durante toda la sesión de imágenes.
    4. Observe la velocidad con la que se mueven las celdas comprobando los primeros puntos de tiempo de la primera película. Si las celdas se mueven a una velocidad rápida (lo que significa que saldrán del área de la región de la imagen dentro de un par de puntos de tiempo más), considere la posibilidad de expandir el zoom del área de la imagen (1x a 0,8x) o crear imágenes de una región diferente.
      NOTA: Las regiones embrionarias de la zona pellucida se mueven mucho más rápidamente que las de la zona, opacas. Además, los embriones más jóvenes (HH3, HH5) a menudo contienen células que están experimentando un movimiento más rápido en comparación con los embriones más viejos (>HH7).
    5. Después de tomar imágenes de la región electroporada del embrión, haga una imagen de una región no electroporada del mismo embrión para determinar los niveles de autofluorescencia (debe ser mínimo si se utiliza una baja potencia láser <10% para tomar imágenes del embrión).

6. Recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) para analizar la integridad del ARNm

NOTA: Se puede utilizar una recuperación de fluorescencia in vivo después del ensayo de fotoblanqueo (FRAP) para determinar cuánto tiempo se podría traducir el ARNm transinfectado al APF. El siguiente protocolo describe un experimento FRAP para detectar la vida media de H2B. ARNm de citrino en un embrión electroporado.

  1. Realice experimentos FRAP en el microscopio confocal invertido utilizando un objetivo de 20x 0.8 NA y un agujero completamente abierto.
    1. Después de confirmar la electroporación de H2B-Citrine en el estereomicroscopio y poner el embrión en la etapa precalentada en el microscopio confocal invertido (ver paso 5.2.4), fotoblanquear la mayor parte de la fluorescencia celular de H2B-Citrine en una variedad de tiempo puntos (45 min, 2 h y 5 h post-electroporación) mediante el uso del láser de 405 nm con 70% de potencia láser, 100 iteraciones, velocidad de escaneo 4, que deja sólo el 5% de la fluorescencia restante.
      NOTA: Este proceso debe tardar un par de minutos.
    2. Continúe incubando los embriones en el escenario a 36 oC después del fotoblanqueo.
  2. Asegúrese de prestar atención a las células que se dividen activamente dentro de la región fotoblanqueada, lo que indica que las células fotoblanqueadas no han muerto completamente después del tratamiento.
  3. Adquirir imágenes posteriores a la lejía (pilas z de la región electroporada) durante un máximo de 30 minutos a intervalos de tiempo regulares (3 o 5 min) utilizando el microscopio confocal.
    NOTA: Si está disponible, utilice una línea transgénica H2B-XFP como un control positivo para garantizar la supervivencia celular en la región fotoblanqueada. La tasa de recuperación de fluorescencia para el FP codificado por el ARNm electroportado debe disminuir, pero que para el FP codificado a través del transgén debe permanecer constante a lo largo de toda la película.
  4. Para garantizar que las condiciones de diagnóstico por imágenes no afecten el uso nocivo de la supervivencia de los embriones, incubar simultáneamente embriones electroporados que no estén fotoblanqueados, lo que puede servir como control para la toma de imágenes.
  5. Para cuantificar los resultados del fotoblanqueo para la descomposición del ARNm después de la electroporación, realice un seguimiento de la fluorescencia celular a lo largo del tiempo (3 o 5 min) midiendo la intensidad de fluorescencia del centro (un círculo de 7,5 m) de cada célula utilizando ImageJ. Mida esto para todas las células dentro de la región fotoblanqueada que no están sufran mitosis y han sido completamente fotoblanqueadas.
    NOTA: Considere la posibilidad de omitir las células mitóticas de la cuantificación, ya que los núcleos mitóticos tienen fluorescencia más fuerte que los núcleos interfases debido a la condensación de cromatina.
  6. Trazar la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo después de la lejía en una variedad de puntos de tiempo (45 min, 2 h, y 5 h).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La electroporación de ARNm es más eficiente que la electroporación de ADN

