Summary
Hier presenteren we protocollen voor de bereiding van acute hersen schijfjes met de laterale geniculate Nucleus en het elektrofysiologisch onderzoek van retinogeniculate en corticogeniculate synapsen functie. Dit protocol biedt een efficiënte manier om te bestuderen van de synapsen met de hoge-release en lage-release kans in dezelfde acute hersenen segmenten.
Abstract
De laterale geniculate Nucleus is het eerste relaisstation voor de visuele informatie. Relais neuronen van deze thalame Nucleus integreren input van retinale ganglioncellen en projecteren deze op de visuele cortex. Bovendien ontvangen Relais neuronen top-down excitatie van de cortex. De twee belangrijkste excitatory ingangen naar de relay neuronen verschillen in verschillende aspecten. Elk relais neuron ontvangt input van slechts een paar retinogeniculate synapsen, die grote terminals met veel release sites. Dit wordt weerspiegeld door de relatief sterke excitatie, de Relais neuronen ontvangen, van retinale ganglioncellen. Corticogeniculate synapsen, in tegenstelling, zijn eenvoudiger met weinig release sites en zwakkere synaptische sterkte. De twee synapsen verschillen ook in hun synaptische korte-termijn plasticiteit. Retinogeniculate synapsen hebben een hoge afgifte waarschijnlijkheid en vertonen bijgevolg een kortdurende depressie. In tegenstelling tot, corticogeniculate synapsen hebben een lage afgifte kans. Corticogeniculate vezels passeren de reculaire thalamische kernen voordat ze de laterale geniculate Nucleus binnengaan. De verschillende locaties van de reculaire thalamische kern (rostrally van de laterale geniculate Nucleus) en het optische kanaal (ventro-lateraal van de laterale geniculate Nucleus) maken het stimuleren van corticogeniculate of retinogeniculeren synapsen afzonderlijk mogelijk met extracellulaire stimulatie elektroden. Dit maakt de laterale geniculate Nucleus een ideaal hersengebied waar twee excitatory synapsen met zeer verschillende eigenschappen die zich op hetzelfde celtype bevinden, gelijktijdig kunnen worden bestudeerd. Hier beschrijven we een methode om de opname van Relais neuronen te onderzoeken en om gedetailleerde analyses uit te voeren van het retinogeniculate en het corticogeniculate SYNAPS functie in acute hersen sneden. Het artikel bevat een stap-voor-stap protocol voor het genereren van acute hersen sneden van de laterale geniculate Nucleus en stappen voor het opnemen van activiteit van Relais neuronen door het optisch tractus en corticogeniculate vezels afzonderlijk te stimuleren.
Introduction
Relais neuronen van de laterale geniculate Nucleus integreren en sturen visuele informatie naar de visuele cortex. Deze neuronen ontvangen excitatory input van ganglioncellen via retinogeniculate synapsen, die zorgen voor de belangrijkste excitatory drive voor relay neuronen. Bovendien ontvangen Relais neuronen excitatory ingangen van corticale neuronen via corticogeniculate synapsen. Bovendien ontvangen Relais neuronen remmende ingangen van lokale interneuronen en GABAergic neuronen van de Nucleus reticularis thalami1. De Nucleus reticularis thalami is aanwezig als een schild tussen de thalamus en de cortex zodanig dat vezels projecteren van cortex naar thalamus en in de tegenovergestelde richting moet gaan door de Nucleus reticularis thalami2.
Retinogeniculate ingangen en corticogeniculate ingangen vertonen verschillende synaptische eigenschappen3,4,5,6,7,8. Retinogeniculate ingangen vormen grote terminals met meerdere release sites9,10. In tegenstelling, weergeven corticogeniculate ingangen kleine terminals met single release sites7. Bovendien, retinogeniculate synapsen effectief stimuleren actie potentialen van Relais neuronen ondanks het vormen slechts 5 − 10% van alle synapsen op Relais neuronen3,8,11. Het corticogeniculate synapsen dient daarentegen als modulator van retinogeniculate transmissies door het membraanpotentiaal van Relais neuronen12,13te beheersen.
