Este artículo proporciona métodos detallados para fabricar y caracterizar un dispositivo microfluídico de accionamiento neumático para la compresión de condrocitos.
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Artículo de método
Una plataforma microfluídica para estimular los condrocitos con compresión dinámica
En este artículo
Resumen
Resumen
Se sabe que los estímulos mecánicos modulan las funciones biológicas de las células y los tejidos. Estudios recientes han sugerido que el estrés compresivo altera la arquitectura del cartílago de la placa de crecimiento y resulta en la modulación del crecimiento de los huesos largos de los niños. Para determinar el papel de la tensión compresiva en el crecimiento óseo, creamos un dispositivo microfluídico accionado por presión neumática, para comprimir dinámicamente (o estáticamente) los condrocitos de la placa de crecimiento incrustados en cilindros de hidrogel de alginato. En este artículo, describimos métodos detallados para fabricar y caracterizar este dispositivo. Las ventajas de nuestro protocolo son: 1) Se pueden generar cinco magnitudes diferentes de tensión compresiva en cinco réplicas técnicas en una sola plataforma, 2) Es fácil visualizar la morfología celular a través de un microscopio de luz convencional, 3) Las células pueden aislarse rápidamente desde el dispositivo después de la compresión para facilitar los ensayos aguas abajo, y 4) La plataforma se puede aplicar para estudiar la mecanobiología de cualquier tipo de célula que pueda crecer en hidrogeles.
Introducción
Las plataformas micro-ingeniería son herramientas valiosas para estudiar la biología molecular, celular y de nivel tisular porque permiten el control dinámico de los microambientes físicos y químicos1,2,3 ,4,5,6,7,8. Por lo tanto, múltiples hipótesis se pueden probar simultáneamente de una manera estrechamente controlada. En el caso del cartílago de la placa de crecimiento, hay crecientes evidencias de ....
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Protocolo
NOTA: Use equipo de protección personal (EPP) como guantes y capa de laboratorio para cada paso de este protocolo.
1. Fabricación de moldes maestros
NOTA: Realice los pasos 1.1 - 1.3 en una campana de humo.
- Tratamiento de vidrio
NOTA: Use un protector facial, guantes y una capa de laboratorio para el paso 1.1.- Hacer la solución de Piranha (60 mL) mezclando ácido sulfúrico (H2SO4) y peróxido de hidrógeno (H2O2) con una relación de volumen de 3:1.
ADVERTENCIA: No utilice la solución y la acetona de Piranha en la misma campana de humodebido al riesg....
- Hacer la solución de Piranha (60 mL) mezclando ácido sulfúrico (H2SO4) y peróxido de hidrógeno (H2O2) con una relación de volumen de 3:1.
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Resultados
Este artículo muestra los pasos detallados de la fabricación del dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos (Figura 2). El dispositivo contiene 5 matrices x 5 de construcciones cilíndricas de alginato-condrocitos, y estas construcciones se pueden comprimir con cinco magnitudes diferentes de compresión(Figura 1, Figura 3 y Figura 4). La altura del microcanal neumático es de alrededor de 90 m.......
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Discusión
Para probar los efectos de la tensión compresiva en los condrocitos de la placa de crecimiento, desarrollamos el dispositivo de compresión de condrocitos microfluídicos(Figura 1) para aplicar varios niveles de tensión compresiva a los condrocitos en el andamio de hidrogel de alginato para 3D cultura de alto rendimiento. Para ayudar a otros investigadores a adoptar nuestro dispositivo o desarrollar dispositivos similares, proporcionamos detalles de los pasos de fabricación del dispositivo en .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los doctores Christopher Moraes y Stephen A. Morin su apoyo para el diseño y la fabricación de dispositivos. Este estudio fue apoyado por la beca Bioingeniería para la Salud Humana de la Universidad de Nebraska-Lincoln (UNL) y el Centro Médico de la Universidad de Nebraska (UNMC), y la subvención AR070242 del NIH/NIAMS. Agradecemos a Janice A. Taylor y James R. Talaska de la Instalación Central de Microscopía Avanzada en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska por proporcionar asistencia con microscopía confocal.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (3-aminopropil)trietoxisilano (ATPES) | Sigma-Aldrich | 741442-100ML | |
| (Tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahidrooctilo)-1-triclorosilano | United Chemical Technologies | T2492-KG | |
| Lámina acrílica | McMaster-Carr | 8560K354 | |
| Bomba de aire | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | Utilizamos el modelo comprado en 2015. El diseño interno y el rendimiento de la bomba de aire (SP 500 EC-LC) cambiaron a principios de 2016. Además, el rendimiento de la bomba de aire ha cambiado con el paso del tiempo. Por lo tanto, la presión de aire generada por una bomba de aire SP 500 EC-LC debe calibrarse antes de su uso. |
| Polvo de alginato | FMC Corporation | Pronova UP MVG | |
| Conectores rectos de lengüeta (tubo de metal) | Pneumadyne | EB40-250 | |
| Calcein AM | Invitrogen | C3100MP | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Partículas fluorescentes acuosas teñidas de rojo | Thermo Fisher Scientific | R0100 | |
| EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) | Thermo Fisher Scientific | 22980 | |
| Almohadilla de espuma | GRAINGER | Artículo # 5GCE8 | |
| Función / Generador de forma de onda arbitraria | Keysight Technologies | 33210A | |
| Ácido clorhídrico | Fisher Chemical | A144-500 | |
| Peróxido de hidrógeno | Fisher Biorreactivos | BP2633500 | |
| Alcohol isopropílico | BDH1174-4LP | VWR | |
| Portaobjetos de microscopio | Thermo Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Limpiador de plasma | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Polidimetilsiloxano (PDMS) | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5 KG | |
| Fuente de alimentación | Keysight Technologies | E3630A | |
| SeaKem LE Agarosa | Lonza | 50004 | |
| Hidróxido de sodio | Fisher Chemical | S318-1 | |
| Colector de solenoide | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Válvula de solenoide | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Barnizadora de centrifugación | Laurell Technologies | WS-650Mz-23NPPB | |
| SU8 Revelador | MicroChem Corp. | Y020100 4000L1PE | |
| SU8-100 | MicroChem Corp. | Y131273 0500L1GL | |
| SU8-5 | MicroChem Corp. | Y131252 0500L1GL | |
| Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) | Thermo Fisher Scientific | 24510 | |
| Ácido sulfúrico | EMD Millipore | MSX12445 |
Referencias
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).
- Malek, A. M., Izumo, S. Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskelet....
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Reimpresiones y permisos