Usamos pCS2+. H2B-Citrine para preparar mRNA transcrito in vitro. Dado que la electroporación de ADN se realiza generalmente a 1-2 g/L, utilizamos una concentración equimolar de ARNm (calculada en torno a 0,25-0,5 g/L para H2B-Citrine) para la electroporación de ARNm. Primero probamos la eficiencia de electroporación de pCS2+. ADN H2B-Citr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo microinyectar y electroporar con precisión el ARNm en las células de los embriones de codorniz gastrulantes. Demostramos que la electroporación de ARNm sintetizada in vitro permite la expresión rápida y eficiente de proteínas fluorescentes (FP) en embriones de codorniz gastrulantes (Figura2 y 3). La fluorescencia de la proteína H2B-citrine traducida a partir de ARNm electroportados podría detectarse media...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a David Huss por sus útiles ideas sobre este trabajo. Este trabajo fue apoyado en parte por la Beca de Investigación de Verano de la Fundación Rose Hills (2016-2018) y la Beca de Investigación de Grado de USC Provost a M.T., el Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award to M.D., y la University of M.D., y la University of M.D., y la University of M.D., Premio al Programa de Asociados de Investigación de Grado del Sur de California a R.L.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFNew England BiolabsR3136L
BglIINew England BiolabsR0144S
BsrG1-HFNew England BiolabsR3575S
NotI-HFNew England BiolabsR3189L
SalI-HFNew England BiolabsR3138L
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílicoThermo Fisher
SP6 mMessage Machine kit de transcripción in vitroThermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol, t-octilfenoxipolietoxietanol, Éter de polietilenglicol tert-octilfenilo
DAPISigma AldrichD95422-(4-Amidinofenil)-6-indolcarbamidina diclorhidrato, 4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato, DAPI diclorhidrato Whatman
No.1 papel de filtroSigma AldrichWHA1001125
glicerolSigmaAldrich G9012
UreaSigma Aldrich51457
pmTurquoise2-GolgiAddgene36205pmTurquoise2-Golgi fue un regalo de Dorus Gadella (Plásmido Addgene # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methods 2008;5:605-7. ID de PubMed:
18536722 pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneEste documento
pCS.H2B-citrinoAddgene53752pCS-H2B-citrino fue un regalo de Sean Megason (Plásmido Addgene # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry fue un regalo de Sean Megason (Plásmido Addgene # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; Microscopio invertido RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780Carl Zeiss Microscopy GmbHEl LSM-780 es un microscopio confocal y multifotónico que ofrece la sensibilidad necesaria para el trabajo de imagen vital. Equipado con una platina motorizada, un dispositivo de enfoque automático y una incubadora oscurecida de etapa completa, el 780 es un microscopio excelente para la obtención de imágenes de células vivas/embriones de alta gama. El detector Quasar de 32 canales de alta sensibilidad permite la obtención de imágenes espectrales, la no mezcla lineal y la adquisición de imágenes de alto recuento de colores (>4). La excitación se puede realizar con láseres de fotón único de 6 líneas (405, 458, 488, 514, 564 y 633 nm), láser de 2 fotones Chameleon (Coherent) (rango de 690 nm a 1000 nm) y se puede ejecutar con el software del sistema ZEN 2011 SP7 (Black).
CUY-21 EDIT electroporador in vivoBex Co., Ltd.
Electrodo cuadrado plano de platino, longitud lateral 5 mmBex Co., Ltd.
Microscopio estereoscópico Olympus MVX10 FL Cámara monocromáticaOlympus LifeScience
XM10 OlympusLifeScience
con fosfato (PBS) para HCR (10 veces, pH 7,4) Para preparar 1 L de una solución madre de 10 veces, combine 80 g de NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g de KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g de Na2HPO4 (anhidro; Sigma-Aldrich S3264), y 2,7 g de KH2PO4 (anhidro; Sigma-Aldrich P9791). Ajuste el pH a 7,4 con HCl y lleve el volumen final a 1 L con H2O ultrapuro. Evite el uso de CaCl2 y MgCl2 en PBS para HCR. Es importante que el PBS para HCR se prepare como una solución libre de RNasa (por ejemplo, mediante tratamiento con dietilpirocarbonato [DEPC]).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/TritonAgregue 1 mL de Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) y 100 mL de 10× PBS a 890 mL de H2O destilado ultrapuro. Filtre la solución a través de un 0.2 μ m filtrar y almacenarlo a 4 ? C hasta su uso.
1 & veces; solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tratada con DEPC; pH 7.4)
0.1% Triton X-100
15593031LF701P5E

References

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