Deze twee belangrijkste excitatory ingangen voor relay neuronen zijn ook functioneel verschillend. Een belangrijke verschil is de kortdurende depressie van retinogeniculate synapsen en de korte termijn vergemakkelijking van corticogeniculate synapsen3,5,8. Korte-termijn plasticiteit verwijst naar een fenomeen waarin de synaptische sterkte verandert wanneer de synaps herhaaldelijk actief is binnen een tijdsperiode van enkele milliseconden tot enkele seconden. Synaptic release waarschijnlijkheid is een belangrijke factor onderliggende plasticiteit op korte termijn. Synapsen, met een lage kans op initiële vrijgave, weergave van de korte termijn als gevolg van de opbouw van CA2 + in de presynapse en bijgevolg een toename van de kans op vrijgave wordt waargenomen bij herhaalde activiteit. In tegenstelling, synapsen met hoge release kans meestal weergegeven op korte termijn depressie als gevolg van de uitputting van Ready-releasable blaasjes14. Bovendien, desensibilisatie van postsynaptische receptoren draagt bij aan de korte-termijn plasticiteit in sommige hoge-release waarschijnlijkheid synapsen8,15. Hoge afgifte waarschijnlijkheid en desensibilisatie van α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptoren dragen bij aan de prominente kortdurende depressie van retinogeniculate synapsen. Daarentegen is de waarschijnlijkheid van lage afgifte ten grondslag aan de korte termijn versoepeling van de synapsen van het corticogeniculate.
Bij muizen komt het optische kanaal in de dorsale laterale geniculate Nucleus (dLGN) van de caudolaterale plaats, terwijl corticogeniculate vezels de dLGN rostroventraal binnenkomen. De afstand tussen de twee ingangen maakt het mogelijk voor het onderzoek van de individuele eigenschappen van twee zeer verschillende excitatory ingangen die op dezelfde cel. Hier bouwen we voort op en verbeteren we een eerder beschreven dissectie methode waarbij retinogeniculate en corticogeniculate vezels in acute hersen plakjes3bewaard blijven. We beschrijven dan het elektrofysiologisch onderzoek van Relais neuronen en stimulatie van retinogeniculate en corticogeniculate vezels met extracellulaire stimulatie elektroden. Tot slot bieden we een protocol voor het vullen van Relais neuronen met biocytine en daaropvolgende anatomische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door het regerings toezichthoudend panel voor dierproeven van Rijnland-Palts.
1. oplossingen
- Oplossing voor dissectie
- Om excitotoxicity te verminderen, bereiden van een oplossing op basis van choline te worden gebruikt tijdens de dissectie zoals hier gepresenteerd (in mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 choline chloride, 25 NaHCO3, 1,25 Nah2po4, 0,5 CACL2, 7 MgCl2, en 25 glucose. Bereid de oplossing voor dissectie minder dan 1 week voor het experiment.
- Opname oplossing
- Bereid een kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (ACSF) oplossing met (in mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1,25 Nah2PO4, 2,5 KCl, 2 CACL2, 1 MgCl2, en 25 glucose. Voeg 50 μM D-APV en 10 μM SR 95531 hydrobromide toe om N-methyl-D-aspartaat (NMDA) en GABAA -receptoren te blokkeren.
- Intracellulaire oplossing
- Bereid een intracellulaire oplossing met (in mM): 35 CS-gluconaat, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA, en 0,1 D-600 (methoxyverapamil hydrochloride). Stel de pH in op 7,3 met CsOH. Filter, aliquot, en bewaar de stamoplossing bij-20 °C tot het gebruik.
2. dissectie
- Bereid twee segment kamers voor, waarvan één gevuld is met 100 mL van de dissectie oplossing en de andere met 100 mL opname oplossing. Plaats de twee bekers in een waterbad (37 °c) en bel de oplossingen met Manager gedurende ten minste 15 minuten voor de dissectie.
- Vul een plastic beker met 250 mL van de nabije ijskoude (maar niet bevroren) dissectie oplossing. Bel met Manager ten minste 15 minuten voor gebruik.
- Vul een plastic Petri schaal (100 mm x 20 mm), waarin de hersen sectie wordt uitgevoerd, met de koude dissectie oplossing. Plaats een stukje filtreerpapier in de deksel van de Petri schaal.
- Koel de dissectie kamer van de vibratome af.
- Anesthetiseer een muis met 2,5% isoflurane, bijvoorbeeld in de muis kooi. Zodra de muis reageert niet op een staart knijpen, onthooi de muis in de buurt van de cervicale Medulla en dompel het hoofd in de ijskoude dissectie oplossing in de basis van de Petri schaal.
- Snijd de huid van het hoofd van caudal naar nasaal en houd het lateraal met de vingers om de schedel bloot te leggen. Om de voor hersenen uit te nemen, snijd eerst de schedel samen met de posterieure-anterieure middenlijn en snijd vervolgens twee keer door de coronale hechting en lambdoïde hechtdraad (Figuur 1a).
- Verwijder de schedel tussen de coronale hechting en lambdoïde hecht zodanig dat de hersenen wordt blootgesteld. Snijd de olfactorische bol en scheid de voor hersenen van de middenhersenen met een fijn mes (Figuur 1b). Verwijder de hersenen van de schedel met een dunne spatel en plaats deze op het filtreerpapier in de deksel van de Petri schaal.
Opmerking: de stappen 2,6 en 2,7 moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd om de celdood te verminderen. - Om de integriteit van de sensorische en corticale ingangen van de dLGN in het hersen segment te behouden, scheidt u de twee hemisferen met een parasagitale snede met een hoek van 3 − 5 ° (figuur 1c,D). Droog de Mediolaterale vlakken van de twee hersenhelften door ze op het filtreerpapier te plaatsen en lijm ze vervolgens op de snij fase met een hoek van 10 − 25 ° van het horizontale vlak (Figuur 1e).
- Plaats het podium in het midden van de metalen buffer lade en giet de rest van de ijskoude dissectie oplossing voorzichtig in de buffer lade. Voer deze stap zorgvuldig uit omdat een sterke giet de geplakte hersenen kan verwijderen (Figuur 1f).
- Plaats de buffer lade in de ijskoude lade, die helpt bij het handhaven van de lage temperatuur tijdens het dissectie. Snijd 250 μm schijfjes met een scheermesje met een snelheid van 0,1 mm/s en een amplitude van 1 mm.
- Houd de plakjes in de vasthoud kamer gevuld met zuurstofrijk dissectie oplossing bij 34 °c gedurende ongeveer 30 minuten en laat vervolgens de plakjes herstellen in de opname oplossing bij 34 °c voor nog eens 30 minuten.
- Na het herstel, verwijder de plak kamer uit het waterbad en bewaar de schijfjes op kamertemperatuur (RT) totdat het in experimenten wordt gebruikt.
3. elektrofysiologie
- Trek pipetten met behulp van borosilicaatglas capillairen en een filament puller. Houd de weerstand van de opname pipetten bij 3 − 4 MΩ bij. Trek stimulerende pipetten aan met hetzelfde protocol, maar breek de punt iets na het trekken om de diameter te vergroten. Vul de opname pipetten met de intracellulaire oplossing en biocytine, en vul stimulerende pipetten met de opname oplossing.
- Plaats de plakjes in de opname kamer en parfumeer de plakjes continu met een zuurstofopname oplossing bij RT. Controleer alle segmenten en selecteer degene die een intact optisch kanaal weergeven.
- Visualiseer het segment en de cellen met een rechtopstaande Microscoop die is uitgerust met een infrarood differentieel interferentie contrast (IR-DIC) video microscopie.
Opmerking: Relais neuronen onderscheiden zich van de onderlinge neuronen door hun grotere Soma-grootte en meer primaire dendrites (takken die uit het SOMA komen). Interneuronen tonen bipolaire morfologie met een kleiner Soma. - Plaats de stimulerende pipet op het segment voordat u de cel patchen met de opname pipet. Om retinogeniculate synapsen te onderzoeken, plaatst u de stimulerende pipet direct op het optische kanaal, waar de axon-vezels van retinale ganglioncellen worden gebundeld (Figuur 2a). Voor het analyseren van corticogeniculate synapsen, plaats de stimulerende elektrode op de Nucleus reticularis thalami, die is rostroventrally grenzend aan de dLGN (Figuur 2b).
- Zodra de opname pipet in de opname oplossing is ondergedompeld, moet u een 5 mV-spannings stap toepassen om de pipet weerstand te bewaken. Stel het vasthoud potentieel in op 0 mV en Annuleer de offset potentiaal zodat de houd stroom 0 pA is.
- Benader de cel met de opname pipet terwijl u positieve druk toepast. Wanneer de pipet in direct contact is met het celmembraan, laat u de positieve druk los en stelt u de vasthoud potentiaal in op-70 mV. Breng een lichte negatieve druk aan om de celmembraan aan de glazen pipet toe te voegen, zodat een dichting van gigaohm (weerstand > 1 GΩ) ontstaat. De pipet capaciteit compenseren en de cel openen door toepassing van negatieve drukpulsen.
- Om de synaptische functie te onderzoeken, 0,1 MS stroom pulsen (ca. 30 μA) toepassen via de stimulatie pipet. Als er geen synaptische responsen worden waargenomen, moeten de stimulerende pipetten mogelijk worden vervangen. Wees voorzichtig tijdens het plaatsen van de stimulerende pipetten op een andere positie, zodat de opgenomen cel niet verloren gaat.
Opmerking: in het voorbeeld opnames getoond in Figuur 2, synaptische korte-termijn plasticiteit werd onderzocht door het stimuleren van het optische tractus of corticogeniculate vezels tweemaal met 30 MS Inter-stimulus intervallen. De gepaarde pulsratio (PPR) werd berekend door de amplitude van de tweede excitatory postsynaptisch Current (EPSC) te delen door die van de eerste EPSC (EPSC2/EPSC1). Elk stimulatie protocol werd 20 keer herhaald. De amplitude van de EPSC werd gemeten vanaf de gemiddelde stromingen van de 20 sweeps. Het tijdsinterval tussen elke herhaling was ten minste 5 s om te voorkomen dat op korte termijn plasticiteit geïnduceerd door de herhalingen. - Bewaak de serieweerstand continu door een 5-mV spannings stap toe te passen. Gebruik alleen de cellen met de serieweerstand kleiner dan 20 MΩ voor analyse.
4. biocytine labeling
- Houd de configuratie van de hele cel gedurende ten minste 5 min om de diffusie van biocytine in de distale dendrites mogelijk te maken.
- Verwijder na het opnemen de pipet voorzichtig uit de cel zodat de Soma niet wordt vernietigd.
Opmerking: als er meer dan één cel op één segment is vastgelegd, moeten hun soma's voldoende weg zijn van hun naburige cellen. Zorg ervoor dat de dendrites uit verschillende cellen niet interfereren met elkaar tijdens de beeldvorming. - Bereid een 24-Well celkweek plaat voor. Vul elk goed met 300 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA). Wees voorzichtig om niets te besmetten met PFA dat in contact zal komen met de segmenten die moeten worden opgenomen.
- Breng de segmenten van de opname kamer over naar de PFA-bevattende plaat met een rubberen pipet en bevestig de sneetjes 's nachts. Zorg ervoor dat de pipet altijd wordt verhinderd door PFA-besmetting.
Let op: Draag altijd handschoenen en gebruik een chemische kap bij het manipuleren van PFA. - Na het fixeren van sneetjes in PFA, vervangt u PFA door fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaar de segmenten in PBS bij 4 °C voor toekomstige verwerking (minder dan 2 weken).
- Was de plakjes met verse PBS 3 keer (10 min elke wasbeurt).
- Blokkeer niet-specifieke binding sites door de segmenten in de blokkerende oplossing (0,2% niet-ionische oppervlakte-actieve stof en 5% boviene serumalbumine in PBS) voor 2 uur op RT op een rondschudapparaat te bebroed.
- Gooi de blokkerende oplossing weg. Inbroed de plakjes met streptavidin-Alexa 568 verdund in de blokkerende oplossing (1:1000) bij 4 °C 's nachts op een rondschudapparaat.
- Gooi de antilichaam oplossing weg en spoel de schijfjes 3 keer met PBS gedurende 10 min bij RT op een rondschudapparaat. Was de schijfjes met kraanwater voor de montage.
- Plaats de segmenten van de ene muis op de andere met een glazen schuif. Zorg ervoor dat de gekleurde cellen aanwezig zijn op het bovenste oppervlak van de segmenten. Absorbeer het water rond de plakjes met weefsels en laat de schijfjes ongeveer 15 minuten drogen.
- Breng twee druppels afdekmedium aan op elk segment. Monteer een dekglaasje op de glijbaan zonder luchtbellen te produceren.
- Bewaar de gelabelde segmenten na visualisatie met een confocale Microscoop op 4 °C.
5. cellulaire beeldvorming en wederopbouw
- Scan segmenten met een confocale Microscoop en gebruik de bijbehorende software voor analyse.
- De fluorescentie bij 561 nm prikkelen.
- Het beeld van de segmenten met 0,7 numerieke diafragma (NA), olie-onderdompeling doel.
- Pas de beoogde cel in het midden van de weergave aan en pas een vergroting van 2,5 keer toe.
- De Z-stack gegevenssets om te scannen van de hele neuron met de volgende parameters renderen: Format = 2.550 x 2.550 pixels, scanfrequentie = 400 Hz, Z-nummer = 40. voxel grootte was rond 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 μm3.
- Semi-automatisch traceren van de neuronen met behulp van een neuronale reconstructie software (bijvoorbeeld, NeuronStudio). Een voorbeeld van een 3D-getraceerd Relais neuron wordt weergegeven in Figuur 3b.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De segment voorbereiding van dLGN met de retinogeniculate en de corticogeniculate trajecten wordt getoond onder een 4x doelstelling (Figuur 2). Axonen van retinale ganglioncellen bundelen elkaar in het optische kanaal (Figuur 2). De stimulerende pipet werd geplaatst op het optische kanaal voor het opwekken van retinogeniculate Synapse-gemedieerde stroom (Figuur 2a) en op Nucleus reticularis thalami voor het induceren van corticogeniculate synapses-gemedieerde stroom (Figuur 2b), respectievelijk. Van noot, axonen van corticale neuronen naar LGN neuronen projecten van de cortex naar de thalamus Traverse de Nucleus reticularis thalami. Synapsen van corticogenicluaat kunnen daarom worden geactiveerd door stimulatie in de Nucleus reticularis thalami.
De gepaarde pulsratio van AMPA receptor-gemedieerde EPSCs is lager dan 1 bij het stimuleren van het optische kanaal met 30 MS Inter-stimulus interval, maar boven 1 bij het stimuleren van corticogeniculate vezels met hetzelfde Inter-stimulus interval (figuur 2c,D) . De gepaard-Pulse depressie van retinogeniculate synapsen is te wijten aan een hoge blaasje release waarschijnlijkheid en desensibilisatie van postsynaptische AMPA receptoren. De gepaarde pulsversoepeling van de synapsen van het corticogeniculate is consistent met een lage kans op vrijgave van de blaasje16.
Afbeelding 3a toont het IR-dic beeld dat het SOMA van een DLGN relay neuron weergeeft, samen met de tip van de patch pipet. Biocytinkleuring stelt ons in staat om een beeld te krijgen van het opgenomen neuron. Verschillend van interneuronen, die bipolaire morfologie hebben, hebben Relais neuronen multipolaire dendritische Arbors (Figuur 3b) die meer dan 3 primaire dendrites8,17bevatten. Vervolgens werd een driedimensionale (3D) reconstructie van een biocytine-gelabeld Relais neuron gegenereerd waaruit een radiaal symmetrische dendritische architectuur (figuur 3c) blijkt.
Figuur 1 : Schema's die het dissectie-protocol vertegenwoordigen. A) horizontale weergave van de schedel van de muis, die de positie van de initiële sneden weergeeft. De eerste snede werd uitgevoerd samen met de sagittale hecht, gevolgd door nog twee sneden samen met de coronale hechting en lambdoïde hechtdraad. Onderbroken lijnen vertegenwoordigen de incisies. (B) Sagittaal beeld van de hele hersenen. Onderbroken lijnen geven aan dat de hersenen geïsoleerd is van de olfactorische gloeilamp en de middenhersenen. (C-D) Deze panelen tonen de eerste snijhoek om de twee hemisferen te scheiden van respectievelijk horizontaal (C) en coronale (D) View. E) coronale weergave van een halve bol op de snij fase. Onderbroken lijnen geven de snijden richting aan. l, m, d en v vertegenwoordigen respectievelijk de laterale, mediale, dorsale en ventrale aspecten voor de halfrond in deelvensters D en E. (F) diagram van de dissectie kamer met twee hemisferen op de snij fase. De gestippeld pijl geeft de bewegende richting van het snijblad aan. a, p en d representeren respectievelijk de voorste, achterste en dorsale aspecten van de linker hemisfeer. G) regeling die een goed gesneden segment vertegenwoordigt met een relatief groot deel van de DLGN en intact behoud van het optische kanaal. dLGN, Dorsale laterale geniculate Nucleus; vLGN, ventrale laterale kern; OT, olfactorische gloeilamp; NRT, Nucleus reticularis thalami. De deelvensters C, D en G zijn aangepast uit Figuur 1 van Turner en Salt3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Segment voorbereiding van dLGN met de retinogeniculate en de corticogeniculate trajecten en voorbeelden van opnames. (a-B) Deze panelen tonen een dLGN Slice met behoud van retinogeniculate en corticogeniculate ingangen. De stimulatie elektrode werd op het optische kanaal geplaatst om retinogeniculate synapsen (A) en op de Nucleus reticularis thalami te activeren om corticogeniculate synapsen te activeren (B). (C) AMPA receptor-gemedieerde epscs in reactie op stimulatie van het optische kanaal tweemaal met 30 MS Inter-stimulus interval. D) corticogeniculeren Synapse-gemedieerde stromen met 30 MS interstimulus-interval. De stimulatie artefacten werden voor de duidelijkheid verwijderd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Morfologische analyse van een relais neuron. A) IR-dic beeld dat het SOMA van een DLGN relay neuron weergeeft met de punt van de patch pipet. B) confocale afbeelding van een relais neuron gelabeld met biocytine en gevisualiseerd met streptavidin-Alexa 568. C) driedimensionale (3D) reconstructie van hetzelfde neuron, met een radiaal symmetrische dendritische architectuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een verbeterd protocol op basis van een eerder gepubliceerde methode3, die het mogelijk maakt voor het onderzoek naar de hoge waarschijnlijkheid van het vrijgeven van retinogeniculate synapsen en een lage waarschijnlijkheid van het vrijkomen van corticogeniculate synapsen uit hetzelfde segment. Dit is van groot belang, omdat deze twee ingangen met elkaar omgaan om de visuele signaaloverdracht te moduleren: retinogeniculate-ingangen zijn de belangrijkste excitatory-aandrijving van Relais neuronen, terwijl de corticothalame-ingangen fungeren als een modulator, die beïnvloedt de versterking van de retinogeniculate transmissie door het beïnvloeden van de toestand van Relais neuronen. Zoals verwacht, we waargenomen dat retinogeniculate en corticogeniculate synapsen vertonen verschillende korte-termijn plasticiteit als gevolg van het verschil in hun vrijlating waarschijnlijkheden. Bovendien, AMPA receptor desensibilisatie draagt ook bij aan de sterke depressie in de retinogeniculate synapsen9,15,16. We hebben onlangs aangetoond dat korte-termijn depressie wordt gemoduleerd doorCKAMP44 16, een AMPA receptor hulp eiwit van de ckamp familie die het herstel van desensibilisatie van AMPA receptoren 18,19vertraagt, 20. Bovendien, retinogeniculate Synapse-gemedieerde huidige amplitudes zijn hoger dan die van corticogeniculate Synapse-gemedieerde stromingen onder dezelfde stimulerende sterkte, consistent met de grote retinogeniculate synapsen met meerdere vrijgeven van sites, en relatief kleine corticogeniculate synapsen7,21.
Het snijden-protocol is in essentie hetzelfde als de door Turner en Salt3ontwikkelde. Sommige wijzigingen die op onze ervaring gebaseerd waren, hebben de segmentkwaliteit verbeterd. Vergelijkbaar met Hauser et al.22, we gebruikten een choline-gebaseerde in plaats van een op sacharose gebaseerde dissectie oplossing. Herstel na dissectie werd gedaan bij 34 ° c in de snij oplossing voor 30 min en vervolgens in de opname oplossing voor nog eens 30 minuten en niet op kamertemperatuur. Plakjes waren iets dunner (250 μm in plaats van 400 μm). We ontleed hersenen met behulp van een wig met een hoek van 10 − 25 °, wat de betrouwbaarheid van de snijprocedure vergemakkelijkt en verhoogt.
Opname en stimulatie voorwaarden voor het onderzoek van relay neuron Synapse functie zijn in wezen hetzelfde als eerder beschreven door Chen en Regehr8. Activering van optische kanaal vezels ontlokken meestal grote stromingen en kan in het bereik van verschillende nA zijn wanneer alle retinogeniculate synapsen op één Relais neuronen worden geactiveerd23. Om te voorkomen dat de serie weerstand fouten, vooral bij het onderzoeken van de maximale stroom door het activeren van alle retinogeniculate synapsen op één Relais neuronen, Chen en Regehr gebruikt het opnemen van lage weerstand pipetten (< 2 MΩ). Echter, om te onderzoeken synaptische korte-termijn plasticiteit, het volstaat om een of enkele retinale ganglion cel axonen activeren, die ontlokken stromen die in het bereik van 34 − 579 pA (ongepubliceerde resultaten, Chen et al.). Kleinere pipetten met een weerstand tussen 3 − 4 MΩ kunnen daarom worden gebruikt bij het onderzoeken van de functie van de retinogeniculate Synapse met behulp van zwakke stimulatie van het optische kanaal. Activering van corticogeniculate synapsen ontlokken relatief kleine stromingen16. Fouten in de serieweerstand zijn daarom een kleiner probleem bij het onderzoeken van de functie van het corticogeniculeren Synapse.
We hier tonen aan dat stimulatie van retinogeniculate en corticogeniculate synapsen kan worden gebruikt om te onderzoeken op korte termijn plasticiteit van AMPA receptor-gemedieerde stromingen. Hetzelfde protocol kan worden toegepast om NMDA receptor-gemedieerde huidige24op te nemen. In feite, een van de eerste indicaties dat AMPA receptor desensibilisatie draagt bij aan de korte-termijn plasticiteit in retinogeniculate synapsen kwam uit experimenten waarin gekoppelde-puls ratio's van AMPA receptor-gemedieerde stromingen werden vergeleken met gepaarde pulsverhoudingen van NMDA-receptor-gemedieerde stromingen. Corticogeniculate synapsen werden gestimuleerd door het positioneren van de stimulatie pipet in de Nucleus reticularis thalami omdat axonen van corticale neuronen die dLGN relay neuronen prikkelen, over deze thalamische kern reizen. Dezelfde stimulatie positie kan worden gebruikt voor het bestuderen van remmende synaptische stromingen in de dLGN zoals getoond door bijvoorbeeld Govindaiah en Cox25.
Relay neuronen Express GABAA en GabaB -receptoren. De vrijlating van GABA activeert synaptische GabaA -receptoren. GabaB -receptoren, die zijn extrasynaptisch gelokaliseerd, worden geactiveerd wanneer Nucleus reticularis thalami zijn sterk geactiveerd bijvoorbeeld tijdens burst vuren26,27,28. Overloop van Gaba, die is meestal beperkt als gevolg van Gaba opname door astrocyten, kan activeren tijdens intense Synapse activering van de extrasynaptic GabaB -receptoren27,28. We hebben niet blokkeren van GABAB -receptoren omdat stimulatie intensiteit en frequentie waren relatief laag. Echter, bij het onderzoeken van corticogeniculate Synapse functie met behulp van intensieve stimulatie protocollen kan het wenselijk zijn om toe te voegen GABAB -receptoren.
Opnames van dLGN relay neuronen kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd bij het gebruik van segmenten die ongeveer 2 mm mediaal van het laterale oppervlak van de hersenen zijn (begin met het verzamelen van ongeveer de 8th van de segmenten van 250 μm tijdens de snijprocedure). In sommige segmenten, niet beide ingangen naar een bepaald Relais neuron kan worden gedetecteerd omdat een van de twee paden worden verbroken dicht bij het Relais neuron. In dit geval is het meestal nog steeds mogelijk om retinogeniculate en corticogeniculate synapsen in hetzelfde segment te onderzoeken door verschillende Relais neuronen voor elke ingang te selecteren. Om retinogeniculate Synapse gemedieerde stroom op te nemen, zijn ventraal gelegen Relais neuronen geselecteerd, omdat de glasvezel vezels naar deze cellen waarschijnlijker worden bewaard dan in de schrapen gelegen Relais neuronen. Daarentegen zijn de ingangen van het corticogeniculate waarschijnlijker bewaard op Relais neuronen die dorsaal in de dLGN liggen.
De segmentkwaliteit bepaalt de betrouwbaarheid van de gegevens. Op basis van onze ervaring zijn de volgende parameters essentieel om een goede segmentkwaliteit te garanderen. Koeling en oxygenatie zijn belangrijke factoren tijdens de dissectie procedure. Het hoofd van de muis moet onmiddellijk na het onthoofding van de muis in koude oplossing worden gehouden. Bij het nemen van de hersenen uit de schedel, het moet worden ondergedompeld in ijskoude oplossing elke 3 aan 4 s om de celdood te verminderen. Evenzo moet de snijden procedure worden uitgevoerd bij ongeveer 4 °c. Bovendien moeten de dissectie oplossing en de opname oplossing ten minste 15 minuten vóór gebruik worden geoxydeerd om voldoende zuurstofconcentratie te behouden. Bovendien kan het blokkeren van natriumkanalen de neuron activiteit efficiënt verminderen. Daarom, een dissectie oplossing met 37,5 mmol choline werd gebruikt.
Relais neuronen vertonen laagdrempelige pieken, die worden gegenereerd door de Transient CA2 + Current29. Om spanning gated CA2 +-kanalen te blokkeren, hebben we D-600 (methoxyverapamil) toegevoegd aan de intracellulaire oplossing. D-600 mag niet worden gebruikt als het doel van de studie is het onderzoeken van lage drempel pieken in Relais neuronen. De precisie van de volledige-cel spannings klem opnames wordt beïnvloed door ruimte klem fouten. Dit technische probleem is relevanter voor ingangen die ver verwijderd zijn van de opname-elektrode (dus voor distale synapsen)30,31. Om de impact van de ruimte klem fout te minimaliseren, gebruikten we een CS+-gebaseerde in plaats van een K+-gebaseerde intracellulaire oplossing. Kanalen die K+ permeabel zijn (bijvoorbeeld lekkanalen) zijn meestal CS+ ondoorvoteerbaar32. Dus, het gebruik van een CS+-gebaseerde intracellulaire oplossing verhoogt de impedantie van de cel.
Stabiele patch klem opname is afhankelijk van de selectie van gezonde cellen. Neuronen met ronde Soma-vorm, donkere kleur of gezwollen Soma moeten worden vermeden. Bovendien worden Relais neuronen onderscheiden van de lokale interneuronen door hun grotere Soma-grootte en meer uitgebreide primaire dendritische Arbors. Daarom selecteerden we cellen met een grotere Soma-grootte (groter dan 15 μm in diameter) en niet-bipolaire morfologie. De in Figuur 3b getoonde voorbeeld cel heeft een symmetrische dendritische architectuur en kan daarom worden geclassificeerd als Relais neuron die lijkt op Y-neuronen die bijvoorbeeld in de Cat lgn17worden aangetroffen.
De serieweerstand moet zo klein mogelijk zijn en constant blijven. Bovendien, omdat de ingangen van twee richtingen in één segment worden bewaard, is het belangrijk om zich te ontdoen van de interferentie tussen de twee ingangen. Om te voorkomen dat de corticogeniculate vezels worden geactiveerd bij het opnemen van retinogeniculate Synapse-gemedieerde stromingen of omgekeerd, mag de stimulerende pipet niet in de dLGN worden geplaatst en moet de afstand tussen de stimulerende en de opname pipet zo ver Mogelijk. Bovendien vereist de lange afstand tussen stimulerende en opname pipetten een relatief intact axon conservering. Daarom moet een goede snijhoek worden geselecteerd voor de sectie. Over het algemeen kunnen slechts één of twee segmenten met behoud van twee ingangen worden verkregen van elke halfrond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de German Research Foundation (DFG) binnen het collaborative Research Center (SFB) 1134 "functionele ensembles" (J.v.E. en X.C.) en de Research Grant EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
References
- Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
- Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
- Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).
- Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat's dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
- Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
- Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
- Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
- Chen, C., Regehr, W. G.
- Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
- Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
- Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
- Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. Thalamus. , (1997).
- Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
- Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
- Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
- von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
- Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
- Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
- Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
- Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
- Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
- Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
- Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
- Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
- Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
- Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
- Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
- Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
- White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
- Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).
